穴位埋線對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及氨基酸的影響

金澤,曹曉婷,王春英,王玉琳,陳靜(.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 5000;.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 50040)

穴位埋線對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及氨基酸的影響

金澤1,曹曉婷2,王春英1,王玉琳1,陳靜1
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

目的探討穴位埋線對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元氨基酸及細(xì)胞凋亡的影響。方法選取50只Wistar大鼠,每組10 只,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組。除空白對(duì)照組外,其他4組均用青霉素鈉腹腔注射造模,穴位埋線組第1、4、7天重復(fù)埋線。第7天模型組、穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組再一次腹腔注射青霉素鈉點(diǎn)燃模型大鼠,所有動(dòng)物均在第7天治療后斷頭取腦,剝離海馬。標(biāo)本切片觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變(原位末端標(biāo)記法)。并檢測(cè)海馬內(nèi)谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的含量(高效液相色譜儀),計(jì)算GABA/Glu比值。結(jié)果空白對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞正常,陽(yáng)性凋亡細(xì)胞稀疏,模型組、針刺組、穴位埋線組及丙戊酸鈉組均可見(jiàn)不同程度海馬細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。與模型組相比,穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組海馬細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯降低(P＜0.01),丙戊酸鈉組低于穴位埋線組(P＜0.05),穴位埋線組低于針刺組(P＜0.05)。模型組海馬區(qū)興奮性氨基酸Glu的含量較空白對(duì)照組明顯增加(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組與模型組對(duì)比海馬內(nèi)Glu的含量明顯減少(P＜0.01),且穴位埋線組及丙戊酸鈉組Glu水平少于針刺組(P ＜0.05),穴位埋線組及丙戊酸鈉組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。模型組海馬區(qū)GABA的含量低于空白對(duì)照組(P＜0.01)。穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組GABA的含量均高于模型組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組間GABA含量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。模型組GABA/Glu比值低于空白對(duì)照組(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組GABA/Glu比值高于空白對(duì)照組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組間GABA/Glu比值無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論重復(fù)穴位埋線可明顯阻止癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展并可通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性與抑制性氨基酸的水平而發(fā)揮抗癲癇作用。

穴位療法;埋線;癲癇;海馬;細(xì)胞凋亡;氨基酸;大鼠

[Abstract]Ob jectiveTo investigate theeffectof acupointcatgutembedding on hippocampalneuronalamino acidsand apoptosis in epilepsy rats.M ethodFiftyWistar ratswere random ized into blank control,model,acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups,10 rats each.Amodelwasmade by intraperitoneal injection of penicillin in all thegroupsexcept theblank controlgroup.Catgutembedding was repeated in the acupoint catgutembedding group at day 1,4 and 7.At day 7,penicillin was intraperitoneally injected again to ignitemodel rats in theacupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups.A ll the animalswere decapitated at day 7 to take the brain and separate the hippocampus.The specimen was sliced to observe morphological changes in hippocam pal neurons(in situ end labeling techniques).Hippocam pal glutam ic acid(Glu)and g-aminobutyric acid(GABA)contentswerealsomeasured(high performance liquid chromatography).The ratio of CABA/Gluwas calculated.ResultHippocampal neuronswere normaland apoptosis-positive cellswere sparse in theblank control group of rats. Differentdegreesof hippocampal apoptosiswere seen in themodel,acupoint catgutembedding,acupuncture and sodium valproate groups.Hippocampal apoptosis reduced significantly in theacupoint catgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups compared with themodel group(P＜0.01).It decreasedmore in the sodium valproate group compared with the acupoint catgut embedding group(P＞0.05)and did in the acupoint catgut embedding group compared with the acupuncture group(P＞0.05). Hippocampalexcitatory am ino acid Glu content increased significantly in themodelgroup comparedwith theblank controlgroup(P ＜0.01)and decreased significantly in the acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups comparedwith the model group(P＜0.01).G lu levelswere low er in the acupoint catgut embedding and sodium valp roate groups than in the acupuncture group(P＞0.05)and therewas no significant differencebetween theacupointcatgutembedding and sodium valproate groups(P＞0.05).HippocampalGABA contentwas lower in themodelgroup than in the blank controlgroup(P＜0.01)and higher in the acupoint catgut embedding,acupuncture and sodium valproate groups than in themodel group(P＜0.01).Therewas no significant difference in theGABA contentbetween the acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups(P＞0.05).The ratio of CABA/Glu was lower in themodel group than in theblank controlgroup(P＜0.01)and higher in the acupoint catgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups than in the blank control group(P＜0.01).Therewasno significant difference in the ratio of CABA/Glu between theacupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups(P＞0.05).ConclusionRepeated acupointcatgutembedding can obviously prevent theoccurrence and developmentof hippocampal neuronal apoptosis in epilepsy rats.Itproducesan antiepileptic effectby regulating excitatory and inhibitory am ino acid levels.

