• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    75例血友病A患者內(nèi)含子22及1基因倒位情況分析*

    2016-08-01 11:11:48黃吉娥劉詠梅曾小菁
    關(guān)鍵詞:凝血因子診斷

    黃吉娥, 張 婧, 劉詠梅, 楊 芳, 曾小菁*

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴州 貴陽(yáng) 550004)

    ?

    75例血友病A患者內(nèi)含子22及1基因倒位情況分析*

    黃吉娥1, 張婧2, 劉詠梅1, 楊芳3, 曾小菁1*

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽(yáng)550004; 2.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽(yáng)550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴州 貴陽(yáng)550004)

    [摘要]目的: 觀察血友病A(HA)患者凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1倒位情況。方法: 取75例HA患者靜脈血,采用長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增技術(shù)(LD-PCR)檢測(cè)內(nèi)含子22和內(nèi)含子1倒位情況, 觀察兩種內(nèi)含子倒位發(fā)生率,同時(shí)觀察內(nèi)含子22倒位在重型HA中的比例,比較有家族史和無(wú)家族史HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生率。結(jié)果: 檢出22號(hào)內(nèi)含子倒位患者27例,檢出率36%(27/75),全部為HA重型患者,占重型血友病A患者的57.4%(27/47);27例中有21例有家族史,有家族史患者內(nèi)含子22號(hào)倒位的發(fā)生率高于無(wú)家族史患者(P<0.05);檢出內(nèi)含子1倒位1例,占1.3%(1/75)。結(jié)論: FⅧ基因內(nèi)含子22倒位患者患重型HA的幾率較高,內(nèi)含子22倒位檢測(cè)在重型HA的基因診斷中具有重要意義。

    [關(guān)鍵詞]血友病A; 凝血因子Ⅷ; 基因倒位; 診斷

    血友病A(hemophilia A,HA)是一種由凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X 連鎖遺傳性出血疾病, 男性患病率約為1/5 000。HA患者常出現(xiàn)自發(fā)性或外傷后出血不止, 嚴(yán)重威脅著患者的生命, 給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。為阻斷致病基因傳遞,防止新的HA患兒出生, 開(kāi)展HA攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷,對(duì)于降低HA的發(fā)病率和致殘率具有重要意義。FⅧ基因內(nèi)含子22和1倒位是導(dǎo)致重型HA的重要的分子發(fā)病機(jī)制,內(nèi)含子22和1倒位分析也是目前用于HA疾病基因診斷的主要技術(shù)[2]。本研究通過(guò)長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增技術(shù)(long distance-PCR,LD-PCR)檢測(cè)HA患者內(nèi)含子22和1倒位情況,以期提高檢測(cè)預(yù)判的成功率及穩(wěn)定性,進(jìn)而成熟應(yīng)用于地區(qū)HA家系及攜帶者調(diào)查。

    1材料和方法

    1.1研究對(duì)象

    病例均選自血友病中心2012-2014年登記的HA患者75例,均為男性,年齡9個(gè)月~58歲(≤10歲者19例,11~30歲41例,>30歲患者15例);有家族史者46例,無(wú)家族史者29例;根據(jù)FⅧ活性,分為輕、中、重型,重型患者47例(FⅧ活性<1%),中間型患者24例(FⅧ活性1%~5%),輕型患者4例(FⅧ活性>5%~40%),血管性血友病因子(vWF)抗原正常,均符合張之南等[3]主編的第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》HA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2標(biāo)本采集與處理

    取靜脈血3 mL,用EDTA-Na2抗凝,充分混勻。血樣采集后1 h內(nèi)將標(biāo)本在室溫下以3 000 r/min離心5 min,取血漿層、白細(xì)胞層和紅細(xì)胞層分裝于已消毒的EP管中,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)。使用經(jīng)典的酚-氯仿法提取DNA。

    1.3內(nèi)含子22基因倒位的檢測(cè)

