低頻電刺激對耐藥癲癇大鼠海馬細胞外液谷氨酸及γ-氨基丁酸的影響*

唐太峰, 伍國鋒

(1.貴陽市第二人民醫(yī)院 神經內科, 貴州 貴陽　550081； 2.貴州醫(yī)科大學附院 神經內科, 貴州 貴陽　550004)

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低頻電刺激對耐藥癲癇大鼠海馬細胞外液谷氨酸及γ-氨基丁酸的影響*

唐太峰1, 伍國鋒2

(1.貴陽市第二人民醫(yī)院 神經內科, 貴州 貴陽550081； 2.貴州醫(yī)科大學附院 神經內科, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察低頻電刺激(LFS)海馬對杏仁核電點燃耐藥癲癇模型大鼠腦內谷氨酸(Glu)及γ-氨基丁酸(GABA)的影響。方法： 選取60只雄性健康SD大鼠制作杏仁核點燃模型，采用苯妥英鈉(PHT)和苯巴比妥(PB)對杏仁核點燃癲癇鼠進行耐藥篩選，對明確耐藥大鼠給予海馬LFS治療，收集電刺激海馬治療前后腦組織微透析液，采用高效液相色譜法(HPLC)觀察治療前后Glu及GABA含量。結果： 篩選出的耐藥癲癇模型大鼠7只，海馬刺激前GABA濃度為(29.114 0±7.236 2)mg/L，刺激后為(37.130 0±7.622 5)mg/L，刺激前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Glu刺激前濃度為(2 527.742 0±514.831 1)mg/L，刺激后為(2 243.906 0±329.277 8)mg/L，有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，GABA/Glu刺激前為0.011 63±0.002 34，刺激后為0.016 50±0.002 36，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論： 耐藥癲癇大鼠海馬LFS可增加刺激部位腦組織透析液中GABA水平，提高GABA/Glu比值，這可能是LFS抑制癲癇發(fā)作的機制之一。

[關鍵詞]癲癇; 耐藥； 電刺激療法； 海馬； 谷氨酸； γ-氨基丁酸； 微透析； 色譜法，高壓液相

1987年Velasco等[1]首次報道用雙側丘腦中央中核電刺激治療人類耐藥癲癇控制發(fā)作后，多項相關研究在世界各地相繼展開。目前認為電刺激治療時的刺激部位通常選擇在癲癇觸發(fā)點或癇性放電神經網絡中扮演重要角色的結構，如丘腦底核、尾狀核、丘腦前核、丘腦正中核、黑質、海馬、小腦等。腦深部電刺激(DBS)治療被證實是治療各類成人和青少年癲癇發(fā)作的有效方法[2]，但尚不清楚其確切機制。本研究利用杏仁核電刺激點燃大鼠模型，予抗癲癇藥物篩選建立耐藥癲癇模型，通過低頻電刺激(LFS)海馬，觀察耐藥癲癇模型大鼠腦內的γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的變化，探討LFS海馬控制耐藥大鼠癲癇發(fā)作的作用機制。

1材料和方法

1.1動物及設備

200～250 g的雄性SD大鼠60只單籠標準飼養(yǎng)。 主要儀器：BL-420E生物技能實驗系統(tǒng)，江灣Ⅱ型腦立體定位儀，微量恒速灌流泵(美國Bioanalytical systems.Inc)，微透析套管(美國Bioanalytical systems.Inc)，微透析探針(美國Bioanalytical systems.Inc)，0.22 μm無菌濾膜(美國Millipore公司)，AGILENT 1100高效液相色譜儀(美國AGILENT公司)。人工腦脊液(138mmol/L NaCl,11 mmol/L Na2HCO3,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,1mmol/L NaH2PO4,使用雙蒸餾水配制，其中CaCl2單獨溶解)實驗時與其他溶液混合，并通入95%O2和5%CO2混合氣體，待pH 7.4時停止通氣，0.22 μm無菌濾膜過濾，4 ℃冰箱保存,2周內用于微透析實驗。

1.2癲癇動物模型制作

予4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，固定于腦立體定位儀，暴露顱骨及前囟，按Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠左側杏仁基底外側核(前囟后2.0 mm，矢狀縫旁開5.0 mm，深度8.5 mm)，選擇右側杏仁基底外側核的顱骨表面投影點鉆孔，植入雙極螺旋鎳鉻電極并固定于顱骨表面。術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉(10萬U/d)預防感染，一周后開始電刺激點燃，每日1次(細電流，串刺激，波寬1 ms，頻率60 Hz，持續(xù)時間1 s，電流強度0.450 mA)。發(fā)作強度按Racine法分級[3]，連續(xù)3次4～5級以上發(fā)作則記為完全點燃。點燃24 h記錄后放電閾值(ADT,ADT為引起腦電圖出現(xiàn)后發(fā)放時的最小電流強度;起始電流強度為0.02 mA,此后按每次疊加20%刺激，每5 min記錄1次，直至測出ADT)。

