育腎助孕方對(duì)雷公藤多苷致卵巢儲(chǔ)備下降大鼠卵巢形態(tài)和性激素的影響

金毓莉，張婷婷，許華云，袁雪菲，蔡小蓀

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437

育腎助孕方對(duì)雷公藤多苷致卵巢儲(chǔ)備下降大鼠卵巢形態(tài)和性激素的影響

金毓莉1，張婷婷2，許華云1，袁雪菲2，蔡小蓀1

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437

目的觀察育腎助孕方對(duì)雷公藤多苷致卵巢儲(chǔ)備功能下降大鼠卵巢組織形態(tài)和性激素的影響，探討其作用機(jī)制。方法采用雷公藤多苷藥液灌胃制作卵巢儲(chǔ)備功能下降大鼠模型。48只雌性 SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組及育腎助孕方低、中、高劑量組，育腎助孕方各劑組分別給予低、中、高濃度育腎助孕方藥液灌胃，陽性藥組給予戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)14 d。觀察大鼠一般情況，取卵巢稱重并計(jì)算臟器指數(shù)，HE染色觀察卵巢組織形態(tài)，放射免疫法檢測血清雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）水平，酶聯(lián)免疫吸附法檢測抑制素 B（INHB）、抗苗勒管激素（AMH）水平。結(jié)果與空白組比較，模型組卵巢組織萎縮，各級(jí)卵泡數(shù)目減少，卵巢指數(shù)和 E2、INHB、AMH水平降低，F(xiàn)SH、LH水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，育腎助孕方高劑量組卵巢組織形態(tài)明顯改善，各級(jí)卵泡和黃體增加，閉鎖卵泡減少；卵巢指數(shù)和E2、INHB、AMH水平升高，F(xiàn)SH、LH水平降低（P＜0.01），且INHB與AMH具有顯著相關(guān)性（P＜0.01）。結(jié)論育腎助孕方可調(diào)節(jié)性激素水平，促進(jìn)卵泡生長和分泌，抑制卵泡閉鎖，從而改善卵巢儲(chǔ)備功能。

育腎助孕方；卵巢儲(chǔ)備功能；抑制素B；抗苗勒管激素；大鼠

卵巢儲(chǔ)備功能（ovarian reservation，OR）是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長、發(fā)育、形成可受精卵泡的能力，反映女性的生育潛能和生殖內(nèi)分泌功能。卵巢儲(chǔ)備功能下降（decreasing ovarian reservation，DOR）是指卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)量減少，卵巢產(chǎn)生卵子能力減弱，卵泡質(zhì)量下降，導(dǎo)致女性生育能力下降［1］，表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕，甚至卵巢早衰等。其臨床發(fā)病率呈上升趨勢，也是目前引起不孕的主要原因之一。中醫(yī)藥在治療不孕不育癥、調(diào)整女性生殖內(nèi)分泌功能失調(diào)性疾病方面有獨(dú)到之處，療效得到肯定。育腎助孕方為蔡氏婦科第7代嫡系傳人蔡小蓀教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著［2］。本實(shí)驗(yàn)觀察該方對(duì)DOR大鼠卵巢組織形態(tài)的影響和相關(guān)性激素水平的調(diào)節(jié)作用，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

48只清潔級(jí)健康雌性SD大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～280g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于上海市第一人民醫(yī)院清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水和攝食。

1.2 藥物

育腎助孕方（熟地黃10g，山萸肉10g，醋龜甲10g，茯苓12g，鹿角霜10g，淫羊藿10g，巴戟天10g，肉蓯蓉10g），上述飲片均為中藥免煎顆粒劑，廣州一方中藥廠，用純凈水配制成低、中、高3個(gè)濃度混懸藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。雷公藤多苷片，江蘇美通制藥有限公司，10 mg/片，批號(hào)131029；戊酸雌二醇片，Delpharm Lille S.A.S，批號(hào)089A2。

1.3 主要試劑與儀器

雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）放射免疫分析藥盒，北京北方生物科技研究所；抑制素（INH）B、抗苗勒氏管激素（AMH）酶聯(lián)免疫試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司。酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司）。

1.4 造模、分組及給藥

參照文獻(xiàn)［3］方法，采用雷公藤多苷藥液灌胃制作DOR大鼠模型。配制 50 mg/mL雷公藤多苷藥液及0.05 mg/mL濃度戊酸雌二醇藥液。48只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組和育腎助孕低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組 8只。給藥劑量根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”［4］計(jì)算，中藥低、中、高劑量組分別按臨床等效劑量的0.5倍（0.69g/kg）、1倍（1.38g/kg）和2倍（2.76g/kg）給藥。每日9∶00時(shí)，造模組灌服雷公藤多苷藥液，15∶00時(shí)中藥低、中、高劑量組分別予不同濃度育腎助孕方藥液灌胃，陽性藥組予戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為12mL/kg，連續(xù)14 d。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 一般狀況觀察 觀測大鼠體質(zhì)量、飲食、活動(dòng)、動(dòng)情周期，計(jì)算卵巢指數(shù)。卵巢指數(shù)（%）=卵巢質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。