    以FⅧ基因DNA序列(GeneBank參考序列:CM000685.2)為模板,應(yīng)用軟件Primer 5設(shè)計(jì)引物,見(jiàn)表1。LD-PCR反應(yīng)體系為 2×GC PCR 緩沖液 I 12.5μL , dNTP(2.5μmol,dGTP/7-deaza-dGTP=3/1)4 μL,引物P、Q、B (10μmol/L) 分別1、0.5、0.5 μL,模板基因組DNA 1 μL (約100 ng) , LA-Taq酶0.25 μL, 蒸餾水補(bǔ)足至25 μL;反應(yīng)條件98 ℃預(yù)變性1 min,98 ℃變性10 s,68 ℃退火(延伸)10 min,10個(gè)循環(huán)后,98 ℃變性10 s,每一個(gè)循環(huán)的68 ℃退火(延伸)20 s,20個(gè)循環(huán)中,最后一次72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL,與1 μL 6×上樣緩沖液混勻,在0.6%瓊脂糖凝膠(含0.5 m/L溴化乙錠),1×TBE緩沖液的電泳槽中,恒壓50 V的電壓下電泳5 h,置凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

    表1 內(nèi)含子22倒位檢測(cè)所需引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

    1.4內(nèi)含子1基因倒位的檢測(cè)

    雙管多重PCR反應(yīng)包括Int1h-1和Int1h-2兩個(gè)體系,相關(guān)引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6]。內(nèi)含子1倒位反應(yīng)引物序列及片段大小見(jiàn)表2。Int1h-1反應(yīng)體系: 10×LA 緩沖液Ⅱ(含Mg2+)2.5 μL,dNTP混合液2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物9CR(10 μmol)各1 μL,模板基因組DNA 2 μL (約200 ng),LA-Taq酶0.25 μL, 蒸餾水補(bǔ)足至25 μL;Int1h-2反應(yīng)體系:10×LA緩沖液Ⅱ(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物int1h-2R(10 μmol)各1 μL ,模板基因組DNA 2 μL (約200 ng),LA-Taq酶0.25 μL,蒸餾水補(bǔ)足至25 μL;反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性10 s,61 ℃退火30 s,

    表2 內(nèi)含子1倒位檢測(cè)所需引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

    72 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán)后,最后一次72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):1.5%瓊脂糖凝膠,5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×上樣緩沖液產(chǎn)物混合上樣,DNA Marker為DL2000,在0.5×TBE電泳液中在恒壓100 V條件下電泳1 h,紫外燈下凝膠成像處理。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用χ2檢驗(yàn)確切概率法進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1FⅧ基因內(nèi)含子22倒位分析

    75例HA患者中內(nèi)含子22倒位患者27例,占36%,27例患者均為重型,占重型HA的57.4%(27/47)。FⅧ基因內(nèi)含子22倒位的LD-PCR產(chǎn)物為11 kb,電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

    注:M1及M2為 DNA Marker,N為正常對(duì)照,1、4、5、7、9、10可見(jiàn)11 kb條帶,提示存在內(nèi)含子22倒位,2、3、6、8、11及N可見(jiàn)12 kb條帶,提示為正常圖1 HA患者及正常對(duì)照標(biāo)本FⅧ基因內(nèi)含子22倒位LD-PCR電泳結(jié)果Fig.1 F VIII intron 22LD-PCR electrophoresis results for HA patients and normal controls

    2.2FⅧ基因內(nèi)含子1倒位分析

    根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度進(jìn)行判斷內(nèi)含子1的倒位情況,75例HA患者中發(fā)現(xiàn)1例內(nèi)含子1倒位,占1.3%(1/75),電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生率36%高于內(nèi)含子1倒位發(fā)生率(1.33%),兩者比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    注:M1及M2為 DNA Marker, 2為1號(hào)內(nèi)含子倒位HA患者標(biāo)本;標(biāo)本1,3為正常人圖2 HA患者及正常對(duì)照標(biāo)本FⅧ基因內(nèi)含子1倒位PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification results of FVIII intron 1 for HA patients and normal control specimens

    2.3有、無(wú)家族史HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生率

    27例檢測(cè)出內(nèi)含子22倒位的患者中21例有較明確的家族史,6例無(wú)家族史,有家族史HA患者中內(nèi)含子22倒位發(fā)生率及重型血友病患者的比例均高于無(wú)家族史患者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

