參芎葡萄糖注射液對(duì)肝臟6種亞型微粒體細(xì)胞色素P450酶的抑制作用*

孫　佳, 陸　苑, 潘　潔, 鄭　林, 黃　勇, 王永林, 李勇軍1,**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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參芎葡萄糖注射液對(duì)肝臟6種亞型微粒體細(xì)胞色素P450酶的抑制作用*

孫佳1,2,3,4, 陸苑2,3, 潘潔3, 鄭林2,3, 黃勇2,3, 王永林2,3, 李勇軍1,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng)550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 考察參芎葡萄糖注射液對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素P450(CYP450)酶6種亞型CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的體外抑制作用。方法： 在人肝微粒體孵育系統(tǒng)中，將不同濃度的參芎葡萄糖注射液和7種混合探針底物(非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬、睪酮和咪達(dá)唑侖)共同孵育，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定孵育液中CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶對(duì)應(yīng)代謝物(對(duì)乙酰氨基酚、6-羥基氯唑沙宗、羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、6β-羥基睪酮和α-羥基咪達(dá)唑侖)的剩余量，與對(duì)照組進(jìn)行比較，得到酶的剩余活性，用GraphPad v5.0軟件計(jì)算半抑制濃度(IC50)值，考察參考葡萄糖注射液對(duì)人肝微粒體CYP450酶的抑制程度。結(jié)果: 在人肝微粒體孵育體系中，參芎葡萄糖注射液對(duì)6種CYP450亞型酶的IC50值均>15%。結(jié)論: 在臨床劑量下，參芎葡萄糖注射液對(duì)人肝微粒體CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4無(wú)明顯抑制作用。

[關(guān)鍵詞]參考葡萄糖注射液； 細(xì)胞色素P450； 微粒體，肝； 藥物相互作用

隨著臨床聯(lián)合用藥的日益普遍，由藥物相互作用引發(fā)的不良反應(yīng)逐年遞增，因此，開(kāi)展藥物相互作用研究已引起高度重視，其應(yīng)用價(jià)值和重要意義不容忽視。在人類代謝酶系統(tǒng)中，細(xì)胞色素P450(CYP450)是最重要的一種超基因家族酶，90%以上臨床常見(jiàn)藥物均需通過(guò)CYP450酶系進(jìn)行I相代謝[1]，且藥物代謝酶被抑制約占代謝性藥物相互作用的70%[2]。參芎葡萄糖注射液是由丹參和鹽酸川芎嗪配伍組成的中藥注射液品種，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈作用，還降低血液黏度，改善微循環(huán)，具有抗心肌缺血和心肌梗死的作用，臨床廣泛用于治療閉塞性腦血管病及其他缺血性血管疾病[3-5]。參芎葡萄糖注射液與其他藥物聯(lián)合用藥的情況也相當(dāng)普遍，因藥物間相互作用所帶來(lái)的用藥風(fēng)險(xiǎn)也不斷增大。有關(guān)參芎葡萄糖注射液對(duì)CYP450抑制作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了排除種屬間的差異，本研究特采用人肝微粒體研究參芎葡萄糖注射液對(duì)CYP450酶6種亞型的體外抑制作用，以預(yù)測(cè)其是否會(huì)導(dǎo)致潛在的代謝性藥物相互作用[6]，這將有助于提高臨床用藥的安全性和有效性。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與材料

Waters超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；Beckman Allegra 64R低溫高速離心機(jī)；Thermo 700系列超低溫冰箱；CS501A超級(jí)恒溫水浴箱。參芎葡萄糖注射液(規(guī)格100 mL，批號(hào)20131125)由貴州景峰注射劑有限公司提供，非那西丁、奧美拉唑、甲苯磺丁脲和睪酮(批號(hào)分別為81105、90925、20321、10519)均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，右美沙芬(批號(hào)090M1298V)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，咪達(dá)唑侖注射液購(gòu)于江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，氯唑沙宗和對(duì)乙酰氨基酚(批號(hào)分別為100364-200301、100018-200408)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，右啡烷、羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、6-羥基氯唑沙宗和6β-羥基睪酮(批號(hào)分別為1-ALN-64-2、1-PSB-27-2、1-PSB-27-2、6-QFY-28-2、KIT0635)購(gòu)于加拿大TRC公司，α-羥基咪達(dá)唑侖(批號(hào)FN101512-07)購(gòu)于美國(guó)Cerilliant公司，人肝微粒體購(gòu)于美國(guó)BD公司。NADP+購(gòu)于Roche公司，G-6-P，G-6-PD購(gòu)于Sigma公司，乙腈購(gòu)于德國(guó)默克試劑公司。其他無(wú)機(jī)鹽均為分析純，甲醇為色譜純。

