乙酰輔酶A羧化酶通過參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移

耿西林，海軍，鄭偉，張煜，張智勇，杜立學(xué)

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乙酰輔酶A羧化酶通過參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移

耿西林，海軍，鄭偉，張煜，張智勇，杜立學(xué)

（陜西省人民醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710068）

［摘 要］目的 研究乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylas，ACC）在肝癌細(xì)胞侵襲與遷移過程中的調(diào)控作用與機(jī)制。方法 （1）用免疫組化方法，分析30例肝癌患者癌與癌周組織中的ACC表達(dá)，明確ACC在肝癌中表達(dá)是否發(fā)生異常改變。（2）siRNA干涉肝癌細(xì)胞中ACC表達(dá)后，用Transwell法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。（3）siRNA干涉肝癌細(xì)胞中ACC表達(dá)后，用qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子E-cadherin、ZO-1、N-cadherin與Vimentin表達(dá)。結(jié)果 （1）免疫組化結(jié)果證實(shí)，ACC在肝癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，癌組織中染色陽(yáng)性率為93.3%（28/30），癌周組織中染色陽(yáng)性率為40% （12/30）。（2）干預(yù)ACC表達(dá)后，肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力均下降。（3）干涉ACC表達(dá)后，肝癌細(xì)胞中由Snail介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被抑制，具體表現(xiàn)為：干涉ACC表達(dá)后，上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin和ZO-1表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 ACC在肝癌組織中高表達(dá)并通過參與細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。

［關(guān)鍵詞］乙酰輔酶A羧化酶；肝癌；轉(zhuǎn)移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮來源腫瘤獲得惡性遷移和侵襲能力的最主要過程，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用［1-2］。乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylate，ACC）是催化脂肪酸合成代謝第一步反應(yīng)的限速酶，催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，在甘油三酯、磷脂和膽固醇等脂類的合成中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用［3］。近年來，大量研究已證實(shí)腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂類合成活性異常增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展［4］。ACC被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞周期與凋亡調(diào)控密切相關(guān)［5］。

ACC在肝癌中的相關(guān)研究證實(shí)，ACC能促進(jìn)脂肪酸合成促進(jìn)肝癌存活［6］。此外，ACC高表達(dá)的患者具有較差的預(yù)后，提示ACC可能與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)［7］，但目前缺乏ACC在肝癌中表達(dá)及其在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用研究。本研究旨在探討ACC在肝癌中的表達(dá)及其在調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移中的作用與機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 肝癌細(xì)胞系與肝癌臨床組織標(biāo)本

1.1.1 細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721來源于中科院上海細(xì)胞所，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 肝癌患者組織標(biāo)本：共收集30例原發(fā)性肝癌患者癌與癌周組織標(biāo)本，患者均為2010年1月到2010 年12月在我院做過肝癌根治性手術(shù)切除的患者，其中男21例，女9例。所有患者臨床資料完整，病理診斷明確，患者均在事先簽署了知情同意書，術(shù)中取得組織標(biāo)本后，立即置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色：手術(shù)獲得癌與癌周組織標(biāo)本后，用福爾馬林固定24 h，石蠟包埋并進(jìn)行組織切片。切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟與梯度酒精水化、檸檬酸熱修復(fù)、過氧化氫浸泡與封閉，而后加入ACC抗體（abcam，ab63531，1/200稀釋），于4 ℃孵育過夜，PBS洗滌（3次×5 min），加入二抗（KIT-9902，福州邁新），于28 ℃孵育20 min，PBS洗滌（3次× 5 min），用加強(qiáng)型DAB顯色液（DAB-2031，福州邁新）進(jìn)行顯色，蘇木精對(duì)細(xì)胞核染色3 min，PBS洗滌（3 次×5 min）。最后，切片經(jīng)梯度酒精脫水及二甲苯透明后封片，顯微鏡下拍照并觀察結(jié)果。

1.2.2 siRNA干涉肝癌細(xì)胞中ACC表達(dá)：ACC干涉序列參考自文獻(xiàn)［8］。其中，si-1序列為：5′-gatgtgagcct gcggaata-3′，si-2序列為：5′-ccacttggctgagcgat tg-3′。干涉片段委托上海吉瑪公司合成。