    3討論

    HA是由于FⅧ基因缺陷導(dǎo)致的一種臨床上最常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病,FⅧ基因約186 kb,包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子,其中內(nèi)含子22最大,長(zhǎng)達(dá)32 kb,為最大的內(nèi)含子。導(dǎo)致HA的基因突變?cè)蚍倍?且有高度異質(zhì)性,其中重型HA 基因突變多為大的DNA片段缺失、倒位或插入等。1993年Lakich證實(shí)了40%~50%的重型HA為內(nèi)含子22 倒位所致,發(fā)生機(jī)制為FⅧ基因內(nèi)存在一個(gè)基因FⅧA ,長(zhǎng)達(dá)9.5 kb,與FⅧ基因轉(zhuǎn)錄方向相反,在FⅧ基因外上游約400 kb處有兩個(gè)與FⅧA 高度同源的核苷酸序列(具99.99 %同源性) FⅧA1,FⅧA2。FⅧA與其同源序列發(fā)生重組時(shí)就形成內(nèi)含子22倒位,使1~22號(hào)外顯子與22~26號(hào)外顯子分離,嚴(yán)重破壞了FⅧ基因的結(jié)構(gòu)。早先Lakich和Naylor等[4]多應(yīng)用Southern 印跡法檢測(cè)內(nèi)含子22倒位,操作周期長(zhǎng),過(guò)程復(fù)雜,且通常要使用同位素,而劉敬忠[5]等應(yīng)用LD-PCR可快速檢測(cè)該基因缺陷,它應(yīng)用P,Q ,B 三種引物進(jìn)行擴(kuò)增,如果確為內(nèi)含子22倒位,則患者呈11 kb一條帶,攜帶者為11 kb,12 kb兩條帶,正常者為12 kb一條帶,該法檢測(cè)準(zhǔn)確,且效率高。由于貴州省血友病家系對(duì)本病的認(rèn)識(shí)普遍不高,故未能取得家系疑似攜帶者的標(biāo)本,故本文僅就75例已經(jīng)證實(shí)的HA患者進(jìn)行內(nèi)含子22倒位的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示其中27例為內(nèi)含子22倒位,占36% ,且均為重型血友病(FⅧ活性﹤1%),與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致〔6]。27例檢測(cè)出內(nèi)含子22倒位的患者中有21例均有較明確的家族史,6例無(wú)家族史,有家族史的患者中內(nèi)含子22倒位的發(fā)生率明顯高于無(wú)家族史患者。重型HA患者中有家族史與無(wú)家族史患病率比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由以上結(jié)果可以看出將內(nèi)含子22倒位作為家系調(diào)查和攜帶者篩查具有一定可行性和實(shí)際價(jià)值。

    表3 有、無(wú)家族史HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生情況及FⅧ活性比較

    (1)與無(wú)家族史HA患者比較,χ2=4.81,P<0.05;(2)與無(wú)家族史HA患者比較,χ2=6.97,P<0.05

    內(nèi)含子1倒位是僅次于內(nèi)含子22倒位導(dǎo)致重型HA的另一個(gè)重要分子發(fā)病機(jī)制[7]。目前認(rèn)為,內(nèi)含子1倒位發(fā)生率為1.2%~5%。國(guó)內(nèi)首次大宗進(jìn)行內(nèi)含子l倒位篩查研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1倒位占1.26%(2/158)[8],本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1倒位1例,占1.33%,與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符。內(nèi)含子1倒位的發(fā)生率低,不作為首選家系調(diào)查和攜帶者篩查。

    3個(gè)FⅧA 同源性高達(dá)99.9%的序列中, 包括了長(zhǎng)達(dá)3.5 kb的GC含量為65%的GC島, 尤其是其中近1 kb GC含量竟高達(dá)79%[9],故擴(kuò)增難度相當(dāng)高,影響LD-PCR成敗的因素很多。諸如引物濃度、酶用量、特殊定制dNTPs、基因組DNA的質(zhì)量及用量、退火延伸溫度及電泳分析等[5]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),同樣的LD-PCR體系及條件下,部分標(biāo)本可得到目的條帶,另外部分標(biāo)本多次PCR均未見(jiàn)目的條帶,故推測(cè)在此實(shí)驗(yàn)中影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵在于基因組DNA的質(zhì)量,采用鹽析法及試劑盒提取DNA結(jié)果均不如意,酚-氯仿法仍是提取高質(zhì)量DNA的經(jīng)典方法,但操作過(guò)程很重要,每一步的手法必須輕柔,時(shí)間必須足夠且可適當(dāng)延長(zhǎng),并將飽和酚及氯仿∶異戊醇的步驟各增加一次,以得到純度更高的DNA。通過(guò)提高DNA質(zhì)量,原來(lái)未出現(xiàn)目的條帶的標(biāo)本均出現(xiàn)了目的條帶。但實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性仍較差,考慮到LD-PCR體系加樣極微量,實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件不能達(dá)到,嚴(yán)重影響加樣的精確性,固采用混合加樣后分裝代替以前的逐個(gè)加樣,實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性得到一定程度的鞏固。

