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    75例血友病A患者內(nèi)含子22及1基因倒位情況分析*

    2016-08-01 11:11:48黃吉娥劉詠梅曾小菁
    關(guān)鍵詞:凝血因子診斷

    黃吉娥, 張 婧, 劉詠梅, 楊 芳, 曾小菁*

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴州 貴陽(yáng) 550004)

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    75例血友病A患者內(nèi)含子22及1基因倒位情況分析*

    黃吉娥1, 張婧2, 劉詠梅1, 楊芳3, 曾小菁1*

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽(yáng)550004; 2.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽(yáng)550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴州 貴陽(yáng)550004)

    [摘要]目的: 觀察血友病A(HA)患者凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1倒位情況。方法: 取75例HA患者靜脈血,采用長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增技術(shù)(LD-PCR)檢測(cè)內(nèi)含子22和內(nèi)含子1倒位情況, 觀察兩種內(nèi)含子倒位發(fā)生率,同時(shí)觀察內(nèi)含子22倒位在重型HA中的比例,比較有家族史和無(wú)家族史HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生率。結(jié)果: 檢出22號(hào)內(nèi)含子倒位患者27例,檢出率36%(27/75),全部為HA重型患者,占重型血友病A患者的57.4%(27/47);27例中有21例有家族史,有家族史患者內(nèi)含子22號(hào)倒位的發(fā)生率高于無(wú)家族史患者(P<0.05);檢出內(nèi)含子1倒位1例,占1.3%(1/75)。結(jié)論: FⅧ基因內(nèi)含子22倒位患者患重型HA的幾率較高,內(nèi)含子22倒位檢測(cè)在重型HA的基因診斷中具有重要意義。

    [關(guān)鍵詞]血友病A; 凝血因子Ⅷ; 基因倒位; 診斷

    血友病A(hemophilia A,HA)是一種由凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X 連鎖遺傳性出血疾病, 男性患病率約為1/5 000。HA患者常出現(xiàn)自發(fā)性或外傷后出血不止, 嚴(yán)重威脅著患者的生命, 給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。為阻斷致病基因傳遞,防止新的HA患兒出生, 開(kāi)展HA攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷,對(duì)于降低HA的發(fā)病率和致殘率具有重要意義。FⅧ基因內(nèi)含子22和1倒位是導(dǎo)致重型HA的重要的分子發(fā)病機(jī)制,內(nèi)含子22和1倒位分析也是目前用于HA疾病基因診斷的主要技術(shù)[2]。本研究通過(guò)長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增技術(shù)(long distance-PCR,LD-PCR)檢測(cè)HA患者內(nèi)含子22和1倒位情況,以期提高檢測(cè)預(yù)判的成功率及穩(wěn)定性,進(jìn)而成熟應(yīng)用于地區(qū)HA家系及攜帶者調(diào)查。

    1材料和方法

    1.1研究對(duì)象

    病例均選自血友病中心2012-2014年登記的HA患者75例,均為男性,年齡9個(gè)月~58歲(≤10歲者19例,11~30歲41例,>30歲患者15例);有家族史者46例,無(wú)家族史者29例;根據(jù)FⅧ活性,分為輕、中、重型,重型患者47例(FⅧ活性<1%),中間型患者24例(FⅧ活性1%~5%),輕型患者4例(FⅧ活性>5%~40%),血管性血友病因子(vWF)抗原正常,均符合張之南等[3]主編的第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》HA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2標(biāo)本采集與處理

    取靜脈血3 mL,用EDTA-Na2抗凝,充分混勻。血樣采集后1 h內(nèi)將標(biāo)本在室溫下以3 000 r/min離心5 min,取血漿層、白細(xì)胞層和紅細(xì)胞層分裝于已消毒的EP管中,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)。使用經(jīng)典的酚-氯仿法提取DNA。

    1.3內(nèi)含子22基因倒位的檢測(cè)

