響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖的提取工藝及抑菌作用研究

阿吾提·艾買爾，古力齊曼·阿布力孜，其買古麗·阿沙木，迪麗努爾·馬里克

（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830054）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖的提取工藝及抑菌作用研究

阿吾提·艾買爾，古力齊曼·阿布力孜，其買古麗·阿沙木，迪麗努爾·馬里克*

（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830054）

利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖的提取工藝，并對(duì)提取液進(jìn)行抑菌活性研究。以野薔薇根多糖得率為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)曲面法對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、料液比和微波功率進(jìn)行考察，優(yōu)化最佳提取條件。采用平板打孔法和試管稀釋法對(duì)野薔薇根多糖進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，野薔薇根多糖的最佳提取工藝為提取時(shí)間22min，微波功率317W，提取溫度81℃，料液比32：1mL/g，實(shí)測的多糖得率為6.10mg/g，與模型理論值基本符合。野薔薇根多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌都具有較明顯的抑制作用。模型可較好地預(yù)測野薔薇根多糖的得率，響應(yīng)面法對(duì)野薔薇根多糖提取條件參數(shù)優(yōu)化具有可行性。

野薔薇根；多糖；響應(yīng)曲面法；超聲-微波輔助提取；抑菌作用

新疆維吾爾民間中常用藥材新疆野薔薇具有一定的健脾理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、助消化等作用，廣泛用于治療胃功能失調(diào)、慢性氣管炎、腸炎等多種疾?。?-3］。多糖是野薔薇中最重要的活性成分之一，具有較高的藥用價(jià)值。研究表明，多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗病毒、降血脂、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化等作用［4，5］，甚至對(duì)艾滋病病毒有一定的防御功能［6］。因此對(duì)多糖的研究越來越引起人們的關(guān)注。關(guān)于野薔薇根多糖的提取工藝方面未見文獻(xiàn)報(bào)道。文章以野薔薇根多糖為研究對(duì)象，以野薔薇根多糖得率為指標(biāo)，對(duì)超聲-微波輔助提取法進(jìn)行響應(yīng)曲面分析優(yōu)化得到最佳提取工藝條件，并對(duì)野薔薇根多糖進(jìn)行抑菌活性研究，為我區(qū)野薔薇資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和開發(fā)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料及試劑

野薔薇根（采自新疆喀什巴楚縣）、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇（95%）、正丁醇、苯酚、石油醚、三氯甲烷、濃硫酸、氯化鈉、蛋白胨、母粉、大腸桿菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）均由新疆師范大學(xué)生物系細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供（以上藥品均為分析純）。

1.1.2 儀器設(shè)備

微波超聲波組合合成/萃取儀（型號(hào)：XH-300B；生產(chǎn)地：北京樣祥鵠科技發(fā)展有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-2100；生產(chǎn)地：北京瑞利分析儀器有限公司）；循環(huán)水式真空泵（型號(hào)：SHZ-D（Ⅲ）；生產(chǎn)地：鞏義市英峪予華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（型號(hào)：RE-52AA；生產(chǎn)地：上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（型號(hào)：AL204；生產(chǎn)地：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司）；高速多功能粉碎機(jī)（型號(hào)：HFP-200；生產(chǎn)地：永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；恒溫水浴振蕩搖床（型號(hào)：ZHWY-110X；生產(chǎn)地：上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

取一定量野薔薇根，粉碎，過16目篩，用石油醚脫脂，干燥，用密封袋包裝并置于干燥器內(nèi)備用。

1.2.2 野薔薇根多糖提取工藝流程

處理過的野薔薇根粉末1.000g→超聲微波提取→抽濾→減壓濃縮→醇沉（4倍體積）→離心分離→溶解沉淀→Sevage法脫蛋白→過濾→取其濾液→定容。

1.2.3 多糖含量的測定

以苯酚-硫酸法檢測多糖含量：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡聚糖0.010g，溶于100mL容量瓶中，定容，搖勻，配成濃度為0.1mg/mL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取此溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于10mL具塞比色管中，用去離子水補(bǔ)至2mL，再加入1mL苯酚（5%）和5mL濃硫酸，搖勻，室溫放置20min，置沸水浴加熱15min，取出冷卻30min，以去離子水作為空白于488nm處測其吸光度值，以吸光值Y和葡聚糖濃度X（ug/mL）計(jì)算回歸方程，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0667X+0.005786，相關(guān)系數(shù)R=0.9994。精密吸取多糖溶液2mL，按照上述的方法測定野薔薇根多糖含量。

式中：C為提取液多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液總體積（mL）；W為野薔薇根粉末質(zhì)量（g）。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［10-12］

在單因素的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert8.0.5中的Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，分別考察各自變量（提取溫度、微波功率、料液比及提取時(shí)間）對(duì)影響值（野薔薇根多糖得率）的影響并對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)［13，14，15］