1.2方法1.2.1液相條件色譜柱Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱，流速0.35 mL/min，柱溫 45 ℃，流動(dòng)相 0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，檢測(cè)7種專一性代謝產(chǎn)物的梯度條件為0～3.0 min 5%～65% A，3.0～3.5 min 65%～90% A，3.5～4.5 min 10% A；進(jìn)樣體積為 1 μL[7]。

1.2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，毛細(xì)管電壓 3 kV，離子源溫度 120 ℃，去溶劑氣溫度 350 ℃。去溶劑氣 N2，流速 650 L/h；反吹氣 N2，流速 50 L/h；碰撞氣 Ar，流速 0.16 mL/min；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)，離子對(duì)條件見(jiàn)表1[7]。

表1　質(zhì)譜條件

1.2.3參芎葡萄糖注射液對(duì)CYP450的6種亞型酶的IC50值體外孵育系統(tǒng)的終體積為200 μL，包括含肝微粒體蛋白0.5 g/L，NADP+20 g/L，G-6-P 20 g/L，MgCl213.3 g/L，G-6-PD 40 U/mL，甲苯磺丁脲100 μmol/L、氯唑沙宗50 μmol/L、咪達(dá)唑侖25 μmol/L、睪酮100 μmol/L、右美沙芬50 μmol/L、奧美拉唑50 μmol/L和非那西丁50 μmol/L，以及不同濃度(注射液占孵育體系的0.25%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%和15.0%)的參芎葡萄糖注射液，其余為的0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH=7.4)。將不同濃度參芎葡萄糖注射液分別和NADPH再生系統(tǒng)、肝微粒體和PBS溶液于37 ℃預(yù)孵育3 min，再加入混合探針底物開(kāi)始反應(yīng)，孵育時(shí)間為60 min，其中有機(jī)試劑占反應(yīng)體系的終濃度不得超過(guò)1% (V/V)。對(duì)照組加入等體積的葡萄糖注射液代替，每個(gè)樣品平行操作3次，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL冰冷的甲醇終止反應(yīng)，再加入冰冷的葛根素內(nèi)標(biāo)(2 mg/L)溶液100 μL，渦混均勻后超聲3 min，15 000 r/min離心10 min，用UPLC-MS/MS定量按照“1.2.1”和“1.2.2”項(xiàng)下分析7種探針?biāo)幬飳?duì)應(yīng)的代謝物(羥基甲苯磺丁脲、6-羥基氯唑沙宗、α-羥基咪達(dá)唑侖、6β-羥基睪酮、右啡烷、5-羥基奧美拉唑和對(duì)乙酰氨基酚)。分析結(jié)果使用GraphPad v5.0軟件作圖，并計(jì)算出相對(duì)應(yīng)CYP450酶活性的半抑制濃度(IC50值)。

2結(jié)果

孵育液中參芎葡萄糖注射液體積分?jǐn)?shù)在15%以內(nèi)對(duì)CYP450的6個(gè)亞型酶活性的抑制作用非常弱，GraphPad v5.0軟件無(wú)法擬合出其IC50值。見(jiàn)圖1。

圖1　參芎葡萄糖注射液對(duì)6種亞型CYP450酶的抑制曲線(n=3)Fig.1　Inhibition curve of Shenxiong glucose injection on 6 cytochrome P450 isoforms

3討論

在藥品說(shuō)明書(shū)中，參芎葡萄糖注射液每100 mL參芎葡萄糖注射液分別含有20 mg丹參素和100 mg鹽酸川芎嗪，其他主要成分分別是原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A[8]。參芎葡萄糖注射液臨床常用劑量為100～200 mL/d，粗略地按人體血液為5 L計(jì)算，參芎葡萄糖注射液在血液中的體積百分比濃度最多為2%～4%，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明參芎葡萄糖注射液對(duì)CYP450酶6種亞型的IC50值均大于15%，這濃度遠(yuǎn)超過(guò)臨床劑量，說(shuō)明參芎葡萄糖注射液對(duì)人CYP450無(wú)抑制作用。