    以FⅧ基因DNA序列(GeneBank參考序列:CM000685.2)為模板,應(yīng)用軟件Primer 5設(shè)計(jì)引物,見(jiàn)表1。LD-PCR反應(yīng)體系為 2×GC PCR 緩沖液 I 12.5μL , dNTP(2.5μmol,dGTP/7-deaza-dGTP=3/1)4 μL,引物P、Q、B (10μmol/L) 分別1、0.5、0.5 μL,模板基因組DNA 1 μL (約100 ng) , LA-Taq酶0.25 μL, 蒸餾水補(bǔ)足至25 μL;反應(yīng)條件98 ℃預(yù)變性1 min,98 ℃變性10 s,68 ℃退火(延伸)10 min,10個(gè)循環(huán)后,98 ℃變性10 s,每一個(gè)循環(huán)的68 ℃退火(延伸)20 s,20個(gè)循環(huán)中,最后一次72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL,與1 μL 6×上樣緩沖液混勻,在0.6%瓊脂糖凝膠(含0.5 m/L溴化乙錠),1×TBE緩沖液的電泳槽中,恒壓50 V的電壓下電泳5 h,置凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

    表1 內(nèi)含子22倒位檢測(cè)所需引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

    1.4內(nèi)含子1基因倒位的檢測(cè)

    雙管多重PCR反應(yīng)包括Int1h-1和Int1h-2兩個(gè)體系,相關(guān)引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6]。內(nèi)含子1倒位反應(yīng)引物序列及片段大小見(jiàn)表2。Int1h-1反應(yīng)體系: 10×LA 緩沖液Ⅱ(含Mg2+)2.5 μL,dNTP混合液2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物9CR(10 μmol)各1 μL,模板基因組DNA 2 μL (約200 ng),LA-Taq酶0.25 μL, 蒸餾水補(bǔ)足至25 μL;Int1h-2反應(yīng)體系:10×LA緩沖液Ⅱ(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物int1h-2R(10 μmol)各1 μL ,模板基因組DNA 2 μL (約200 ng),LA-Taq酶0.25 μL,蒸餾水補(bǔ)足至25 μL;反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性10 s,61 ℃退火30 s,

    表2 內(nèi)含子1倒位檢測(cè)所需引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

    72 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán)后,最后一次72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):1.5%瓊脂糖凝膠,5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×上樣緩沖液產(chǎn)物混合上樣,DNA Marker為DL2000,在0.5×TBE電泳液中在恒壓100 V條件下電泳1 h,紫外燈下凝膠成像處理。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用χ2檢驗(yàn)確切概率法進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1FⅧ基因內(nèi)含子22倒位分析

    75例HA患者中內(nèi)含子22倒位患者27例,占36%,27例患者均為重型,占重型HA的57.4%(27/47)。FⅧ基因內(nèi)含子22倒位的LD-PCR產(chǎn)物為11 kb,電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

    注:M1及M2為 DNA Marker,N為正常對(duì)照,1、4、5、7、9、10可見(jiàn)11 kb條帶,提示存在內(nèi)含子22倒位,2、3、6、8、11及N可見(jiàn)12 kb條帶,提示為正常圖1 HA患者及正常對(duì)照標(biāo)本FⅧ基因內(nèi)含子22倒位LD-PCR電泳結(jié)果Fig.1 F VIII intron 22LD-PCR electrophoresis results for HA patients and normal controls

    2.2FⅧ基因內(nèi)含子1倒位分析

    根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度進(jìn)行判斷內(nèi)含子1的倒位情況,75例HA患者中發(fā)現(xiàn)1例內(nèi)含子1倒位,占1.3%(1/75),電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生率36%高于內(nèi)含子1倒位發(fā)生率(1.33%),兩者比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    注:M1及M2為 DNA Marker, 2為1號(hào)內(nèi)含子倒位HA患者標(biāo)本;標(biāo)本1,3為正常人圖2 HA患者及正常對(duì)照標(biāo)本FⅧ基因內(nèi)含子1倒位PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification results of FVIII intron 1 for HA patients and normal control specimens