[Keywords]Acupoint therapy;Catgutembedding;Epilepsy;Hippocampus;Apoptosis;Amino acid;Rats

癲癇(epilepsy)是一種臨床常見(jiàn)、反復(fù)發(fā)作的慢性腦部疾病,病因復(fù)雜,臨床表現(xiàn)多樣,病程纏綿難愈。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)癲癇患者30%～70%存在認(rèn)知功能障礙[1-7]。目前,癲癇還沒(méi)有特效的治療方法,主要采用抗癲癇西藥來(lái)控制癲癇發(fā)作。現(xiàn)代臨床實(shí)踐提示穴位埋線治療癲癇效果較好[8-14]。筆者通過(guò)青霉素鈉腹腔注射法,建立大鼠癲癇模型,通過(guò)觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的影響及GABA/Glu比值來(lái)探究穴位埋線對(duì)癲癇的可能作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組

成年健康雄性Wistar大鼠50只,體重200～250 g(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為黑動(dòng)字P00102004),常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組,每組10只。

1.2藥物及試劑

丙戊酸鈉(200 mg/片),注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠,160萬(wàn)U/支),滅菌注射用水(天津藥業(yè)焦作有限公司,2mL/支)。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,用0.1mol/LHCL配制成0.5mmol/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液,標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液是以0.1 mol/LHCL將貯備液稀釋3倍。鄰苯二甲醛(OPA)為Sigma公司產(chǎn)品,B-巰基乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。所有?shí)驗(yàn)用超純水系自備3次石英蒸餾水。衍生試劑,10 mgOPA溶于0.5 mL甲醇中,加b-巰基乙醇30mL與0.4 mol/L硼酸緩沖液(pH9.4)至4.5 mL即成。

溶液配制:丙戊酸鈉,取200mg丙戊酸鈉,研細(xì)末,加蒸餾水至10 mL,配成20 mg/mL濃度,灌胃。青霉素鈉,取青霉素鈉160萬(wàn)U,加滅菌注射用水2mL配成570 萬(wàn)U/mL。

1.3大鼠癲癇模型造模方法

通過(guò)參考文獻(xiàn)[15-16]介紹及預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法,除空白對(duì)照組外,其余4組用微量注射器將青霉素鈉通過(guò)腹腔注射入大鼠體內(nèi),青霉素鈉劑量為570萬(wàn)U/kg,參考Racine R[17]標(biāo)準(zhǔn),判斷大鼠是否出現(xiàn)癲癇狀態(tài)(Ⅰ級(jí)為口角和面部抽動(dòng);Ⅱ級(jí)為Ⅰ級(jí)＋點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí)為Ⅱ級(jí)＋前肢陣攣;Ⅳ級(jí)為Ⅲ級(jí)＋后腿站立;Ⅴ級(jí)為Ⅳ級(jí)＋跌倒;以大鼠出現(xiàn)Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作,且持續(xù)20 min為造模成功)。

1.4治療方法

1.4.1空白對(duì)照組

腹腔注射與模型組同等劑量的生理鹽水,常規(guī)喂養(yǎng)7 d。

1.4.2模型組

青霉素鈉致癲癇大鼠,常規(guī)喂養(yǎng)。

1.4.3針刺組

青霉素鈉致癇后,以乙醚吸人麻醉后固定,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[18],選取大鼠百會(huì)、長(zhǎng)強(qiáng)穴,用0.35mm ×25mm毫針針刺10mm,行平補(bǔ)平瀉手法,每次30min,每隔10 min行針1次,每日針1次,治療7 d。

1.4.4穴位埋線組

青霉素鈉致癇后,采用0.5 mm羊腸線在百會(huì)、長(zhǎng)強(qiáng)穴穴位埋線10 mm,分別在1 d、4 d、7 d重復(fù)埋線。

1.4.5丙戊酸鈉組

青霉素鈉致癇后行丙戊酸鈉灌胃,每日2次,灌7 d。劑量為成人每天15 mg/kg(體重)按體表面積換算成大鼠。

第7天除空白對(duì)照組外其他4組均再行一次青霉素鈉腹腔注射(同造模方法一樣)使模型大鼠癇性放電,然后進(jìn)行治療之后處死取材。

1.5觀測(cè)指標(biāo)