1.3藥物篩選耐藥癲癇模型

ADT 測定完畢24 h,癲癇模型大鼠予生理鹽水(與篩選藥物同體積)腹腔注射，1 h后測ADT。24 h后腹腔注射苯妥英鈉(PHT，75 mg/kg)，1 h后測ADT(起始電流強度為生理鹽水組ADT值的20%，此后按每次疊加20%刺激，每5 min 1次)。將注射PHT與注射生理鹽水后所測得ADT進行對比，若波動范圍在±20%內，則一周后再進行PHT篩選一次，3次均通過的大鼠，考慮對PHT耐藥；并于一周以后進行苯巴比妥(PB，25 mg/kg)篩選，方法同前。所有PHT及PB篩選均通過的大鼠即為耐藥癲癇大鼠模型，納入微透析實驗。

1.4檢測海馬腦組織液GABA和Glu

1.4.1電極及微透析套管的植入4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀，拔除原有左側杏仁核刺激電極，創(chuàng)面止血消毒，清潔顱骨表面，按Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜，選擇右側海馬，坐標為前囟后4.8 mm，矢狀縫旁開5.0 mm，深度4.0 mm。鉆開顱骨，將連接有刺激電極的微透析套管沿坐標點緩慢植入(保證電極與微透析套管平行并緊貼于微透析套管，雙極電極末端超出引導管末端1.5 mm)，植入深度為4.0 mm，牙托粉和502膠水固定。術后大鼠置于較大的籠中，單籠飼養(yǎng)，防止大鼠將套管及電極撞脫。連續(xù)3日注射青霉素預防感染，單籠靜養(yǎng)24 h后用于微透析實驗。

1.4.2海馬電刺激前微透析液的收集植入電極24 h后移去微透析套管針芯，植入微透析探針，輸入端接微量恒速灌流泵，輸出端用EP管收集微透析液。用人工微透析液以2 μL/min速率持續(xù)灌注2 h平衡，大鼠清醒后，開始收集，每管15 min，連續(xù)收集2管并立即置-20 ℃冰箱保存，并在透析結束后轉存-80 ℃冰箱，擇日測定。每只實驗大鼠實驗前均取2管作為基礎值。

1.4.3海馬電刺激后微透析液的收集 按該參數(shù)予海馬低頻電刺激治療：頻率1 Hz、持續(xù)15 min、波寬0.1 ms、電流強度100 mA，連續(xù)單刺激，延時0.05 ms，每日一次(09∶00～11∶00時)，連續(xù)14 d。第14日刺激結束24 h后，按照1.4.2項下方法再次收集微透析液。

1.4.4檢測海馬組織液中的Glu、GABA含量檢測系統(tǒng)為Waters 2475 Multi Fluorescence Detector，Nova-pak C18(150 mm×3.9 mm，粒徑5 μm)反相色譜柱，利用單泵恒流洗脫，設定柱溫30 ℃，流速0.9 mL/min，熒光檢測器設定激發(fā)波長為Ex330 nm，發(fā)射波長為Em420 nm。取微透析樣品中的某一成分峰的保留時間與標準品中相應峰的保留時間相一致者作為其Glu、GABA峰。

1.5統(tǒng)計學處理

2結果

2.1造模結果

60只大鼠，7只術后死亡，余下53只給予電點燃刺激。成功點燃24只，平均發(fā)作天數(shù)15 d。24只點燃大鼠，其中7只通過PHT及PB篩選，視為耐藥癲癇大鼠模型，耐藥率29.17%。

2.2海馬微透析液中Glu和GABA量

予海馬LFS治療14 d之后，各鼠GABA濃度較電刺激治療前升高，而GABA/Glu比值升高趨勢更為顯著，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Glu濃度較電刺激治療前降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

3討論

對于耐藥癲癇患者，外科手術切除病灶可作為藥物治療之外的另一個選擇，但部分患者癲癇灶無法定位，或病灶位于語言、感覺、運動區(qū)等不宜手術部位，因此只有部分患者可外科手術控制發(fā)作[4]。對于藥物控制不佳又不適宜手術的癲癇患者來說，神經電刺激或可成為較好的治療手段，其中DBS這種新的治療手段，由于其療效讓人鼓舞，已經受到廣泛的關注，但其機制尚不明確。本研究使用兩種不同作用機制的抗癲癇藥物(AEDs)對癲癇模型進行耐藥篩選，建立耐藥癲癇模型，探索DBS治療機制。

表1　耐藥癲癇大鼠海馬LFS前后Glu、GABA及

DBS治療耐藥癲癇根據刺激參數(shù)的不同，可分為低頻率電刺激(LFS，≤10 Hz)和高頻率電刺激(HFS，>60 Hz)兩種類型，均有抗癲癇作用，具體機制尚不明確，但隨著電刺激強度的增大，不良反應也隨之增加[5]。本研究選擇LFS作為治療手段。對于刺激靶點的選擇，目前尚存爭議，針對不同的癲癇類型，刺激靶點選擇可能亦有所不同。在耐藥癲癇患者中，大部分為顳葉癲癇，而海馬與顳葉癲癇密切相關[6]，故本研究將刺激靶點定于海馬，且已有人將其運用于臨床[7],但未闡明其機制。目前對于目前DBS治療癲癇可能的機制尚不明確，但與Papez環(huán)路、 皮質-丘腦網絡密切相關[6],而Glu和GABA作為重要的興奮性和抑制性神經遞質代表，成為研究的熱點。因為興奮性遞質增加和抑制性遞質減少均可改變神經網絡的興奮-抑制平衡，這是癇性電活動的分子學基礎。因而以Glu/ GABA來研究癲癇的發(fā)生或許比單純測定Glu或GABA的絕對濃度更有意義。但目前尚沒有合適的藥物對兩者的平衡進行調節(jié)，而采用DBS進行神經調節(jié)的方式則有可能達到此目的。