1.2.5.1 培養(yǎng)基的配置

LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母粉5g，加入蒸餾水1000mL，加熱溶解，用1mol/LNaOH調(diào)pH值為7.0，于121℃滅菌20min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加1.6%瓊脂粉，煮沸熔化后定容，在溫度為121℃條件下滅菌20min。

1.2.5.2 菌液的制備

將供試菌活化兩代后，分別接入培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18-24h，溫度保持37℃。分別取已活化的供試菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，溫度為37℃、160r/min震蕩培養(yǎng)16-18h，采用10倍稀釋法，用生理鹽水稀釋至10000倍備用。

1.2.5.3 抑菌測定方法

抑菌效果經(jīng)打孔法測定：取直徑6mm打孔器均勻打孔圓形濾紙片，滅菌備用。取7支試管，按試管稀釋法進(jìn)行稀釋，第一管中分別加入培養(yǎng)液和藥，各加入體積為1mL，第一管混勻后吸取1mL加入第二管中，依次倍比稀釋好至第5管，混勻后第5管棄去1mL，將濾紙片浸泡在各濃度的溶液中。用無菌移液槍吸取0.2mL菌液涂布在已滅菌的培養(yǎng)皿上，然后取出在不同濃度總鞣質(zhì)純化液里浸泡過的濾紙片，每皿貼4片。每個(gè)菌再用未浸泡過的濾紙片做1份空白對(duì)照，空白對(duì)照組加入等量的去離子水。然后將各菌放在最適生長溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20小時(shí)，取出后測定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 野薔薇根多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

1.000g已烘干粉碎處理過的野薔薇根粉末加入按30∶1（mL/g）的料液比向樣品中加入去離子水，固定的超聲功率為50W、微波功率為250W、提取時(shí)間為15min，考察不同提取溫度對(duì)野薔薇根多糖得率的影響，結(jié)果見圖1所示。

圖1 提取溫度對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

由圖1可知，當(dāng)提取溫度80℃時(shí)，野薔薇根多糖最高，提取溫度小于80℃時(shí)多糖得率較低，因?yàn)槠錅囟容^低，多糖未能充分溶出，所以隨著提取溫度的升高多糖得率也增加。當(dāng)提取溫度超過80℃時(shí)，多糖得率反而下降，這可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致多糖類化合物分解。故溫度選80℃效果最好。

2.1.2 微波功率對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

1.000g已烘干粉碎處理過的野薔薇根粉末加入按30：1（mL/g）的料液比向樣品中加入去離子水，固定的超聲功率為50W、微波功率為250W、提取時(shí)間為15min、提取溫度為60℃，考察不同微波功率對(duì)野薔薇根多糖得率的影響，結(jié)果見圖2所示。

圖2 微波功率對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

由圖2可知，野薔薇根多糖得率隨微波功率的增加而增加，但微波功率過大得率反而下降。這可能是因?yàn)榍捌谖⒉üβ实脑黾犹峁┝俗銐虻臒崃?，加速了野薔薇根細(xì)胞破壁的速率，使多糖大量釋放并溶于溶劑水中；但后期微波功率超過300W以后，得率處于下降趨勢，這可能與多糖在較高溫度下不穩(wěn)定而分解有關(guān)。因此，確定微波功率為300W較適合。

2.1.3 料液比對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

1.000g已烘干粉碎處理過的野薔薇根粉末加入按不同的料液比向樣品中加入去離子水，固定的超聲功率為50W、微波功率為250W、提取時(shí)間為15min、提取溫度為60℃，考察不同料液比對(duì)野薔薇根多糖得率的影響，結(jié)果見圖3所示。

由圖3可知，多糖得率隨料液比的增大而增加，但當(dāng)料液比超過30：1（mL/g）時(shí)多糖得率隨著液料比的增加得率反而下降。這可能是因?yàn)榍捌谝毫媳扔昧吭蕉啵瑐髻|(zhì)推動(dòng)力越高，多糖的得率就越完全；但過高液料比對(duì)多糖得率增加效率有限，反而會(huì)增加濃縮時(shí)間及提取費(fèi)用。因此，較優(yōu)的料液比為30：1（mL/g）。

圖3 料液比對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

1.000g已烘干粉碎處理過的野薔薇根粉末加入按30∶1（mL/g）的料液比向樣品中加入去離子水，固定的超聲功率為50W、微波功率為250W、提取溫度為60℃，考察不同提取時(shí)間對(duì)野薔薇根多糖得率的影響，結(jié)果見圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)野薔薇根多糖得率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長，多糖得率逐漸增加，在提取時(shí)間延長到20min時(shí)，得率增加趨于平緩，說明多糖基本被提取，考慮能耗和成本。故提取時(shí)間以20min為宜。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

表2為不同實(shí)驗(yàn)條件下所測定的野薔薇根多糖得率，利用軟件Design-Expert8.05對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到野薔薇根多糖得率和提取溫度、微波功率、料液比和提取時(shí)間之間的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=5.88+0.16A+0.40B+0.25C+0.17D+0.29AB+0.060AC-0.025AD+0.025BC+0.32BD+0.17CD-0.87A2-0.38B2-0.46C2-0.47D2