    總之,目前LD-PCR是檢測(cè)HA患者內(nèi)含子22倒位的首選方法,內(nèi)含子22倒位檢測(cè)在重型HA的基因診斷及發(fā)病機(jī)理研究中具有重要意義,以后進(jìn)一步擴(kuò)大研究,明確該倒位對(duì)于患者家系優(yōu)生優(yōu)育的價(jià)值。

    4參考文獻(xiàn)

    袁凱鋒,廖小梅.血友病的診斷和治療[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué), 2007(3):219-222.

    Mantilla-Capacho JM,Beltran-Miranda CP,Luna-Zaizar H,et al.Frequency of intron 1 and 22 inversions of Factor Ⅷ gene in Mexican patients with severe hemophilia A[J].Am J Hematol, 2007 (4):283-287.

    張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京:科學(xué)出版社, 2007:191.

    Lakich D,Kazazian HH,Antonarakis SE,et al.Inversions disrupting the factor VIII gene as a common cause of severe hemophilia A[J].Nat Genet, 1993(2):236-241.

    劉敬忠, 劉強(qiáng), 梁燕,等.重型血友病甲基因診斷新技術(shù)的研究及其應(yīng)用[J]. 高技術(shù)通訊, 1998(9):40.

    薛峰,楊仁池. 100例血友病A患者凝血因子VIII 基因突變與臨床表型的研究[J].臨床血液學(xué)雜志, 2012 (5):299-301.

    Bagnall RD,Waseem N,Green PM,el al.Recurrent inversion breaking intron 1 of the factorⅧ gene is a frequent cause of severe hemophilia A[J].Blood, 2002(1):168-174.

    閆振宇.血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物的形成及其危險(xiǎn)因素分析[D].北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué), 2007.

    Naylor J , Buck D, Green P ,et al. Factor Ⅷ gene inversions in severe hemophilia A patients.Human Molecuar Genetics, 1995(4): 1217.

    (2016-04-10收稿,2016-06-13修回)

    中文編輯: 周凌; 英文編輯: 劉華

    *通信作者E-mail:zengxiaoqing@hotmoul.com

    [中圖分類(lèi)號(hào)]R554.11

    [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

    [文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0810-04

    DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.016

    Analysis of Gene Inversion of Introns 22 and Introns 1 in 75 Patients with Hemophilia A

    HUANG Gie1, ZHANG Jing2, LIU Yongmei1, YANG Fang3, ZENG Xiaojing1

    (1.theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

    [Abstract]Objective: To observe the inversion of intron 22 and intron 1 in coagulation factor VIII gene of patients with hemophilia A(HA). Methods: Venous blood was taken from 75 cases of HA patients. Long range PCR amplification technology (LD-PCR) was adopted to detect intron 22 and intron 1 inversion. Two introns inversion occurrence was observed, and the intron 22 inversion proportion in severe HA patients was observed. The intron 22 inversion incidence was compared between patients of HA family history and no HA family history. Results: 27 patients with intron 22 inversion were found among the 75 patients, and detection rate was 36 %.All of 27 were severe HA patients, accounting for 57.4% of total 47 cases of severe HA patients(27/47) . In 27 cases, there were 21 cases with family history, and the incidence of intron 22 inversion was higher than that in patients with no family history (P<0.05). There was 1 case of intron 1 inversion, accounting for 1.3% (1/75). Conclusions: There is a higher probability of F VIII gene intron 22 inversion in severe HA patients, and intron 22 inversion detection has important significance in severe HA patients gene diagnosis.

