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    對遺傳學診斷的分析

    2016-08-01 15:27:02王谷仙嚴璟
    人間 2016年21期
    關(guān)鍵詞:巢式創(chuàng)性貧血

    王谷仙 嚴璟

    (曲靖醫(yī)學高等專科學校,云南 曲靖 655011)

    對遺傳學診斷的分析

    王谷仙 嚴璟

    (曲靖醫(yī)學高等專科學校,云南 曲靖 655011)

    近二十年來,分子遺傳學的一系列成就,不僅推動了分子生物學和基礎(chǔ)醫(yī)學的發(fā)展,而且對遺傳疾病的診斷和治療,也應(yīng)用了分子遺傳學的新技術(shù)如分子雜交、內(nèi)切酶、DNA重組等進行了探索,并獲得了有意義的結(jié)果。生物遺傳的基本單位是基因,其遺傳信息貯存在DNA(去氧核糖核酸)分子的堿基序列之中。結(jié)構(gòu)基因就是決定特殊蛋白質(zhì)遺傳密碼的DNA的一個片段。

    遺傳學;診斷

    一、運用單細胞雙重巢式PCR和MDA技術(shù)方法行性連鎖遺傳病診斷

    方法1、提取男女單個淋巴細胞各150例,共300個細胞。隨機分成3組,每組男女細胞各50個,雙重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平同時擴增X-類固醇硫酸脂酶基因(steroid sulfatase gene, STS)/Y-假基因和牙釉質(zhì)基因(Amelogenin,AMEL),對照組用單重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平分別擴增兩基因,比較單、雙重巢式PCR技術(shù)在單細胞水平的擴增率及性別診斷正確率。2、應(yīng)用MDA擴增5個單個淋巴細胞和10個單個卵裂球全基因組DNA,1%的瓊脂糖電泳檢測擴增效率,通過普通PCR即上述巢式PCR的第二輪的PCR條件檢測細胞性別來判斷擴增產(chǎn)物的均一性。結(jié)果1、單重巢式PCR擴增男性細胞STS和AMEL的擴增率和細胞性別診斷的正確率分別是84%、76%和84%、84%;而雙重巢式PCR技術(shù)同時擴增上述基因的擴增率和性別診斷正確率分別為98%、96%。后者與前兩者相比擴增率和性別診斷正確率均明顯提高,差異均有統(tǒng)計學意義(P〈0.05、P〈0.01)。2、MDA擴增5個淋巴細胞(3個為男性細胞,2個為女性細胞)全部擴增成功,擴增率100%;MDA擴增10個卵裂球有4個擴出產(chǎn)物,擴增率為40%。以MDA產(chǎn)物為模板,用STS的第二輪引物檢測單個淋巴細胞性別,正確性為100%;檢測所有擴出產(chǎn)物的卵裂球也均能檢測出性別,發(fā)現(xiàn)2個為男性,2個為女性,可惜的是這4個卵裂球均來自不同的胚胎,所以不能相互驗證。從淋巴細胞MDA產(chǎn)物檢測的結(jié)果可以判斷MDA產(chǎn)物也是均一的。結(jié)論1、在單細胞水平性連鎖遺傳疾病診斷中,雙重巢式PCR技術(shù)較單重巢式PCR技術(shù)具有較高的擴增率及診斷正確率,并有助于發(fā)現(xiàn)等位基因脫扣(allele dropout, ADO)。該法在無創(chuàng)性單基因伴性遺傳病的產(chǎn)前診斷和植入前遺傳學診斷中具有較高的實際應(yīng)用價值,且經(jīng)濟、便捷,值得臨床進一步推廣。2、初步預(yù)實驗可知MDA可以克服單細胞的模板量少和不可重復(fù)實驗的缺點。但由于此次預(yù)實驗的樣本量太小,其穩(wěn)定性、可靠性還需進一步摸索,才可以用于單基因病的著床前遺傳學診斷和產(chǎn)前診斷。

    二、利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行無創(chuàng)性地中海貧血產(chǎn)前基因診斷的研究