以2×105個(gè)細(xì)胞/孔，將SMMC-7721細(xì)胞接種至6孔板中，置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。siRNA轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照脂質(zhì)體lip2000說明操作進(jìn)行，首先將siRNA干涉片段和脂質(zhì)體lip2000（invitrogen，11668-019）用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫靜置5 min，用移液器將稀釋好的脂質(zhì)體加入稀釋好的干涉片段中，輕柔顛倒混勻，室溫放置25 min。將100 μL的含有脂質(zhì)體與干涉片段的轉(zhuǎn)染液加入6孔板中，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)5 h后更換新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行蛋白提取與Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR：按上步所述方法對(duì)ACC表達(dá)進(jìn)行干預(yù)處理，提取細(xì)胞TotalRNA（OMEGA，R6834）并反轉(zhuǎn)錄為cDNA（TaKaRa，D2680A），RNA提取與反轉(zhuǎn)錄步驟均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。委托華大基因公司合成E-cadherin，ZO-1，N-cadherin，Vimentin及內(nèi)參基因GAPDH的引物，E-cadherin序列為：5′-CGAGAGCTACACG TTCACGGC，GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′。ZO-1序列為：5′-CACGCAGTTACGAGCAAG，TGAAGGTATCAGCGGAGG-3′。N-cadherin序列為：5′-TTTGATGGAGGTCTCCTAACACC，ACGTTTAACACGTTGGAAATGTG-3′。Vimentin序列為：5′-GCCCTAGACGAACTGGGTC，GGCTGCAACTGCCTAATGAG-3′。GAPDH序列為：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG，ACACC ATGTATTCCGGGTCAAT-3′。用△△Ct法計(jì)算各分子相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Western blotting：事先對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行ACC干涉處理48 h，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液（P0013B，碧云天）裂解并提取細(xì)胞總蛋白，BAC蛋白定量（P0009，碧云天）后加入商品化的2×loading buffer（2×/E270，上海博華）并在水中煮沸5 min，調(diào)整蛋白濃度并上樣電泳，電泳結(jié)束后將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（IPVH00010，Millipore）表面，5% BSA室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，PBS洗滌（3次×5 min），二抗（優(yōu)寧維，GA-15A）28 ℃孵育2 h，PBS洗滌（3次×5 min），最后用ECL發(fā)光系統(tǒng)（Millipore，WBKLS0500）進(jìn)行圖像采集和結(jié)果分析。

1.2.5 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)：事先對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行ACC干涉處理48 h。侵襲實(shí)驗(yàn)需提前用基質(zhì)膠包被Transwell小室（遷移實(shí)驗(yàn)不需要此步驟），向小室內(nèi)加入50 μL含BSA（10 g/L）的無血清培養(yǎng)基。將200 μL密度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞加入小室內(nèi)，小室底部加入500 μL含胎牛血清的培養(yǎng)基，最后將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24 h，侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽輕柔擦去小室膜上層細(xì)胞，酒精固定5 min，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異比較采用單因素方差分析，將P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACC在肝癌中高表達(dá)

免疫組化結(jié)果證實(shí)：ACC在28例肝癌癌組織中呈陽(yáng)性染色，陽(yáng)性率為93.3%（28/30），在12例肝癌癌周正常組織中呈陽(yáng)性染色，陽(yáng)性率為40%（12/30）。ACC在24例患者癌組織中表達(dá)高于癌周組織，在2例患者癌與癌周組織表達(dá)相當(dāng)，在4例患者癌組織中表達(dá)低于癌周組織。

上述結(jié)果證實(shí)，ACC在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)。圖1所示為ACC在肝癌患者癌及癌周組織中的免疫組化染色（染色定位于胞漿）結(jié)果。

腫瘤組織　癌周組織圖1 ACC在肝癌患者癌及癌周組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2 干涉ACC抑制肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

為研究肝癌細(xì)胞中ACC的功能，我們通過參考已有文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成了2個(gè)靶向ACC不同位置的siRNA干涉片段，并對(duì)其干涉效率進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如圖2B所示。

我們?cè)诟伟┘?xì)胞系SMMC-7721中干涉ACC表達(dá)，分別用qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin、ZO-1、N-cadherin和Vimentin表達(dá)，以研究ACC在肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的作用。結(jié)果顯示，干涉SREBP1C表達(dá)后，上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin和ZO-1在mRNA和蛋白兩個(gè)水平表達(dá)均升高，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin和Vimentin在mRNA和蛋白兩個(gè)水平表達(dá)均降低，結(jié)果見

圖2A（mRNA水平）與2B（蛋白水平）。

A：qRT-PCR檢測(cè)干涉SREBP1C后上皮間質(zhì)標(biāo)志分子的表達(dá)；B：Western blotting檢測(cè)干涉SREBP1C后上皮間質(zhì)標(biāo)志分子的水平圖2 干涉ACC對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子表達(dá)的影響

2.3 干涉ACC下調(diào)EMT關(guān)鍵調(diào)控因子Snail表達(dá)

Snail是調(diào)控EMT過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，為研究ACC是否通過上調(diào)Snail促進(jìn)肝癌EMT發(fā)生，我們?cè)诟伟┘?xì)胞系SMMC-7721中干涉ACC表達(dá)，分別用qRT-PCR 及Western blotting檢測(cè)Snail表達(dá)。結(jié)果顯示，干涉ACC表達(dá)后，Snail表達(dá)水平明顯降低，結(jié)果見圖3A（mRNA水平）和3B（蛋白水平）。

A：qRT-PCR檢測(cè)干涉ACC后Snail的表達(dá)；B：Western blotting檢測(cè)干涉ACC后Snail的表達(dá)圖3 干涉ACC對(duì)Snail表達(dá)的影響