    [Key words]hemophilia A; coagulation factor VIII; gene inversion; diagnosis

    網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.026.html

    猜你喜歡
    凝血因子診斷
    控制冷沉淀凝血因子在室溫下制備時(shí)長(zhǎng)的臨床意義
    少見(jiàn)凝血因子缺乏癥3例
    1例凝血因子Ⅻ缺乏癥個(gè)案分析并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    冷沉淀凝血因子臨床應(yīng)用調(diào)查分析
    不同時(shí)間制備的血漿及冷沉淀的質(zhì)量對(duì)比
    常見(jiàn)羽毛球運(yùn)動(dòng)軟組織損傷及診斷分析
    淺談豬喘氣病的病因、診斷及防治
    信息技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)在當(dāng)代汽車(chē)維修中的應(yīng)用分析
    紅外線測(cè)溫儀在汽車(chē)診斷中的應(yīng)用
    科技視界(2016年21期)2016-10-17 18:28:05
    窄帶成像聯(lián)合放大內(nèi)鏡在胃黏膜早期病變?cè)\斷中的應(yīng)用
    日韩av在线免费看完整版不卡| 综合色丁香网| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品人妻少妇| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 高清av免费在线| 99久久精品热视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产极品天堂在线| 亚洲精品自拍成人| 大话2 男鬼变身卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲在久久综合| 亚洲精品一二三| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩电影二区| 日韩电影二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美日本视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产成人精品久久久久久| 精品国产露脸久久av麻豆| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 黑丝袜美女国产一区| 黄色一级大片看看| 大陆偷拍与自拍| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 在线天堂最新版资源| 网址你懂的国产日韩在线| 少妇高潮的动态图| 久久久久国产网址| 成人免费观看视频高清| 欧美最新免费一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av | 成人免费观看视频高清| h日本视频在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 99精国产麻豆久久婷婷| 交换朋友夫妻互换小说| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品视频女| 日韩伦理黄色片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩精品有码人妻一区| 黑人高潮一二区| 亚洲国产精品一区三区| 午夜福利视频精品| 国产在视频线精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久久久久丰满| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 亚洲最大成人中文| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美三级亚洲精品| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 日日撸夜夜添| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜激情久久久久久久| 成人漫画全彩无遮挡| 能在线免费看毛片的网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 人妻系列 视频| 99热这里只有精品一区| 老熟女久久久| 丰满少妇做爰视频| 色吧在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品一及| 日韩中文字幕视频在线看片 | 国产乱人偷精品视频| 日韩一区二区视频免费看| 99re6热这里在线精品视频| 欧美+日韩+精品| 国产成人一区二区在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产真实伦视频高清在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩精品有码人妻一区| 国产男女内射视频| 免费观看无遮挡的男女| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品一二三区在线看| 97在线人人人人妻| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 中文欧美无线码| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品第二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产毛片在线视频| 久久久午夜欧美精品| 欧美另类一区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人美女网站在线观看视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成人手机| 少妇人妻精品综合一区二区| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产av精品麻豆| 久久精品人妻少妇| 精品一区二区免费观看| av在线播放精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 午夜免费观看性视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 男人添女人高潮全过程视频| 18+在线观看网站| 女人久久www免费人成看片| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久伊人网av| 国产高清国产精品国产三级 | 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美xxⅹ黑人| av免费观看日本| 一级a做视频免费观看| 亚洲成人手机| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产精品国产精品| 人人妻人人看人人澡| www.av在线官网国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产真实伦视频高清在线观看| 十分钟在线观看高清视频www | 欧美日韩视频精品一区| 国产亚洲91精品色在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 高清欧美精品videossex| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 婷婷色综合www| 成年av动漫网址| 美女中出高潮动态图| 亚洲色图av天堂| 男人舔奶头视频| 国产极品天堂在线| 五月玫瑰六月丁香| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久人人爽人人爽人人片va| 久久青草综合色| 亚洲精品第二区| 亚洲国产精品国产精品| 日韩国内少妇激情av| av在线蜜桃| 日韩中字成人| 国产精品一区二区在线不卡| 好男人视频免费观看在线| 人妻系列 视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 男女无遮挡免费网站观看| 色综合色国产| 亚洲av中文av极速乱| 色吧在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 大香蕉97超碰在线| 久久精品国产亚洲av天美| 赤兔流量卡办理| 免费观看av网站的网址| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品久久久久久久久av| 亚洲成人手机| 