    2.3有、無(wú)家族史HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生率

    27例檢測(cè)出內(nèi)含子22倒位的患者中21例有較明確的家族史,6例無(wú)家族史,有家族史HA患者中內(nèi)含子22倒位發(fā)生率及重型血友病患者的比例均高于無(wú)家族史患者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

    3討論

    HA是由于FⅧ基因缺陷導(dǎo)致的一種臨床上最常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病,FⅧ基因約186 kb,包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子,其中內(nèi)含子22最大,長(zhǎng)達(dá)32 kb,為最大的內(nèi)含子。導(dǎo)致HA的基因突變?cè)蚍倍?且有高度異質(zhì)性,其中重型HA 基因突變多為大的DNA片段缺失、倒位或插入等。1993年Lakich證實(shí)了40%~50%的重型HA為內(nèi)含子22 倒位所致,發(fā)生機(jī)制為FⅧ基因內(nèi)存在一個(gè)基因FⅧA ,長(zhǎng)達(dá)9.5 kb,與FⅧ基因轉(zhuǎn)錄方向相反,在FⅧ基因外上游約400 kb處有兩個(gè)與FⅧA 高度同源的核苷酸序列(具99.99 %同源性) FⅧA1,FⅧA2。FⅧA與其同源序列發(fā)生重組時(shí)就形成內(nèi)含子22倒位,使1~22號(hào)外顯子與22~26號(hào)外顯子分離,嚴(yán)重破壞了FⅧ基因的結(jié)構(gòu)。早先Lakich和Naylor等[4]多應(yīng)用Southern 印跡法檢測(cè)內(nèi)含子22倒位,操作周期長(zhǎng),過(guò)程復(fù)雜,且通常要使用同位素,而劉敬忠[5]等應(yīng)用LD-PCR可快速檢測(cè)該基因缺陷,它應(yīng)用P,Q ,B 三種引物進(jìn)行擴(kuò)增,如果確為內(nèi)含子22倒位,則患者呈11 kb一條帶,攜帶者為11 kb,12 kb兩條帶,正常者為12 kb一條帶,該法檢測(cè)準(zhǔn)確,且效率高。由于貴州省血友病家系對(duì)本病的認(rèn)識(shí)普遍不高,故未能取得家系疑似攜帶者的標(biāo)本,故本文僅就75例已經(jīng)證實(shí)的HA患者進(jìn)行內(nèi)含子22倒位的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示其中27例為內(nèi)含子22倒位,占36% ,且均為重型血友病(FⅧ活性﹤1%),與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致〔6]。27例檢測(cè)出內(nèi)含子22倒位的患者中有21例均有較明確的家族史,6例無(wú)家族史,有家族史的患者中內(nèi)含子22倒位的發(fā)生率明顯高于無(wú)家族史患者。重型HA患者中有家族史與無(wú)家族史患病率比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由以上結(jié)果可以看出將內(nèi)含子22倒位作為家系調(diào)查和攜帶者篩查具有一定可行性和實(shí)際價(jià)值。

    表3 有、無(wú)家族史HA患者內(nèi)含子22倒位發(fā)生情況及FⅧ活性比較

    (1)與無(wú)家族史HA患者比較,χ2=4.81,P<0.05;(2)與無(wú)家族史HA患者比較,χ2=6.97,P<0.05

    內(nèi)含子1倒位是僅次于內(nèi)含子22倒位導(dǎo)致重型HA的另一個(gè)重要分子發(fā)病機(jī)制[7]。目前認(rèn)為,內(nèi)含子1倒位發(fā)生率為1.2%~5%。國(guó)內(nèi)首次大宗進(jìn)行內(nèi)含子l倒位篩查研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1倒位占1.26%(2/158)[8],本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1倒位1例,占1.33%,與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符。內(nèi)含子1倒位的發(fā)生率低,不作為首選家系調(diào)查和攜帶者篩查。

