“正常體質(zhì)-腎虛體質(zhì)-腎虛證候”唾液生化指標(biāo)變化研究

李翠娟，劉子瑄，孫理軍，鞏振東

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

“正常體質(zhì)-腎虛體質(zhì)-腎虛證候”唾液生化指標(biāo)變化研究

李翠娟，劉子瑄，孫理軍，鞏振東

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

目的探討“正常體質(zhì)-腎虛體質(zhì)-腎虛證候”動態(tài)演變過程中唾液生化指標(biāo)的變化。方法24只3月齡SD大鼠，雌雄各半，分組配對合籠，使雌鼠受孕。將孕鼠隨機分為Ⅰ、Ⅱ組，每組6只。Ⅰ組孕鼠孕期不恐嚇，正常喂養(yǎng)，分娩后隨機抽取20只雌雄各半仔鼠作為正常對照組和腎虛證候組，每組10只。Ⅱ組孕鼠從妊娠第2日開始給予恐嚇，直到仔鼠出生，隨機抽取10只雌雄各半仔鼠作為腎虛體質(zhì)組。各組仔鼠正常條件喂養(yǎng)6周后，腎虛證候組每日肌肉注射氫化可的松25 mg/kg體質(zhì)量，正常對照組和腎虛體質(zhì)組注射等量生理鹽水，連續(xù)10 d。觀察各組大鼠唾液生化指標(biāo)變化。結(jié)果與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組、腎虛證候組大鼠唾液pH值升高（P＜0.01）；腎虛體質(zhì)組大鼠唾液肌酸激酶（CK）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）降低，鉀（K）、磷（P）、總蛋白（TP）、唾液淀粉酶（AMY）升高；腎虛證候組大鼠CK、ALT、AST、ALP、乳酸脫氫酶（LDH）降低，K、P、TP、AMY升高（P＜0.05，P＜0.01）。與腎虛體質(zhì)組比較，腎虛證候組大鼠唾液LDH活性下降（P＜0.05）。結(jié)論腎虛體質(zhì)組與腎虛證候組大鼠唾液成分發(fā)生變化。

正常體質(zhì)；腎虛體質(zhì)；腎虛證候；唾液生化指標(biāo)；大鼠

體質(zhì)是在先天遺傳和后天獲得因素作用下所形成的人類個體在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理活動方面所固有的、相對穩(wěn)定的特性。體質(zhì)與疾病之間有著密切的聯(lián)系，正常體質(zhì)表現(xiàn)為健康狀態(tài)，病理體質(zhì)表現(xiàn)為亞健康狀態(tài)。我們在長期對體質(zhì)理論研究中發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)決定健康狀況，人體之所以表現(xiàn)為亞健康狀態(tài)，是因為病理體質(zhì)的存在，從健康到亞健康再到疾病的過渡，關(guān)鍵是體質(zhì)的改變。疾病的發(fā)展過程首先是從生理體質(zhì)向病理體質(zhì)過渡，再向病證發(fā)展的動態(tài)演變過程，亦即常常呈現(xiàn)出“正常體質(zhì)-病理體質(zhì)-病理證候”的動態(tài)演變過程［1］。

腎虛體質(zhì)是臨床最常見的病理體質(zhì)類型之一，與多種慢性疾病和老年性疾病密切相關(guān)。臨床上在“正常體質(zhì)-腎虛體質(zhì)-腎虛證候”這一動態(tài)演變過程中，腎之功能的異常變化，會影響到多臟腑的功能活動和體內(nèi)物質(zhì)代謝過程，并最終在代謝產(chǎn)物中體現(xiàn)出來［2］。中醫(yī)理論認為，唾液作為人體津液的一部分，其生成和排泄除與脾有關(guān)外［3］，與腎也密切相關(guān)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，唾液成分的改變與多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系［4］。而唾液檢測較血液檢測更安全方便，而且無創(chuàng)傷、無血源性疾病傳播的危險，患者更易于接受，因而受到人們越來越多的關(guān)注［5］。本實驗通過制作腎虛體質(zhì)和腎虛證候動物模型，探討“正常體質(zhì)-腎虛體質(zhì)-腎虛證候”動態(tài)演變過程中唾液生化指標(biāo)的變化。

1 實驗材料

1.1 動物

3月齡SD大鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量180～200g，西安交通大學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK（陜）2012-002。分籠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，自由飲食飲水。