1.5.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 采血后斷頭處死大鼠，立即開腹取出卵巢，稱重，福爾馬林固定，24 h內(nèi)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.5.3 雌二醇、促卵泡刺激素、睪酮檢測 腹腔注射10%水合氯醛（0.6mL/只）麻醉，腹主動(dòng)脈取血后迅速置于促凝管中，室溫下靜置1 h，3000 r/min離心10 min，取血清待用。放射免疫法檢測E2、FSH、T，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5.4 抑制素B、抗苗勒管激素檢測 取上述血清，ELISA檢測INHB、AMH，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀況結(jié)果

空白組大鼠飲食與活動(dòng)基本無變化，給藥結(jié)束時(shí)體質(zhì)量正常增加，動(dòng)情周期平均每次4～5 d；模型組大鼠飲食量減少，喜蜷縮，對(duì)刺激反應(yīng)淡漠，給藥結(jié)束時(shí)體質(zhì)量增加相對(duì)減少，毛色黯淡、光澤減少，大多數(shù)無動(dòng)情周期。陽性藥組及中藥高劑量組體質(zhì)量基本正常，飲食、活動(dòng)無明顯變化，動(dòng)情周期為55～6 dd；中藥低、中劑量組飲食略有減少，自發(fā)性活動(dòng)略有減少，給藥結(jié)束時(shí)體質(zhì)量增加略有減少，動(dòng)情周期分別為7～9 d、6～7 d。與空白組比較，模型組卵巢指數(shù)下降（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組卵巢指數(shù)均升高，除中藥低劑量組外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01））。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)比較（±ss）

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)比較（±ss）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01

只數(shù)組別 卵巢指數(shù)/%空白組80.0072±0.005模 陽中中中型組性藥組藥低劑量組藥中劑量組藥高劑量組88888 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 62±0.006**72±0.003▲67±0.005 68±0.006▲71±0.005▲▲

2.2 卵巢組織病理觀察結(jié)果

空白組卵巢皮質(zhì)與髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，可見各級(jí)卵泡（原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡），卵泡形態(tài)、數(shù)量正常，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液含量多，黃體數(shù)目正常，有的可見多個(gè)黃體，發(fā)育好、體積大、色澤鮮艷，間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤和纖維化，血管豐富；模型組部分卵巢見萎縮，各期卵泡數(shù)均減少，閉鎖卵泡明顯增多，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少、排列紊亂，部分黃體數(shù)目減少，且黃體周邊和間質(zhì)區(qū)見有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，未見明顯纖維化；陽性藥組織形態(tài)學(xué)接近空白組，但閉鎖卵泡明顯增多；中藥低劑量組見各級(jí)卵泡，但數(shù)目比空白組少，黃體數(shù)目也減少，間質(zhì)見少量炎細(xì)胞；中藥中劑量組織形態(tài)接近空白組，有少量閉鎖卵泡；中藥高劑量組織形態(tài)接近空白組，各級(jí)卵泡數(shù)目類似，顆粒細(xì)胞層次豐富，黃體數(shù)目較多，間質(zhì)未見炎細(xì)胞。結(jié)果見圖11。

圖1 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)（HE染色，×400）

2.3 育腎助孕方對(duì)模型大鼠血清雌二醇、促卵泡刺激素和睪酮水平的影響

與空白組比較，模型組EE2水平下降，F(xiàn)SH、T水平上升（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高劑量組E2水平升高（P＜0..01），中藥中、高劑量組FSH、T水平降低（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清E2、FSHH、T水平比較（光±s）

表2 各組大鼠血清E2、FSHH、T水平比較（光±s）

注：與空白組比較，***P＜0.01；與模型組比較，▲▲P ＜0.01

別 只數(shù) E22/（pg/mL） F組FSH/（mIU/L）T/（ng/mL）空白組8 5822.47±40.583.80±0.687.06±1.26模型組陽性藥組中藥低劑中藥中劑中藥高劑8 390 8 503量組 8 394量組 8 418量組 8 465 .11±51.67**.14±49.89▲▲.98±37.94 .28±49.01 .16±57.82▲▲9.19±0.89**5.96±0.65▲▲8.66±1.05 7.88±0.50▲▲6.93±0.94▲▲18.26±2.40**11.13±2.27▲▲16.53±2.38 13.45±3.25▲▲12.32±2.76▲▲