2.4 ACC促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲

干涉肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中ACC表達(dá)，用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力。結(jié)果顯示，干涉ACC表達(dá)后，遷移和侵襲至小室膜底面的細(xì)胞數(shù)均明顯減少，結(jié)果如圖4A和4B所示。

圖4　干涉ACC對(duì)肝癌細(xì)胞遷移（A）與侵襲（B）的影響

3 討論

腫瘤發(fā)生伴有細(xì)胞代謝重編程的發(fā)生，糖酵解與脂肪酸合成活性增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞代謝兩大最重要的代謝改變［9］。大量合成的脂肪酸被用于腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)性成分的合成，如合成磷脂用于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而為細(xì)胞快速增殖提供必要的物質(zhì)原料［10］。

ACC是催化脂肪酸合成第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在脂類代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。有關(guān)ACC的以往研究主要集中于其在糖尿病與其他代謝性疾病中發(fā)揮作用。最近有研究證實(shí)，ACC在多種腫瘤中表達(dá)升高，抑制ACC能通過調(diào)控細(xì)胞周期與凋亡抑制腫瘤發(fā)生與進(jìn)展［11］，目前，ACC被認(rèn)為是腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)［11-12］。研究證實(shí)，使用ACC抑制劑TOFA，可顯著抑制肺癌與結(jié)腸癌細(xì)胞中脂肪酸合成并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［13］。

ACC在肝癌進(jìn)展中的作用仍不十分清楚，以往僅有兩項(xiàng)ACC在肝癌中的研究。第一項(xiàng)研究證實(shí)，ACC基因多態(tài)性與患者術(shù)后生存密切相關(guān)［7］，提示其在肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用。第二項(xiàng)研究證實(shí)，ACC能促進(jìn)肝癌細(xì)胞在代謝壓力下的存活［6］。然而，目前缺乏ACC在肝癌中表達(dá)及其在轉(zhuǎn)移中作用的研究。我們的研究首次在肝癌中證實(shí)：ACC在肝癌中表達(dá)上調(diào)；干涉ACC能抑制肝癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲與遷移；進(jìn)一步分子機(jī)制研究證實(shí)，ACC通過上調(diào)Snail表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞侵襲與遷移，進(jìn)而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)：ACC在肝癌中表達(dá)上調(diào)并通過促進(jìn)Snail介導(dǎo)的EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，將為以ACC為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供新的理論支撐。本研究尚存在以下不足，需在今后研究中進(jìn)一步加強(qiáng)：（1）肝癌中ACC表達(dá)與患者預(yù)后研究；（2）ACC對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究；（3）ACC介導(dǎo)的脂肪酸合成增強(qiáng)上調(diào)Snail及其下游EMT的機(jī)制研究。

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（本文編輯：魯翠濤）

［中圖分類號(hào)］R735.7

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.008

［收稿日期］2016-02-22

［第一作者簡(jiǎn)介］耿西林（1981-），男，河南蘭考人，主治醫(yī)師，碩士。

［通訊作者簡(jiǎn)介］杜立學(xué)，主任醫(yī)師，博士，E-mail：lixuedu_xa@163.com。

Acetyl-CoA carboxylase promotes metastasis of hepatocellular carcinoma cells by promoting epithelial-mesenchymal transition

GENG Xi-lin， HAI Jun， ZHENG Wei， ZHANG Yu， ZHANG Zhi-yong， DU Li-xue. Department of Hepatobiliary Surgery， Shaanxi Provincial People’s Hospital， Xi’an 710068，China

Abstractobjective To evaluate the role of Acetyl-CoA carboxylas （ACC） in regulating metastasis of hepatocellular carcinoma cells. Methods （1） Immunohistochemistry analysis was used to determine ACC expression in 30 hepatocellular carcinoma tumor tissues and paired adjacent non-tumor tissues. （2） Transwell assay was used to analyze the migration and invasion capability of HCC cells after knocking-down of ACC expression using siRNA. （3） Expressions of epithelial mesenchymal transition （EMT） markers E-cadherin， ZO-1， N-cadherin and Vimentin were detected in HCC cells by qRT-PCR and Western blotting after knocking-down of ACC expression using siRNA. Results （1） Compared with adjacent non-tumor tissues， ACC is over-expressed in hepatocellular carcinoma tumor tissues. The rate of ACC positive staining was 93.3% （28/30） in tumor tissues and 40.0% （12/30） in adjacent non-tumor tissues. （2） Knockdown of ACC suppressed the migration and invasion capability of HCC cells. （3） Knockdown of ACC repressed Snail-mediated epithelial-mesenchymal transition， as the expressions of epithelial markers of E-cadherin and ZO-1 were up-regulated and the expressions of mesenchymal markers N-cadherin and Vimentin were down-regulated in HCC cells. Conclusion ACC is over-expressed in human hepatocellular carcinoma and promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by promoting snail-mediated epithelial-mesenchymal transition.

Key wordsAcetyl-CoA carboxylase （ACC）； hepatocellular carcinoma； metastasis； epithelial-mesenchymal transition