    3個(gè)FⅧA 同源性高達(dá)99.9%的序列中, 包括了長(zhǎng)達(dá)3.5 kb的GC含量為65%的GC島, 尤其是其中近1 kb GC含量竟高達(dá)79%[9],故擴(kuò)增難度相當(dāng)高,影響LD-PCR成敗的因素很多。諸如引物濃度、酶用量、特殊定制dNTPs、基因組DNA的質(zhì)量及用量、退火延伸溫度及電泳分析等[5]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),同樣的LD-PCR體系及條件下,部分標(biāo)本可得到目的條帶,另外部分標(biāo)本多次PCR均未見(jiàn)目的條帶,故推測(cè)在此實(shí)驗(yàn)中影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵在于基因組DNA的質(zhì)量,采用鹽析法及試劑盒提取DNA結(jié)果均不如意,酚-氯仿法仍是提取高質(zhì)量DNA的經(jīng)典方法,但操作過(guò)程很重要,每一步的手法必須輕柔,時(shí)間必須足夠且可適當(dāng)延長(zhǎng),并將飽和酚及氯仿∶異戊醇的步驟各增加一次,以得到純度更高的DNA。通過(guò)提高DNA質(zhì)量,原來(lái)未出現(xiàn)目的條帶的標(biāo)本均出現(xiàn)了目的條帶。但實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性仍較差,考慮到LD-PCR體系加樣極微量,實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件不能達(dá)到,嚴(yán)重影響加樣的精確性,固采用混合加樣后分裝代替以前的逐個(gè)加樣,實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性得到一定程度的鞏固。

    總之,目前LD-PCR是檢測(cè)HA患者內(nèi)含子22倒位的首選方法,內(nèi)含子22倒位檢測(cè)在重型HA的基因診斷及發(fā)病機(jī)理研究中具有重要意義,以后進(jìn)一步擴(kuò)大研究,明確該倒位對(duì)于患者家系優(yōu)生優(yōu)育的價(jià)值。

    4參考文獻(xiàn)

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    劉敬忠, 劉強(qiáng), 梁燕,等.重型血友病甲基因診斷新技術(shù)的研究及其應(yīng)用[J]. 高技術(shù)通訊, 1998(9):40.

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    (2016-04-10收稿,2016-06-13修回)

    中文編輯: 周凌; 英文編輯: 劉華

    *通信作者E-mail:zengxiaoqing@hotmoul.com

    [中圖分類(lèi)號(hào)]R554.11

    [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

    [文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0810-04

    DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.016

    Analysis of Gene Inversion of Introns 22 and Introns 1 in 75 Patients with Hemophilia A

    HUANG Gie1, ZHANG Jing2, LIU Yongmei1, YANG Fang3, ZENG Xiaojing1

    (1.theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

    [Abstract]Objective: To observe the inversion of intron 22 and intron 1 in coagulation factor VIII gene of patients with hemophilia A(HA). Methods: Venous blood was taken from 75 cases of HA patients. Long range PCR amplification technology (LD-PCR) was adopted to detect intron 22 and intron 1 inversion. Two introns inversion occurrence was observed, and the intron 22 inversion proportion in severe HA patients was observed. The intron 22 inversion incidence was compared between patients of HA family history and no HA family history. Results: 27 patients with intron 22 inversion were found among the 75 patients, and detection rate was 36 %.All of 27 were severe HA patients, accounting for 57.4% of total 47 cases of severe HA patients(27/47) . In 27 cases, there were 21 cases with family history, and the incidence of intron 22 inversion was higher than that in patients with no family history (P<0.05). There was 1 case of intron 1 inversion, accounting for 1.3% (1/75). Conclusions: There is a higher probability of F VIII gene intron 22 inversion in severe HA patients, and intron 22 inversion detection has important significance in severe HA patients gene diagnosis.

    [Key words]hemophilia A; coagulation factor VIII; gene inversion; diagnosis

    網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.026.html

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