1.2 藥物

匹魯卡品，山東博士倫福瑞達制藥有限公司，批號20130803；氫化可的松，美國Sigma公司。

1.3 主要試劑與儀器

生化指標(biāo)試劑盒，日本Olympus公司。臺式數(shù)顯pH儀（上海三信），全自動生化分析儀（Au2700，日本Olympus），醫(yī)用低溫冰箱（MDF-330，日本Olympus），低溫高速離心機（德國Eppendorf Centrifuge）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分組配對，合籠，次日早晨檢查雌鼠有無陰栓以判斷是否受精，未見陰栓的雌鼠再次與雄鼠合籠，反復(fù)2次，確保雌鼠均受精，分籠飼養(yǎng)。1周后觀察，雌鼠體質(zhì)量變化明顯，有壘窩現(xiàn)象，活動減少。將12只體質(zhì)量（200±20）g孕鼠隨機分為Ⅰ、Ⅱ組。Ⅰ組6只孕鼠孕期不恐嚇，正常喂養(yǎng)，分娩后隨機抽取 20只仔鼠作為正常對照組和腎虛證候組，每組10只，均雌雄各半。Ⅱ組6只孕鼠從妊娠第2日開始給予恐嚇，每日9∶00-11∶00、14∶00-16∶00，將孕鼠放入特制的小鐵絲籠內(nèi)，再將此小籠固定在裝有一只大家貓（具有威懾力的土貓）的大籠中，讓貓與孕鼠僅一網(wǎng)之隔，使貓爪能碰到但無法抓到孕鼠，并于每日10∶00、15∶00各另取2只活的實驗淘汰大鼠喂貓，直至仔鼠出生，由此使模型孕鼠驚恐傷腎造成仔鼠先天不足，制作先天不足腎虛體質(zhì)動物模型，隨機抽取 10只雌雄各半仔鼠作為腎虛體質(zhì)組。各組仔鼠正常條件喂養(yǎng)6周后，腎虛證候組參照文獻［6］，每只每日肌肉注射氫化可的松25 mg/kg體質(zhì)量，正常對照組和腎虛體質(zhì)組注射等量生理鹽水，連續(xù)10 d。

2.2 取材

造模結(jié)束稱重后停藥，所有動物乙醚麻醉，腹腔注射0.2%匹魯卡品（0.75 mg/100g）促進唾液分泌，Eppen-dorf管收集大鼠唾液，14 000 r/min離心10 min收集上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 指標(biāo)檢測

觀察大鼠體質(zhì)量、神態(tài)、活動能力、進食、飲水、毛色等一般情況變化。pH儀測定大鼠唾液pH值，應(yīng)用全自動生化分析儀測定大鼠唾液生化指標(biāo)。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

正常對照組大鼠皮毛色白光亮潤澤，反應(yīng)靈敏，飲食飲水量正常，活動正常。腎虛體質(zhì)組仔鼠在出生時即表現(xiàn)為體積較小，6周后腎虛體質(zhì)組仔鼠體質(zhì)量明顯輕于其他組，身長相對較短，毛發(fā)稀疏，易驚，食量較小。腎虛證候組大鼠注射氫化可的松后出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、活動明顯減少、食量下降、反應(yīng)遲鈍、蜷曲、拱背和體毛稀疏等癥狀，個別出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象。

4.2 各組大鼠唾液pH值檢測結(jié)果

與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組、腎虛證候組唾液 pH值明顯升高（P＜0.01），2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠唾液pH值比較（±s）

表1 各組大鼠唾液pH值比較（±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù) pH值正常對照組 10 4.20±0.10腎虛體質(zhì)組 10 9.16±0.06△△腎虛證候組 10 9.15±0.09△△

4.3 各組大鼠唾液鈉、鉀、氯、鈣、磷檢測結(jié)果

與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組和腎虛證候組大鼠唾液鉀（K）、磷（P）濃度升高（P＜0.01）；腎虛證候組大鼠唾液中氯（Cl）濃度降低（P＜0.05）；腎虛體質(zhì)組、腎虛證候組大鼠唾液鈉（Na）濃度呈下降趨勢、鈣（Ca）濃度呈上升趨勢。結(jié)果見表2。

4.4 各組大鼠唾液肌酸激酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、唾液淀粉酶檢測結(jié)果