在本實驗中，GABA濃度和GABA/Glu比值治療后均升高，結果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以GABA/Glu比值升高趨勢最為顯著，Glu濃度有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，推測可能與樣本量較小有關，又或者因Glu升高并非LFS治療的主要機制，提示相對于興奮性神經遞質Glu的變化，抑制性神經遞質GABA可能在電刺激海馬抗癲癇的機制中扮演著更為重要的角色，故由此可推測LFS海馬可選擇性調節(jié)腦內神經遞質的釋放，從而使GABA濃度相對升高更為明顯，致使GABA、Glu之間的平衡發(fā)生變化，抑制性作用增強，從而抑制腦電的異常發(fā)放達到控制癲癇發(fā)作的治療效果。而癲癇發(fā)作時已證實尚伴有其他神經遞質的改變，如去甲腎上腺素、5-HT、多巴胺、乙酰膽堿等，是否電刺激也會引起這些神經遞質的相應變化，尚需進一步研究。

LFS海馬可增加刺激局部的GABA水平，調節(jié)GABA/Glu比值，使之升高，可能是LFS控制癲癇發(fā)作的作用機制之一。

4參考文獻

[1] Velasco F,Velasco M,Ogarrio C,et al.Electrical stimulation of the centromedian thalamic nucleus in the treatment of convulsive seizures: A preliminary report[J]. Epilepsia, 1987(28):421-425.

[2] Tykocki T,Mandat T,Kornak A, et al. Deep brain stimulation for refractory epilepsy[J].Arch Med Sci, 2012(10):805-806.

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[4] West S，Nolan SJ，Cotton J，et al.Surgery for epilepsy [M].John Wiley & Sons Ltd， 2013:729.

[5] Jaseja H.Deep brain stimulation in intractable epilepsy: postulated optimal stimulation parameters[J]. Epilepsy Behav， 2013(29):597-601.

[6] Laxpati NG， Kasoff WS， Gross RE.Deep brain stimulation for the treatment of epilepsy: circuits，targets，and trials[J].Neurotherapeutics， 2014(11):508-511.

[7] Cukiert A， Cukiert CM， Burattini JA，et al. Seizure outcome after hippocampal deep brain stimulation in a prospective cohort of patients with refractory temporal lobe epilepsy [J].Seizure， 2014(23):6-11.

(2016-02-07收稿，2016-05-21修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

*[基金項目]國家自然科學基金(81241129/H0913)； 長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助項目(TRT13058)

[中圖分類號]R742.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0793-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.012

Influence of Low Frequency Electrical Stimulation on Glutamate and Gama-Aminobutyric Acid in Hippocampal Extracellular Fuid of Rats with Drug Resistant Epilepsy

TANG Taifeng1, WU Guofeng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondPeople'sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550081,Guizhou,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the influence of low frequency electrical stimulation (LFS) of hippocampus on glutamate(Glu) and Gama-Aminobutyric Acid (GABA) in brain tissues of amygdala kindling epilepsy rat model. Methods: 60 healthy male SD rats were selected to make the amygdala kindling epilepsy model. Amygdala kindling rats were screened by Pheytoin sodium and Phenobarbital for their drug resistance. The rats with clear drug resistance received LFS treatment. Hippocampal brain microdialysate liquid was collected before and after LFS treatment and HPLC was adopted to detect Glu and GABA content. Results: 7 amygdale kindling rats with drug resistance were obtained through screening. Among the 7 selected rats with drug resistance, GABA concentration was (29.114±7.236 2) mg/L before LFS compared with (37.13±7.622 5) mg/L after LFS, and the differences were statistically significant (P<0.05). Glu concentration was (2 527.742 0±514.831 1) mg/L before LFS compared with (2 243.906 0±329.277 8) mg/L after LFS, with Glu concentration showing a reducing trend but no significant differences(P>0.05). However, the ratio of GABA/Glu was 0.011 63±0.002 34 before LFS compared with 0.016 50±0.002 36 after LFS, and the differences were statistically significant(P<0.05). Conclusions: LFS on hippocampus can increase the level of GABA and ratio of GABA to Glu, which may be one of mechanisms to suppress the epileptic seizure.

[Key words]epilepsy; drug resistance; electric stimulation therapy; hippocampus; glutamate; gama-aminobutyric acid; microdialysis; chromatography; HLPC，high pressure liquid

網絡出版時間：2016-07-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.024.html