    方法:收集157例孕婦的外周血,利用柱吸收的方法提取血漿中的cffDNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離富集小片段cffDNA,使用二重PCR反應(yīng)(dulex-PCR)檢測SRY基因和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceroldehyde-phosphatedehydrogenase,GAPDH)基因。結(jié)果來源于86例孕男胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA均檢出SRY和GAPDH基因,來源于71例孕女胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA只檢出GAPDH基因。與絨毛/羊水標本檢測結(jié)果以及產(chǎn)后隨訪結(jié)果相符。特異性和敏感性分別為100%(157/157)和100%(86/86)。結(jié)論利用瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收,可以選擇性富集孕婦外周血中的小片段cffDNA,相對地提高胎兒DNA的含量,結(jié)合二重PCR擴增SRY基因技術(shù)可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前性連鎖遺傳疾病和單基因突變疾病的產(chǎn)前診斷。第二部分利用孕婦外周血漿中cffDNA進行STR-PCR檢測胎兒基因型目的:利用小片段cffDNA進行D5S818、D7S820、D13S317三個短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)基因型的分析,觀察提取出來的小片段cffDNA中母源性DNA背景對實驗的影響。方法:收集了62例孕婦外周血標本,提取小片段游離胎兒DNA,利用多重PCR(mutilplex-PCR)的方法分析胎兒的STR基因型,并與父母基因型相比對。結(jié)果:62例小片段cffDNA的擴增結(jié)果中,49例標本的擴增結(jié)果完全與父母基因型相匹配,未發(fā)現(xiàn)母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的擴增中出現(xiàn)了母源性DNA的污染。結(jié)論:經(jīng)過對小片段cffDNA進行富集后,仍有可能出現(xiàn)母源性DNA對實驗的影響,并且可能影響對實驗結(jié)果的判讀。使用多重PCR反應(yīng)結(jié)合多基因座的擴增,可能可以有助于減少母源性DNA的影響,有助于結(jié)果的判讀。第三部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行β-地中海貧血無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷目的:利用cffDNA對胎兒進行廣西、廣東地區(qū)常見的17種β-地中海貧血基因型的檢測,與傳統(tǒng)創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷相比較,探討該方法的準確性和可行性。方法:針對廣西、廣東地區(qū)常見的β-地中海貧血突變的基因型設(shè)計三對不同引物,并用生物素標記。對cffDNA進行二次PCR反應(yīng)后,使用反向斑點雜交(revert dot-blot hybridization,RDB)檢測胎兒的β-珠蛋白基因型,與創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較,觀察準確率。結(jié)果:37例cffDNA標本檢測中,檢出重型β-地中海貧血19例,輕型β-地中海貧血11例,正常7例,與創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷結(jié)果相比較出現(xiàn)3例誤診,準確率為91.9%(34/37)。結(jié)論:利用cffDNA進行β-地中海貧血的檢測,可能出現(xiàn)母源性DNA背景的污染,當胎兒基因型與母親基因型相同時,必須提高警惕,進一步分析或者復(fù)查。因為該技術(shù)取樣容易,對孕婦胎兒無風險,不受孕期時間影響,易為與孕婦接受,因此進一步改進該技術(shù)后有望可用于β-地中海貧血的診斷。第四部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行巴氏水腫胎兒檢測目的:通過檢測cffDNA以及母源性cfDNA 在PCR反應(yīng)中擴增效率的不同,進行檢測巴氏水腫胎兒(Hb Bart’s hydrops foetus)的方法學研究。方法:對來源于擬診孕水腫胎兒孕婦的小片段cffDNA,進行熒光PCR(Fluorescence PCR)擴增,利用毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)技術(shù)判斷兩種產(chǎn)物峰面積比(peak area ratio)來檢測巴氏水腫胎兒。結(jié)果:30例擬診巴氏水腫胎兒的小片段cffDNA擴增結(jié)果提示,巴氏水腫胎兒兩種產(chǎn)物鋒面積比遠遠<1。而其他原因所致的水腫胎兒的cffDNA模板擴增結(jié)果顯示兩種產(chǎn)物封面值比近似等于1。結(jié)論:通過熒光PCR和毛細管電泳的方法,有望利用cffDNA進行巴氏水腫胎兒的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。

    [1]嚴提珍.利用母體血漿游離的胎兒DNA通過缺失斷裂點內(nèi)父源SNP的檢測進行純合α~0-地中海貧血的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前排除診斷[D].南方醫(yī)科大學 2011

    [2]胡華.芯片毛細管電泳檢測β-地中海貧血及無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究[D].第三軍醫(yī)大學 2012

    [3]陳振斌.唐氏綜合征的基因診斷及其無創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷的初步研究[D].福建醫(yī)科大學 2013

    R394

    A

    1671-864X(2016)07-0265-01

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