2.4 育腎助孕方對(duì)模型大鼠抑制素B和抗苗勒管激素水平的影響

與空白組比較，模型組INNHB、AMH水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥中、高劑量組INHB、AMH水平明顯升高（P＜0.01），見表3。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，rr值為0.861，P＜0.01，見圖2。

表3 各組大鼠血清INHB、AMHH 水平比較（±ss，ng/L）

表3 各組大鼠血清INHB、AMHH 水平比較（±ss，ng/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 只數(shù) INHB AMH空白組 843.06±2.6916.72±1.17模型組陽性藥中藥低中藥中中藥高 8組 8劑量組 8劑量組 8劑量組 8 26.49± 35.81± 27.14± 32.27± 35.87± 1.85**2.15▲▲1.51 2.27▲▲2.93▲▲9.76±0.96**14.11±1.25▲▲10.25±0.64 12.02±0.61▲▲14.83±0.94▲▲

圖2 INHB與AMMH相關(guān)分析

3 討論

中醫(yī)學(xué)無“卵巢儲(chǔ)備功能下降”病名，根據(jù)其癥狀，可歸屬于“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”等范疇。究其病因，主要為腎精不足。腎藏精，主生長發(fā)育和生殖?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈吩敿?xì)論述了女子以七、男子以八為基數(shù)遞進(jìn)的生長、發(fā)育、衰老的腎氣盛衰規(guī)律，明確指出機(jī)體的生、長、壯、老、已，受腎中精氣的調(diào)節(jié)，腎中精氣充盛，天癸成熟，故月經(jīng)來潮而有子，標(biāo)志著女性卵巢生殖周期活動(dòng)的開始；腎中精氣衰退、天癸耗竭，則月經(jīng)閉絕，形壞而無子，提示女性卵巢生殖功能的結(jié)束。因此，腎中精氣對(duì)于生殖機(jī)能低下及過早衰退的病癥，均有較普遍的意義。卵巢儲(chǔ)備功能低下，究其病因，屬于機(jī)體腎氣不足。育腎助孕方為蔡小蓀教授創(chuàng)制用于不孕癥的基礎(chǔ)方劑。近年來，應(yīng)用于DOR患者行輔助生殖技術(shù)前調(diào)治，具有良好療效。蔡教授認(rèn)為，孕育與腎氣關(guān)系密切，不孕多責(zé)之于腎?！坝I”為蔡老師補(bǔ)益腎精術(shù)語，注重補(bǔ)益，因生育以精血為本，育腎之“育”字蘊(yùn)含增加孕育功能之意，并強(qiáng)調(diào)陰陽互濟(jì)不可偏補(bǔ)［5］，其主要用藥為六味地黃丸中茯苓、熟地黃和山萸肉，配以龜鹿二仙湯中龜甲和鹿角霜，淫羊藿補(bǔ)腎壯陽取之二仙湯含義，再配以巴戟天和肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽，增強(qiáng)補(bǔ)益腎精之效。

有研究顯示，補(bǔ)腎中藥能改善生殖內(nèi)分泌激素環(huán)境，提高卵細(xì)胞質(zhì)量和卵裂能力，改善卵巢血供，具有促卵泡成熟的作用［6］。補(bǔ)腎藥具有的類激素樣作用，可改善雌激素分泌不足，提高子宮內(nèi)膜容受性［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，育腎助孕方能增加模型大鼠的卵巢指數(shù)，增加各級(jí)卵巢數(shù)目，減少閉鎖卵泡數(shù)目；升高模型大鼠E2水平，降低FSH、T水平；升高INHB和AMH水平。通過本研究，提示育腎助孕方在一定程度上逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷引起的大鼠卵巢儲(chǔ)備功能下降，促進(jìn)卵泡的發(fā)育和分泌。

卵泡顆粒細(xì)胞的增殖、分化在卵泡發(fā)育過程中起著重要的作用，也是雌激素合成的場所，INH是卵巢顆粒細(xì)胞分泌的蛋白激素，分為INHA和INHB，其中INHB由中小竇狀卵泡分泌，可作為預(yù)測卵巢儲(chǔ)備的標(biāo)志。研究表明，在卵巢儲(chǔ)備功能減退時(shí)，INHB先于FSH產(chǎn)生變化［8］，INHB水平降低是女性卵泡減少、卵巢老化的最早標(biāo)志，同時(shí)INHB對(duì)FSH負(fù)反饋的減弱是早期 FSH水平增高的最重要反應(yīng)，其在年齡上的變化也早于FSH水平。AMH僅有生長的卵泡顆粒細(xì)胞分泌，因而僅在卵巢表達(dá)，是早期準(zhǔn)確反映卵巢儲(chǔ)備功能的理想指標(biāo)［9］。AMH能很好地反映始基卵泡數(shù)量，隨著年齡增長，AMH水平逐漸下降。一般認(rèn)為，將INHB與AMH結(jié)合起來評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能更為理想［10］。本研究中，育腎助孕方促進(jìn)卵泡發(fā)育，從而提升模型大鼠INHB和AMH水平，進(jìn)而升高E2水平，降低FSH水平，達(dá)到改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用。育腎助孕方通過改善卵巢儲(chǔ)備功能從而改善女性的生活質(zhì)量。

［1］ 許小鳳，談?dòng)?，陳宣?卵巢儲(chǔ)備功能下降中醫(yī)證治思路和優(yōu)勢［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（12）：88-89.