人妻系列 视频| 国产色婷婷99| 在线观看免费日韩欧美大片 | 性色avwww在线观看| 少妇 在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久av网站| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品一二三| 日韩欧美 国产精品| 国产一区二区三区av在线| 国国产精品蜜臀av免费| 国产在视频线精品| 亚洲不卡免费看| 久久毛片免费看一区二区三区| 大香蕉久久网| 国产精品偷伦视频观看了| 成人国产av品久久久| 免费观看在线日韩| 国产黄色免费在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲av免费高清在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲第一av免费看| 国产精品一区二区在线观看99| freevideosex欧美| 2018国产大陆天天弄谢| 插阴视频在线观看视频| 日本黄色片子视频| 精品久久久噜噜| 亚洲av二区三区四区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲av成人精品一二三区| 久久久久久久精品精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲第一av免费看| av福利片在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 2018国产大陆天天弄谢| 精品久久国产蜜桃| 五月天丁香电影| 联通29元200g的流量卡| 黄色日韩在线| 久久99蜜桃精品久久| 精品久久国产蜜桃| 亚洲国产色片| 久久精品国产亚洲网站| 免费看不卡的av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 91精品伊人久久大香线蕉| 极品教师在线视频| 国产在线视频一区二区| 久久99精品国语久久久| 久久ye,这里只有精品| 日韩免费高清中文字幕av| 国产深夜福利视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| www.色视频.com| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲一区二区精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲av国产av综合av卡| 精品久久久久久久久av| 国产成人aa在线观看| 99热这里只有是精品50| av福利片在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美一区二区亚洲| 少妇人妻精品综合一区二区| 精品久久久噜噜| 国产av精品麻豆| 亚洲自偷自拍三级| 国产老妇伦熟女老妇高清| 少妇的逼水好多| 成人毛片a级毛片在线播放| 一级片'在线观看视频| 简卡轻食公司| 伦理电影大哥的女人| 91久久精品电影网| 成人国产av品久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一级二级三级毛片免费看| 99热6这里只有精品| 日韩电影二区| 日韩一本色道免费dvd| 成人特级av手机在线观看| 亚洲四区av| 成人综合一区亚洲| 国产永久视频网站| 激情 狠狠 欧美| 欧美丝袜亚洲另类| 精品酒店卫生间| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久久a久久爽久久v久久| 身体一侧抽搐| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品一二三区在线看| 亚洲在久久综合| 日韩伦理黄色片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99热这里只有精品一区| 国产在线视频一区二区| 黄片wwwwww| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品国产三级国产专区5o| kizo精华| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一区二区三区免费毛片| 欧美成人午夜免费资源| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 五月开心婷婷网| 亚洲精品日韩av片在线观看| 视频中文字幕在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99国产精品免费福利视频| 日本午夜av视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产爱豆传媒在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产中年淑女户外野战色| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 嫩草影院新地址| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品久久久久久久电影| 精品久久国产蜜桃| 国产亚洲一区二区精品| 久久鲁丝午夜福利片| 精品一区二区免费观看| 最近手机中文字幕大全| 精品视频人人做人人爽| 2022亚洲国产成人精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| videos熟女内射| 国产成人精品久久久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一区二区三区乱码不卡18| 国产伦精品一区二区三区四那| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产在视频线精品| 中文字幕久久专区| 中文天堂在线官网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产美女午夜福利| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品人妻少妇| 久久久久久伊人网av| 高清不卡的av网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97超碰精品成人国产| av播播在线观看一区| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲人与动物交配视频| 99热6这里只有精品| 成人一区二区视频在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产一区二区在线观看日韩| 丰满乱子伦码专区| 老司机影院成人| 少妇精品久久久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久久成人免费电影| 久久6这里有精品| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 精品久久国产蜜桃| 一级av片app| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久久久国产电影| 日本免费在线观看一区| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲av中文av极速乱| 国产黄片视频在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美三级亚洲精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 视频中文字幕在线观看| 一级爰片在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 男人添女人高潮全过程视频| av免费观看日本| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产欧美亚洲国产| 国产精品免费大片| 91精品国产九色| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品一区www在线观看| 在线精品无人区一区二区三 | 亚洲成人一二三区av| av天堂中文字幕网| 亚洲av男天堂| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲色图av天堂| 国产男女内射视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 一个人看视频在线观看www免费| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品女同一区二区软件| 午夜精品国产一区二区电影| 