所有動(dòng)物均在7 d治療后,立即處死。乙醚麻醉,后用40 g/L多聚甲醛心臟灌注以固定,斷頭取腦,在冰盤上迅速開顱取腦組織,切除腦干及小腦,沿正中矢狀面切開大腦,剝離海馬,稱質(zhì)量后于﹣80℃低溫保存待測(cè)。

1.5.1大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞凋亡指數(shù)比較觀察

標(biāo)本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋后冠狀連續(xù)石蠟切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變。

原位末端標(biāo)記法(Tunel)檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元DNA片段化的情況。本實(shí)驗(yàn)采用半定量法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù),反映凋亡細(xì)胞DNA片段化情況。細(xì)胞核中有紫或深藍(lán)褐色顆粒者為陽(yáng)性染色細(xì)胞。每張切片計(jì)數(shù)3個(gè)不同視野(×400)內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均數(shù)作為細(xì)胞凋亡指數(shù)。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況,用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法染色的切片中,細(xì)胞核中有紫或深藍(lán)褐色顆粒者為陽(yáng)性染色細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)。

1.5.2大鼠海馬氨基酸測(cè)定

取解凍后的海馬,用電子天平稱重,加l mL無(wú)水乙醇,在冰浴下超聲破碎制成勻漿液,4℃低溫離心(12000 rpm,10 min)。取該上清液10mL加100mL衍生試劑混勻,反應(yīng)1～2 min后進(jìn)樣。并采用高效液相色熒光法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)海馬內(nèi)谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的含量,并計(jì)算GABA/Glu比值。得到的結(jié)果換算成mmol/g濕重。儀器:LC-6A型液相色譜儀(日本島津公司),SCL-6A系統(tǒng)控制器,CTO-6A柱溫箱,RF-10AXL熒光檢測(cè)器;TGL-16C離心機(jī);ER-18A型電子天平(日本)。

色譜條件:采用Nova-PakC18柱(4.6mm×150mm, 5mm)色譜柱;柱溫35℃;流動(dòng)相為50 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH6.8)、甲醇和四氫呋喃(A液82:17:1,B液22:77:1),流速為1 mL/min,進(jìn)樣量為20mL,熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為338 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用方差分析。

2　結(jié)果

模型組2只大鼠及丙戊酸那組1只大鼠在第7日青霉素鈉點(diǎn)燃時(shí)抽搐過(guò)度死亡。其中,除空白對(duì)照組外,模型組發(fā)作持續(xù)時(shí)間為(182±15.6)s,穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組發(fā)作時(shí)間分別為(69±9.6)s, (64.8±11.2)s,(90±8.1)s;模 型 組 潛 伏 期 為(12.3±2.3)min,穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組潛伏 期 分 別 為 (25.3±4.2)min,(30.3±2.9)min, (25±2.9)min,3組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說(shuō)明穴位埋線、丙戊酸鈉及針刺都對(duì)癲癇有改善作用。

2.1各組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

空白對(duì)照組陽(yáng)性染色細(xì)胞稀疏(見(jiàn)圖1),模型組陽(yáng)性染色細(xì)胞多且密集(見(jiàn)圖1),穴位埋線組(見(jiàn)圖1)、丙戊酸鈉組(見(jiàn)圖1)和針刺組(見(jiàn)圖1)中陽(yáng)性染色細(xì)胞少于模型組但多于空白對(duì)照組。比值詳見(jiàn)圖2。

圖1　各組陽(yáng)性染色細(xì)胞

由圖2可知,模型組陽(yáng)性染色細(xì)胞明顯多于空白對(duì)照組(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組海馬細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯低于模型組(P＜0.01),丙戊酸鈉組低于穴位埋線組(P＜0.05),穴位埋線組低于針刺組(P＜0.05)。

圖2　各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s)

2.2各組大鼠海馬氨基酸含量的比較

由圖3可知,模型組Glu含量較空白對(duì)照組多,且與空白對(duì)照組相比,模型組海馬區(qū)興奮性氨基酸Glu的含量增加(P＜0.01)。穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組與模型組比較大鼠海馬內(nèi)Glu的含量明顯減少(P ＜0.01),且穴位埋線組及丙戊酸鈉組Glu水平少于針刺組(P＜0.05),穴位埋線組及丙戊酸鈉組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

由圖4可知,模型組GABA含量較空白對(duì)照組少,且由圖3可知Glu含量較空白對(duì)照組多,說(shuō)明癲癇造模成功。模型組海馬區(qū)GABA的含量低于空白對(duì)照組(P ＜0.01)。但穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組GABA的含量均高于模型組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組針刺組間GABA含量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