與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組和腎虛證候組大鼠唾液肌酸激酶（CK）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）活性降低，唾液淀粉酶（AMY）活性升高（P＜0.05，P＜0.01），乳酸脫氫酶（LDH）活性降低，但只有腎虛證候組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與腎虛體質(zhì)組比較，腎虛證候組大鼠唾液LDH活性降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠唾液鈉、鉀、氯、鈣、磷濃度比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠唾液鈉、鉀、氯、鈣、磷濃度比較（±s，mmol/L）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 只數(shù) Na K Cl Ca P正常對照組 10 31.60±9.91 21.14±2.02 31.80±5.53 0.41±0.80 0.30±0.43腎虛體質(zhì)組 10 29.09±7.11 25.13±2.47△△ 28.38±3.91 0.73±0.75 0.84±0.34△△腎虛證候組 10 26.69±5.36 26.19±1.81△△ 27.72±4.28△ 0.78±0.66 0.85±0.81△△

表3 各組大鼠唾液CK、ALT、|AST、ALP、LDH、AMY活性比較（±s，IU/L）

表3 各組大鼠唾液CK、ALT、|AST、ALP、LDH、AMY活性比較（±s，IU/L）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與腎虛體質(zhì)組比較，☆P＜0.05

組別 只數(shù) CK ALT AST ALP LDH AMY正常對照組 10 3.62±1.91 6.40±2.27 10.82±7.33 20.20±22.44 11.26±4.40 9.33± 9.47腎虛體質(zhì)組 10 1.69±1.06△ 3.10±2.23△△ 4.50±2.22△ 3.69± 4.48△ 6.52±7.32 123.43±113.80△腎虛證候組 10 0.31±0.54△△ 1.81±1.23△△ 3.03±1.25△△ 3.32± 5.51△ 2.10±1.25△△☆ 187.67±144.57△△

4.5 各組大鼠唾液血糖、膽固醇、三酰甘油及總蛋白檢測結(jié)果

與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組和腎虛證候組大鼠唾液總蛋白（TP）含量明顯升高（P＜0.01），血糖（GLU）、膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）含量均降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠唾液GLU、CHOL、TG、TP含量比較（±s）

表4 各組大鼠唾液GLU、CHOL、TG、TP含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01

組別 只數(shù)GLU/（mmol/L）CHOL/（mmol/L）TG/（mmol/L）TP/（g/L）正常對照組 10 0.03±0.05 0.05±0.08 0.05±0.06 2.78±2.32腎虛體質(zhì)組 10 0.03±0.02 0.02±0.04 0.04±0.02 9.44±3.62△△腎虛證候組 10 0.01±0.02 0.02±0.04 0.03±0.03 7.56±3.63△△

5 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，唾液和血液、尿液一樣，如同人體的一面鏡子，可以用來反映人體的健康狀況，作為一種檢測手段來進行疾病的診斷，加之唾液的采取收集操作容易，無損傷，無風(fēng)險，可成為許多疾病的輔助診斷工具［7］。因此，唾液檢測越來越受到人們的青睞。

根據(jù)中醫(yī)“腎在液為唾”的理論，利用唾液與腎的相關(guān)性，從唾液的生化指標(biāo)變化研究腎及其相關(guān)疾病具有重大而長遠的意義和價值。相關(guān)研究也表明，在腎臟疾病中，唾液腺的分泌功能會減退，唾液的pH值及相關(guān)生化指標(biāo)等會發(fā)生相應(yīng)的變化［8-9］。如有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與健康組比較，腎功能受損時藥物刺激條件下和非刺激條件下唾液腺的分泌量會下降，非刺激條件下唾液的pH值和緩沖容量會上升，藥物刺激條件下的唾液的pH值和緩沖容量2組間比較無明顯差異［10］。本實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組、腎虛證候組大鼠唾液pH值明顯升高。

唾液的電解質(zhì)成分隨流量而變，正常人唾液與血液相比，含有高濃度的K和無機P，Na和Cl濃度相對較低。郭氏等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腎炎腎虛狀態(tài)下，唾液中K離子濃度升高，Na離子濃度降低。本實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，腎虛體質(zhì)組和腎虛證候組大鼠唾液 K、P、Ca濃度呈升高趨勢，Na、Cl濃度呈下降趨勢，說明伴隨著腎虛狀態(tài)的出現(xiàn)，唾液中的離子成分發(fā)生了變化。

唾液中除含有無機鹽外，還含有AMY、溶菌酶、黏蛋白、黏多糖等豐富的有機物，這些物質(zhì)在促進消化、抵御口腔細菌、病毒感染及口腔防御系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，本研究還觀察了腎虛體質(zhì)、腎虛證候AMY、GLU、TG、CHOL、TP等變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎虛體質(zhì)組和腎虛證候組大鼠唾液CK、ALT、AST、ALP均明顯低于正常對照組，TP、AMY均明顯高于正常對照組，而且腎虛證候組大鼠唾液 LDH也明顯低于正常對照組。提示在腎虛體質(zhì)與腎虛證候不同的腎虛狀態(tài)下，大鼠唾液中的成分確實發(fā)生了變化，且與正常對照組有明顯差異，進一步說明了“腎在液為唾”理論的科學(xué)性，為中醫(yī)腎藏象理論的現(xiàn)代化研究提供了客觀依據(jù)。