CYP450酶活性被抑制或被誘導(dǎo)表達(dá)是導(dǎo)致藥物代謝相互作用的主要原因，其中酶活性被抑制導(dǎo)致的藥物相互作用的臨床意義更為重要，當(dāng)一種藥物抑制某種特定亞型酶活性，會(huì)導(dǎo)致其他通過(guò)該亞型酶代謝的藥物血藥濃度明顯升高，如果是治療窗窄的藥物，如華法林(CYP2C9特異性底物)，則會(huì)發(fā)生嚴(yán)重地藥物不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。石杰[9]發(fā)現(xiàn)川芎嗪對(duì)大鼠肝藥酶CYP1A2和CYP3A4均無(wú)影響。李峰[10]研究表明3種劑量的川芎嗪(50 mg/kg、100 mg/kg和300 mg/kg)對(duì)大鼠的肝重、微粒體產(chǎn)率、CYP450含量及NADPH Cyt C還原酶活性均無(wú)明顯影響。雖然，存在種屬差異，但這也佐證本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有報(bào)道表明丹參中的多種成分，如丹參總酚酸、丹參酮IIA對(duì)大鼠CYP450具有誘導(dǎo)作用[11-12]。并且，以丹參為主要原料藥的復(fù)方丹參滴丸和復(fù)方丹參片對(duì)大鼠CYP450具有明顯的誘導(dǎo)作用[13-15]。因此，需要進(jìn)一步進(jìn)行大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，考察參芎葡萄糖注射液是否具有誘導(dǎo)作用。

為了降低個(gè)體和避免種屬間的差異，本實(shí)驗(yàn)采用人混合肝微粒體作為研究對(duì)象。本研究結(jié)果表明參芎葡萄糖注射液對(duì)人CYP450無(wú)明顯抑制作用，因此臨床上多種藥物與參芎葡萄糖注射液聯(lián)合使用時(shí)，由抑制作用而產(chǎn)生的藥物不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)不大。

4參考文獻(xiàn)

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(2016-02-25收稿，2016-05-14修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAI11B01)； 貴州省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目[黔科合重大專項(xiàng)字(2011)6019號(hào)]； 貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)[黔科合ZY字(2013)3020號(hào);黔科合中藥字(2013)5062號(hào)]； 貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)[黔科合重G字(2013)4001]

[中圖分類號(hào)]R969.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0775-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.007

InvitroInhibition Effects of Shenxiong Glucose Injection on 6 Cytochrome P450 Isoforms in Human Liver Microsome

SUN Jia1,2,3,4, LU Yuan2,3, PAN Jie3, ZHENG Lin2,3, HUANG Yong2,3, WANG Yonglin2,3, LI Yongjun1,3

(1.EngineeringResearchCenterofMinistryofEducationfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China. 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao'sMedicines,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the in vitro inhibition effects of Shenxiong glucose injection on 6 cytochrome P450 isoforms (CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4) in human liver microsome. Methods: Shenxiong glucose injection were incubated with human liver microsomes in the presence of 7 probe substrates for CYP450 isoforms, including phenacetin for CYP1A2, chlorzoxazone for CYP2E1, tolbutamide for CYP2C9, omeprazole for CYP2C19, dextromethorphan for CYP2D6, testosterone and midazolam for CYP3A4. Meanwhile, UPLC-MS/MS was adopted to measure remaining content of corresponding metabolite of CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 (Acetaminophen, chlorzoxazone 6-hydroxylation, hydroxytolbutamide, 5-hydroxy omeprazole, dextrorphan, 6 beta hydroxy testosterone and alpha hydroxy midazolam of midazolam). By comparison with control group, the remaining enzyme activities of cytochrome P450 isoforms were calculated. IC50 values were calculated by GraphPad v5.0 program to evaluate the inhibitory effects. Results: IC50values of Shenxiong glucose injection on CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 were more than 15%. Conclusion: Shenxiong glucose injection don't show inhibitory effect on CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 in human liver microsome.

[Key words]shenxiong glucose injection; cytochrome P450; microsomes，liver; drug interaction

**通信作者 E-mail:392828662@qq.com; liyongjun026@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.012.html