2.3各組海馬氨基酸GABA/Glu比值比較

由圖5可知,模型組GABA/Glu比值低于空白對(duì)照組(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組GABA/Glu比值高于空白對(duì)照組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組間GABA/Glu比值無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

圖3　各組大鼠海馬氨基酸Glu的比較(±s)

圖4　各組大鼠海馬氨基酸GABA的比較(±s)

圖5　各組海馬氨基酸GABA/Glu比值比較(±s)

3　討論

相關(guān)報(bào)道表明,癲癇后神經(jīng)元死亡,表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,由此可知神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可間接反映癲癇的發(fā)作程度。本實(shí)驗(yàn)可知,穴位埋線可明顯減低大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,說(shuō)明穴位埋線可抑制大鼠癲癇的發(fā)生發(fā)展。而Glu為腦內(nèi)興奮性氨基酸,它存在于神經(jīng)末梢胞質(zhì)中,其興奮性神經(jīng)毒性作用可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性和死亡[19],GABA為腦內(nèi)抑制性氨基酸。Glu與GABA在腦內(nèi)含量平衡關(guān)系影響著癲癇發(fā)生[20]。當(dāng)腦內(nèi)興奮性與抑制性氨基酸之間平衡被打破,興奮性因素增多,而抑制性因素減少,則導(dǎo)致癲癇發(fā)作[21]。穴位埋線能明顯降低青霉素致癇大鼠海馬神經(jīng)元Glu含量,提高GABA含量,糾正癲癇大鼠海馬Glu和GABA失衡的狀態(tài),調(diào)節(jié)興奮性氨基酸遞質(zhì)和抑制性氨基酸遞質(zhì)的平衡,具有明顯的抗癇作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況及海馬氨基酸的變化來(lái)表明大鼠癲癇的損害程度,可推測(cè)穴位埋線、針刺、西藥都可在一定程度上減少大鼠癲癇情況的發(fā)生發(fā)展,表明穴位埋線、針刺、西藥都可不同程度地減輕癲癇癥狀或減少癲癇發(fā)作對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害,在降低Glu的含量方面,穴位埋線較丙戊酸鈉及針刺療效顯著,從而提高GABA/Glu比值,降低癲癇的發(fā)作。雖然重復(fù)穴位埋線與丙戊酸鈉相比無(wú)明顯優(yōu)勢(shì),但穴位埋線為可被自體吸收的羊腸線,避免了各類西藥的毒副反應(yīng),同時(shí)避免了反復(fù)針刺造成的疼痛,就癲癇而言,穴位埋線還克服了癲癇發(fā)作時(shí)不易針灸的弊端。

中醫(yī)通過(guò)幾千年對(duì)癲癇的認(rèn)識(shí)與研究,積累了豐富的癲癇治療手段與方法[22-24]。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明,長(zhǎng)強(qiáng)及百會(huì)為治療癲癇要穴[25-30]。長(zhǎng)強(qiáng)為督脈絡(luò)穴,督脈統(tǒng)領(lǐng)一身陽(yáng)氣,故埋線于長(zhǎng)強(qiáng)可醒神開竅,調(diào)節(jié)陰陽(yáng),配合督脈與足太陽(yáng)交會(huì)之百會(huì)穴,可熄風(fēng)寧神醒腦,使癲癇得以緩解。配合以針灸為基礎(chǔ)的穴位埋線法,使得癲癇有了方便而行之有效的治療方法。穴位埋線的整個(gè)操作過(guò)程集合了中醫(yī)的針刺、刺血、留針、穴位封閉等多種刺激反應(yīng)[31-33]。這些反應(yīng)互相配合,共同發(fā)揮作用,形成一種持久柔和而復(fù)雜的非特異性刺激沖動(dòng),一部分通過(guò)傳入神經(jīng)到達(dá)相應(yīng)神經(jīng)節(jié)段的脊髓后角,抑制相鄰的病理傳導(dǎo),抑制臟腑內(nèi)作用,另一部分通過(guò)脊髓后角上傳至大腦皮質(zhì),抑制病理刺激傳入中樞系統(tǒng),再通過(guò)神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)整臟腑,以治愈疾病[34]。

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Effectof Acupoint Catgut Embedding on Hippocampal Neuronal Apoptosisand Amino Acids in Epilepsy Rats

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R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0218

1005-0957(2016)02-0218-05

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目;黑龍江省科技廳面上項(xiàng)目(D201286)

金澤(1965-),男,教授,博士后,Email:j inze3399@163.com

曹曉婷(1988-),女,住院醫(yī)師,碩士,Emai l:qiaoyi1988hel ls@163.com

2015-05-20