交换朋友夫妻互换小说| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲图色成人| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一区二区三区精品91| 一本久久精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美97在线视频| 黄片wwwwww| 日本欧美国产在线视频| 尾随美女入室| 精品午夜福利在线看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产亚洲一区二区精品| 国产免费福利视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99热这里只有精品一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 精品国产三级普通话版| 国内精品宾馆在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 日日撸夜夜添| 免费在线观看成人毛片| 日韩国内少妇激情av| 国产精品人妻久久久影院| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 91久久精品国产一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 91在线精品国自产拍蜜月| 国产色婷婷99| 又爽又黄a免费视频| 男女边摸边吃奶| 婷婷色综合www| www.av在线官网国产| 麻豆国产97在线/欧美| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 青春草亚洲视频在线观看| 在线观看人妻少妇| av播播在线观看一区| 在线免费十八禁| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费观看av网站的网址| 久久 成人 亚洲| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 丝袜脚勾引网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 青春草亚洲视频在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 国产成人91sexporn| 极品教师在线视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人一区二区在线| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久久久久丰满| 欧美精品一区二区免费开放| 乱系列少妇在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 波野结衣二区三区在线| 国产精品一区二区在线不卡| 成人综合一区亚洲| 少妇人妻久久综合中文| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜福利高清视频| 亚洲综合精品二区| 美女视频免费永久观看网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品一区二区性色av| 嫩草影院入口| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲一区二区三区欧美精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 夫妻午夜视频| 国产高清三级在线| 精品人妻视频免费看| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美三级亚洲精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩成人伦理影院| 有码 亚洲区| 国产在线一区二区三区精| 精华霜和精华液先用哪个| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日本黄色日本黄色录像| 男女国产视频网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品.久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 深夜a级毛片| 99热这里只有是精品在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国模一区二区三区四区视频| 99国产精品免费福利视频| 我要看日韩黄色一级片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产 一区精品| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久亚洲精品成人影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产精品蜜桃在线观看| 九九在线视频观看精品| 超碰av人人做人人爽久久| 国产成人精品一,二区| 国产精品福利在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 女人久久www免费人成看片| 超碰av人人做人人爽久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲精品国产成人久久av| 99久久精品一区二区三区| xxx大片免费视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲av男天堂| 国产高清三级在线| 日日撸夜夜添| 在线观看人妻少妇| 一级毛片 在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日日撸夜夜添| 国产色爽女视频免费观看| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 简卡轻食公司| 成人毛片a级毛片在线播放| 男人舔奶头视频| 毛片女人毛片| 色网站视频免费| 插阴视频在线观看视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产伦在线观看视频一区| 久久ye,这里只有精品| 亚洲无线观看免费| 国产精品欧美亚洲77777| 秋霞伦理黄片| 免费av中文字幕在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一级爰片在线观看| 各种免费的搞黄视频| 亚洲第一av免费看| 午夜激情久久久久久久| 青春草视频在线免费观看| 夫妻午夜视频| h视频一区二区三区| 激情五月婷婷亚洲| 中国美白少妇内射xxxbb| 综合色丁香网| 国产精品一区二区三区四区免费观看| av一本久久久久| 日韩成人伦理影院| 免费大片18禁| 欧美高清成人免费视频www| 久久ye,这里只有精品| 午夜福利视频精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 深爱激情五月婷婷| 亚洲,欧美,日韩| 国产黄片视频在线免费观看| www.av在线官网国产| 亚洲高清免费不卡视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产黄片视频在线免费观看| 色综合色国产| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久久久久人人人人人人| 91精品伊人久久大香线蕉| 免费av不卡在线播放| 欧美成人a在线观看| 黄色配什么色好看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 在线天堂最新版资源| 美女cb高潮喷水在线观看| av.在线天堂| 在线免费十八禁| 亚洲av中文av极速乱| 成人二区视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 观看免费一级毛片| 黑人高潮一二区| 99久久精品一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久久久久精品精品| 久久国产精品大桥未久av | 一本久久精品| 久久热精品热| 亚洲成人一二三区av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲图色成人| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美性感艳星| 亚洲最大成人中文| 日韩欧美精品免费久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产中年淑女户外野战色| freevideosex欧美| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩大片免费观看网站| 午夜视频国产福利| 中国国产av一级| 色综合色国产| 国产精品嫩草影院av在线观看| 91久久精品电影网|