疾病的發(fā)生常常呈現(xiàn)出“正常體質(zhì)-病理體質(zhì)-病理證候”的動態(tài)演變過程。腎虛體質(zhì)是臨床最常見的病理體質(zhì)類型之一。腎虛體質(zhì)之人，由于腎虛精衰，骨髓、腦髓虧虛不足，常常表現(xiàn)出骨骼痿軟、腰酸乏力、頭暈、記憶力下降等癥狀，成為多種慢性疾病和老年性疾病腎虛證候發(fā)生的內(nèi)在基礎(chǔ)。本研究也發(fā)現(xiàn)，與腎虛體質(zhì)組比較，腎虛證候組大鼠唾液 LDH活性降低，二者之間存在差異，其機理有待進一步深入研究探討。這一研究將有助于尋找腎藏象相關(guān)疾病早期診斷的生物標(biāo)志物，探索其預(yù)防靶標(biāo)，為臨床開展腎藏象相關(guān)疾病無創(chuàng)傷診斷技術(shù)和早期防治研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ 孫理軍.中醫(yī)解讀人的體質(zhì)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2008.167-168.

［2］ 李翠娟，孫理軍，鞏振東.代謝組學(xué)與“腎在液為唾”理論的研究思考［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（9）：2854-2856.

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［4］ 孫珂煥，吳正治，曹美群，等.甲狀腺癌中醫(yī)辨證唾液蛋白質(zhì)組診斷模型研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（4）：13-15.

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［6］ 苗明三，朱飛鵬.常用醫(yī)藥研究動物模型［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：395.

［7］ 阮梅生，阮建平.唾液檢測在疾病診斷中的意義［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)，1999，8（1）：56-58.

［8］ 嚴(yán)為民，魏明競.唾液分析在腎功能檢查中的意義［J］.國外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2003，24（4）：227-228.

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Research on Saliva Biochem ical Changes about “Normal Constitution - K idney Deficiency Constitution - K idney Deficiency Syndrome”

LI Cui-juan， LIU Zi-xuan， SUN Li-jun， GONG Zhen-dong
（Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

ObjectiveTo investigate the changes of saliva biochemical parameters in the dynamic evolution of“normal constitution - kidney deficiency constitution - kidney deficiency syndrome”.MethodsTotally 24 male and female SD rats of 3 months old （12 male rats and 12 female rats） were put in packet pair cage. Pregnant rats were random ly divided into Ⅰ and Ⅱ groups， 6 rats in each group. Ⅰ group was without intimidation during pregnancy， with normal feeding， and then after the birth， 20 rats were random ly selected as normal control group and kidney deficiency syndrome model group， 10 rats in each group， half male and half female. Ⅱ group， from gestation day 2， was given intimidation until postnatal. 10 half male and half female rats were random ly selected as model group of kidney deficiency constitution. Rats in each group

normal feeding conditions for 6 weeks. The kidney deficiency syndrome model group was given intramuscular injection of hydrocortisone 25 mg/kg body weight every day， while normal control group and kidney deficiency constitution model group were injected with the same amount of normal saline for 10 consecutive days. The changes of salivary biochemical parameters were observed in each group of rats.ResultsCompared with the normal control group， salivary pH in the kidney deficiency constitution group and kidney deficiency syndrome group significantly increased （P＜0.01）. CK， ALT， AST， ALP levels in the kidney deficiency constitution group were reduced， but the contents of K， P， TP， AMY increased. The levels of CK，ALT， AST， ALP and LDH in the kidney deficiency syndrome decreased， while the contents of K， P， TP， and AMY increased （P＜0.05，P＜0.01）. Compared with the kidney deficiency constitution group， the content of LDH in the kidney deficiency syndrome group decreased （P＜0.05）.ConclusionRat saliva composition changes did occur in the kidney deficiency constitution group and kidney deficiency syndrome group.

normal constitution； kidney deficiency constitution； kidney deficiency syndrome； saliva biochemical index； rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.013

R228

A

1005-5304（2016）06-0047-04

2015-07-23）

（

2015-09-17；編輯：華強）

國家自然科學(xué)基金（81202614）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃（2015JQ8291）；陜西省教育廳重點實驗室科研計劃（13JS032）