對(duì)回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果見表3。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性分析

由表3可知，模型的P值<0.001，表明回歸模型極顯著；并且該模型的R2=0.9764，R2Adj=0.9528，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線形關(guān)系顯著，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用于野薔薇根多糖實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測。

回歸模型系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是極度顯著的，交互項(xiàng)中CD的影響是顯著的，AB和BD的影響是極顯著的，而其余的交互項(xiàng)則不顯著，因此各個(gè)具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線形關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)曲面與等高線分析

根據(jù)回歸模型繪出的響應(yīng)面圖形是三維空間的曲面圖及二維平面上的等高線圖，其可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從所得響應(yīng)面圖上可以分析出它們之間的交互作用，如等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。詳見圖5-10。

圖5 提取溫度和微波功率對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖6 提取溫度和料液比對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖7 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖8 微波功率和料液比對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖9 微波功率和提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖10 料液比和提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

由圖5-10可知，提取溫度和微波功率以及微波功率和提取時(shí)間的相互作用是極顯著的，料液比和提取時(shí)間的相互作用是顯著的，而其余的相互作用不顯著，與交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。

2.3 超聲-微波輔助提取野薔薇根多糖最佳工藝參數(shù)的確定及模型驗(yàn)證

2.3.1 最佳優(yōu)化條件

通過Design-Expert8.05得出最佳提取工藝條件為A=81℃，B=317W，C=32：1（mL/g），D=22min，在此工藝條件下，野薔薇根多糖得率的理論值達(dá)到6.16mg/g。

2.3.2 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)所得試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化的條件下，對(duì)野薔薇根多糖進(jìn)行3次平行提取，實(shí)際測得的平均多糖得率為6.10mg/g，與試驗(yàn)預(yù)測值相比，其相對(duì)誤差約為0.98%，因此，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)均為準(zhǔn)確可靠。

2.4 野薔薇根多糖抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將薔薇根多糖提取液配制成濃度為100%（15mg/mL）、50%、25%、12.5%、6.25%等5個(gè)系列的濃度進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 濃度對(duì)多糖提取液抑菌活性的影響（抑菌圈直徑：mm）

由表4可知，野薔薇根多糖對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度分別為：枯草芽孢桿菌3.75mg/mL，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和奇異變形桿菌1.875mg/mL。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)初步確定提取溫度、微波功率、料液比及提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響的有效范圍，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化野薔薇根多糖的超聲微波提取工藝，并在奇異變形桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌之上進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為：提取溫度81℃，微波功率317W，料液比32：1（mL/g）提取時(shí)間22min，在此條件下野薔薇根多糖得率實(shí)測值為6.10mg/g，與理論值的相對(duì)誤差不大。表明響應(yīng)曲面法能較好地預(yù)測野薔薇根多糖的得率。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野薔薇根多糖具有一定的抑菌作用。它所具有的抑菌功能使其有望作為天然抑菌劑和功能性產(chǎn)品而得到開發(fā)利用價(jià)值。

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Response Surface Methodology for Optimization of Extraction Conditions of Polysaccharide from Rosa Multiflora Thunb and Antibacterial Activity

Awuti·AIMAIER，Gulqiman·ABLIZ，Qimanguli·ASHAMU，DILINUER·MALIKE
（SchoolofChemistry and ChemicalEngineering，Xinjiang NormalUniversity，Urumqi,Xinjiang,830054,China）

To optimize the extraction technology of RosaMultiflora Thunb polysaccharidesby response surface method（RSM）and test its antibacterial activity.Extraction temperature，microwave power，extraction time and ratio ofmaterial to liquid were investigated by single factor testand RSM using the yield of Rosa Multiflora Thunb polysaccharidesas index to optimize the extraction technology.The antibacterialactivitywasevaluated by themethodsof disk diffusion and standard tube dilution.The optimal condition obtained from RSM wasas follow：extraction temperature 81℃，microwave power 317W,extraction time 22 min，the ratio of liquid tomaterial 32：1（mL/g）.The yield of polysaccharideswas 6.10mg/g，which was in linewith theoretical value basically.The polysaccharide from the Rosa Multiflora Thunb had strong inhibiting effects on some pathogenic bacterium such as Bacillus subtilis, Escherichia coli、Staphylococcus aureus and Proteusmirabilis.Themodelwell predict the yield of Rosa Multiflora Thunb polysaccharides，and RSM is feasible to optimize the extraction technology of RosaMultiflora Thunb polysaccharides.

Rosa Multiflora Thunb；Polysaccharide；Response surface；Ultrasonic-microwave assisted extraction；Antibacterialactivity

Q946.8

A

1008-9659（2016）02-0010-08

2016-03-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21165018）。

阿吾提·艾買爾（1988-），男，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究。

*［通訊作者］ 迪麗努爾·馬里克（1964-），女，新疆烏魯木齊人，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究。