黃芩苷對(duì)肝臟缺血再灌注損傷大鼠誘生型一氧化氮合酶、核轉(zhuǎn)錄因子和Caspase-3表達(dá)的影響

章寶燕，林擁華，林志強(qiáng)，張國偉，陳婷婷

1.泉州市第一醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000

黃芩苷對(duì)肝臟缺血再灌注損傷大鼠誘生型一氧化氮合酶、核轉(zhuǎn)錄因子和Caspase-3表達(dá)的影響

章寶燕1，林擁華2，林志強(qiáng)1，張國偉1，陳婷婷1

1.泉州市第一醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建 泉州 362000

目的觀察黃芩苷對(duì)肝臟缺血再灌注損傷大鼠肝組織形態(tài)、肝細(xì)胞凋亡、誘生型一氧化氮合酶（iNOS）和核因子（NF）-κB mRNA表達(dá)及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法采用Pringle's法建立大鼠肝臟缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃芩苷組，假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃，黃芩苷組給予黃芩苷灌胃。觀察大鼠肝臟組織病理形態(tài)，TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，RT-PCR檢測肝組織iNOS、NF-κB mRNA表達(dá)，Western blot檢測Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組iNOS和NF-κB mRNA表達(dá)、Caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷組iNOS和NF-κB mRNA表達(dá)、Caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)下降（P＜0.05），肝損害明顯改善。結(jié)論黃芩苷通過下調(diào)肝組織iNOS和NF-κB的表達(dá)、抑制Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血再灌注損傷大鼠肝臟發(fā)揮保護(hù)作用。

黃芩苷；保肝作用；缺血再灌注損傷；誘生型一氧化氮合酶；核因子-κB；Caspase-3蛋白；大鼠

肝臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）臨床常見，可引起嚴(yán)重的肝臟和臨近器官衰竭。IRI后體內(nèi)活性氧（ROS）增加，刺激肝臟枯否細(xì)胞合成核因子（NF）-κB，激發(fā)促炎因子“級(jí)聯(lián)反應(yīng)”，引起肝細(xì)胞損傷。凋亡也是IRI引起細(xì)胞損傷的重要原因之一，其主要機(jī)制與Caspase-3介導(dǎo)的線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制有關(guān)。研究表明，一氧化氮（NO）在IRI過程具有重要作用，其合成受酶的影響，由誘生型一氧化氮合酶（iNOS）催化產(chǎn)生的NO在IRI過程中發(fā)揮細(xì)胞損傷作用［1］。黃芩的主要有效成分黃芩苷具有抗炎、抗菌作用。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠肝臟IRI模型，觀察黃芩苷對(duì)肝臟IRI大鼠肝組織形態(tài)、肝細(xì)胞凋亡、iNOS及NF-κB mRNA表達(dá)、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250g，中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（滬）2012-0001。飼養(yǎng)于明暗交替12 h/12 h清潔環(huán)境，自由飲食飲水。

1.2 藥物

黃芩苷，Sigma公司，純度＞95%，批號(hào)21967-41-9。

1.3 主要試劑與儀器

總RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國），dNTPs、Taq DNA聚合酶和一步法TUNEL試劑盒（美國Promega公司），兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)志羊抗兔多克隆抗體、GAPDH（Santa Cruz公司），總蛋白抽提試劑盒（南京凱基生物技術(shù)公司）。光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司），石蠟切片機(jī)（美國 Beckman），基因擴(kuò)增儀（BIO-RAD Myeyeler），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Heraeus instrnnlents，德國），穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀、水平電泳槽、紫外分光度計(jì)（BIO-RAD，美國），蛋白核酸分析儀（Beckman，德國）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

采用Pringle's法建立肝臟缺血再灌注模型［2］。大鼠禁食 12 h，自由飲水，并預(yù)先經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.5%肝素生理鹽水（2 mg/kg）行肝素化，術(shù)前用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，常規(guī)消毒術(shù)野，上腹部劍突下切口切開進(jìn)腹，游離肝臟，分離門靜脈、肝動(dòng)脈和膽總管，使用無損傷血管夾阻斷肝左、中葉的血流，直至肝葉變白，阻斷30 min，恢復(fù)血流為再灌注；假手術(shù)組打開腹腔、游離肝臟后即關(guān)腹。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃芩苷組，各組均于術(shù)前30 min經(jīng)大鼠尾靜脈給藥。假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水2mL灌胃，黃芩苷組給予黃芩苷溶液200 mg/kg灌胃。各組均于再灌注后6 h留取肝組織標(biāo)本。麻醉狀態(tài)下打開大鼠腹腔，留取大小約1 cm×1 cm×1 cm肝中葉組織2塊，一塊快速置于10%中性甲醛中固定24 h保存?zhèn)溆?；另一塊修剪成大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm肝組織3塊，標(biāo)記后迅速放入液氮罐中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肝組織病理觀察