［2］ 王隆卉，蔡小蓀.蔡小蓀育腎調(diào)周法治療不孕癥的經(jīng)驗(yàn)［J］.世界中醫(yī)藥，2011，6（5）：396-397.

［3］ 許小鳳，談?dòng)拢瓏鴺s，等.補(bǔ)腎助孕中藥干預(yù)雷公藤多甙致卵巢儲(chǔ)備下降大鼠卵巢功能的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（11）：1225-1227.

［4］ 黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9（9）：1069-1072.

［5］ 金毓莉，張婷婷，翁雪松，等.蔡小蓀三步助孕法在體外受精-胚胎移植技術(shù)中的應(yīng)用［J］.中醫(yī)雜志，2014，55（18）：1547-1550.

［6］ 溫勤堅(jiān)，王芳，李英勇.補(bǔ)腎中藥對(duì)不孕癥治療機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.生殖與避孕，2008，5（5）：304-307，317.

［7］ 劉慧萍，肖藝，李玲，等.補(bǔ)腎活血方對(duì)卵巢早衰小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（4）：47-50.

［8］ 沈健，馮云.抑制素B在人類配子發(fā)生中的意義［J］.生殖與避孕，2005，25（6）：353-357.

［9］ van ROOIJ， BROEKMANS F J， te VELDE E R， et al. Serum anti-Mül lerian hormone levels：a novel measure of ovarian reserve［J］. Hum Reprod，2002，17（12）：3065-3071.

［10］ 李瑩，楊曉慶，楊曉葵.抗苗勒管激素和抑制素B預(yù)測卵巢儲(chǔ)備功能的臨床研究［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2014，30（1）：26-29.

Effects of Yushen Zhuyun Prescription on Ovarian Morphology and Sex Hormone of Rats with Decreased Ovarian Reservation Induced by Tripterygium G lycosides

JIN Yu-li1，ZHANG Ting-ting2， XU Hua-yun1， YUAN Xue-fei2， CAI Xiao-sun1
（1. Shanghai First People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200080， China； 2. Yueyang Hospital of Integrative Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China）

ObjectiveTo observe the effects ofYushen ZhuyunPrescription on ovarian morphology and sex hormone of rats with decreased ovarian reservation （DOR） induced by tripterygium glycosides； To explore its mechanism of action.MethodsTripterygium glycosides solution was used to establish DOR model rats by gastric gavage. 48 female SD rats were random ly divided into blank group， model group， positive medicine group andYushen ZhuyunPrescription low-， medium- and high-dose groups.Yushen ZhuyunPrescription groups were given the low，medium， high dosagesYushen ZhuyunPrescription liquid； positive medicine group were given estradiol valerate liquid； model group and blank control group were given normal saline with the same amount， by gavage 2 times per day for 14 consecutive days. The general condition of the rats was observed； ovarian was weighed and the viscera index was calculated； ovarian morphology was observed by HE staining； the levels of serum estradiol （E2）， follicle stimulating hormone （FSH） and testosterone （T） were detected by radioimmunoassay； the levels of inhibin B （INHB）and anti Mullerian hormone （AMH） were detected by ELISA.ResultsCompared with the blank group， ovarian tissue atrophied； the number of follicles was reduced； ovarian index and the level of E2， INHB and AMH decreased； the levels of FSH and LH increased in the model group （P＜0.01）. Compared with the model group， ovarian tissuemorphology improved significantly； the number of follicle and corpus luteum increased； follicular atresia was reduced； ovarian index and the levels of E2， INHB， and AMH increased； the levels of FSH and LH decreased inYushen ZhuyunPrescription high-dose group （P＜0.01）. INHB and AMH had significant correlation （P＜0.01）.ConclusionYushen ZhuyunPrescription can regulate hormone levels， promote the grow th and secretion of follicle，and inhibit follicular atresia， thereby improve ovarian reserve function.

Yushen ZhuyunPrescription； ovarian reservation； inhibin B； anti Mullerian hormone； rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.015

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0056-04

2015-07-24）

（

2015-08-16；編輯：華強(qiáng)）

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)學(xué)術(shù)流派傳承工作室（2013年）；國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)?？瀑Y助項(xiàng)目（ZK0901FK012）；上海市進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃（ZY3-CCCX-1-1006）

張婷婷，E-mai l：tingting185@al iyun.com