取出中性甲醛固定肝組織塊，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察肝組織形態(tài)。

2.4 肝細(xì)胞凋亡檢測

TUNEL法檢測肝臟凋亡細(xì)胞，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。鏡下觀察凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。AI（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 RT-PCR檢測肝組織一氧化氮合酶、核因子-κB mRNA表達(dá)

采取 Trizol一步法，按照試劑盒說明制備總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光度儀鑒定后，將總RNA依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列見表1。iNOS反應(yīng)條件：94 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；NF-κB反應(yīng)條件：94 ℃變性15 s、60℃退火35 s、72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)。分別取8 μL Marker、產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠膜上電泳30 min，置于凝膠成像分析儀中，于254 nm處紫外燈下照相，分析電泳圖中條帶灰度得出數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)標(biāo)本 iNOS、NF-κB、β-actin的灰度比值，對(duì)其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

表1 PCR引物序列

2.6 Western-bol t檢測肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)

按照試劑盒說明書提取各組總蛋白，BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。根據(jù)濃度上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉TBST液常溫封閉1 h后，分別加一抗（Caspase-3，1∶1000）4 ℃孵育過夜，次日TBST漂洗后，加二抗（1∶2000）常溫孵育1 h，再TBST漂洗，ECL化學(xué)發(fā)光液孵育后曝光。應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行灰度掃描分析，結(jié)果以Caspase-3/GAPDH比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 肝組織病理觀察結(jié)果

假手術(shù)組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，界板排列整齊，匯管區(qū)無增寬、破壞，未見肝細(xì)胞變性及炎細(xì)胞浸潤；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇瘀血明顯，肝竇狹窄，肝索排列嚴(yán)重不規(guī)則，中央靜脈周圍肝細(xì)胞腫脹及空泡樣變性、有明顯點(diǎn)狀壞死，肝竇內(nèi)大量炎性細(xì)胞聚集、浸潤；黃芩苷組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和肝血竇瘀血程度較模型組輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞變性不明顯，炎性細(xì)胞浸潤較少，肝細(xì)胞輕度腫脹，未見明顯肝細(xì)胞壞死。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)（HE染色，×200）

4.2 黃芩苷對(duì)模型大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

假手術(shù)組肝實(shí)質(zhì)幾乎未見凋亡肝細(xì)胞；模型組肝實(shí)質(zhì)內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯增多，主要集中于中央靜脈周圍，匯管區(qū)亦可見凋亡細(xì)胞；黃芩苷組肝實(shí)質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖2。模型組和黃芩苷組肝細(xì)胞AI均較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01），見表1。

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡病理形態(tài)（TUNEL染色，×200）

表1各組大鼠肝細(xì)胞AI比較（±s，%）

表1各組大鼠肝細(xì)胞AI比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01

假模黃組別手術(shù)組型組芩苷組只數(shù)20 20 20 AI 0.5±0.05 20.0±5.00**16.0±3.00**

4.3 黃芩苷對(duì)模型大鼠肝組織一氧化氮合酶、核因子--κB mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組iNOS、NF-κB mRNNA水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷組iNOS、NF-κB mRRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織iNOSS、NF-κB mRNA 表達(dá)

4.4 黃芩苷對(duì)模型大鼠Cassppase-3蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷組Caspaase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.005）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠肝組織Caspase-3蛋白表達(dá)

5 討論

研究表明，黃芩及其有效成分對(duì)心肌、腦組織及肝臟IRI具有保護(hù)作用［3-5］，其有效成分包括3種黃酮類化合物即漢黃芩素、黃芩素元和黃芩苷［6］。黃芩苷預(yù)處理的時(shí)機(jī)及濃度文獻(xiàn)報(bào)道不一。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及其藥代動(dòng)力學(xué)資料，我們選擇造模前30 mmin進(jìn)行預(yù)處理［7］。結(jié)果顯示，黃芩苷干預(yù)后大鼠受損肝臟病理學(xué)表現(xiàn)明顯改善。

肝臟IRI發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著顯著的炎癥反應(yīng)，缺血后局部產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、黏附分子、代謝產(chǎn)物、補(bǔ)體等。研究顯示，下調(diào) iNOS的表達(dá)可減少其產(chǎn)物NO的生產(chǎn)，在肝臟 IRI過程中發(fā)揮保護(hù)作用。NOS是NO的合成限速酶，是調(diào)節(jié)NO合成的重要因素，由iNOS催化產(chǎn)生的NO在IRI過程中發(fā)揮細(xì)胞損傷作用。研究顯示，黃芩苷可在iNOS激活的后期階段發(fā)揮抑制作用，抑制NO的過量生產(chǎn)［10］，提示黃芩苷可能是iNOS合成的潛在抑制因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷干預(yù)后，大鼠IRI肝臟組織中性細(xì)胞浸潤減少，iNOS、NF-κB基因表達(dá)水平降低。有研究表明，NF-κB是許多編碼促炎癥介質(zhì)的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，黃芩苷可抑制NF-κB的激活［8］。

缺血性細(xì)胞死亡主要有2個(gè)途徑——細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，其中凋亡被認(rèn)為在IRI的發(fā)展結(jié)局中具有重要的作用。本研究應(yīng)用TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠IRI 6 h后，肝細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰期，凋亡肝細(xì)胞主要集中于肝小葉中央?yún)^(qū)，表現(xiàn)為核染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)凝固、細(xì)胞核和細(xì)胞膜扭曲。黃芩苷干預(yù)后，末端標(biāo)記陽性肝細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示黃芩苷可能通過抑制細(xì)胞凋亡限制肝細(xì)胞的延遲性死亡。Caspase-3是Caspase依賴細(xì)胞凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的最終效應(yīng)器。而且，有研究表明，Caspase-3在大鼠冷IRI的肝臟中表達(dá)、激活和降解［10］。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷可顯著抑制Caspase-3在IRI 6 h后大鼠肝臟中的表達(dá)水平。

總之，黃芩苷在大鼠肝臟經(jīng)歷IRI后發(fā)揮保護(hù)作用，其抗炎和抗凋亡作用可能與下調(diào)受損肝臟組織iNOS、NF-κB、Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Baicalin on iNOS， NF-κB and Caspase-3 in Liver Ischem ia Reperfusion Injury Rats

ZHANG Bao-yan1， LIN Yong-hua2， LIN Zhi-qiang1， ZHANG Guo-wei1， CHEN Ting-ting1
（1. The First Hospital of Quanzhou， Quanzhou 362000， China； 2. The Second Hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000， China）

ObjectiveTo observe the effects of baicalin on forms of hepatic tissue， liver apoptosis， mRNA expressions of iNOS， NF-κB and protein expression of Caspase-3 in rats with ischemia reperfusion injury； To discuss its mechanism of action.MethodsThe rat models of liver ischemia reperfusion were performed according to the Pringle's method. Rats were random ly divided into sham-operation group， model group and baicalin group. Sham-operation group and model group were given normal saline for gavage， while baicalin group was given baicalin for gavage. Morphological characteristic was observed by HE staining. Hepatocyte apoptosis was determ ined by TUNEL. The mRNA expressions of iNOS and NF-κB were determined by RT-PCR. The protein expression of Caspase-3 was determined by Western blot.ResultsCompared with the sham-operation group， mRNA expressions of iNOS and NF-κB and the protein expression of Caspase-3 in the model group increased， as well as liver apoptosis rate（P＜0.05，P＜0.01）； compared with the model group， mRNA expressions of iNOS and NF-κB and the protein expression of Caspase-3 in the baicalin group decreased， as well as liver apoptosis rate （P＜0.05）， and the hepatic lesion significantly improved in the baicalin group.ConclusionBaicalin can restrain Caspase-3 induced apoptosis by reducing the expressions of iNOS and NF-κB， with a purpose to realize the hepatoprotective effect for liver of rats with ischem ia reperfusion injury.

baicalin； hepatoprotective effect； ischemia reperfusion injury； iNOS； NF-κB； Caspase-3 protein； rats

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0060-04

2015-08-03）

（

2015-09-08；編輯：華強(qiáng)）

泉州市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（2011Z58）

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.016