Rho激酶在氫氣保護LPS誘導的Caco-2細胞上皮屏障功能障礙中的機制研究

馬小葉，于洋，張紅濤，謝克亮，2，于泳浩，2△

細胞與分子生物學

Rho激酶在氫氣保護LPS誘導的Caco-2細胞上皮屏障功能障礙中的機制研究

馬小葉1，于洋1，張紅濤1，謝克亮1，2，于泳浩1，2△

摘要：目的探討Rho激酶（ROCK）在氫氣改善離體膿毒癥腸屏障功能中的作用。方法常規(guī)培養(yǎng)人結腸上皮細胞Caco-2，分為6組（n=3）：對照組（C組）、富氫培養(yǎng)基組（H組）、脂多糖（LPS）處理組（L組）、富氫培養(yǎng)基+LPS組（HL組）、Rho激酶抑制劑Y-27632組（Y組）、Y-27632+LPS組（YL組）。H組給予0.6 mmol/L富氫培養(yǎng)基；LPS和Y-27632的處理濃度分別為50 mg/L、25 μmol/L。建立Transwell小室模型，定期檢測跨上皮電阻值（TEER值），當TEER值達到800 Ω·cm2后給予處理，于6、12、24 h檢測TEER值，24 h時檢測FITC-右旋糖酐通過率。細胞接種于6孔板，融合達80%～90%后給予處理，實時聚合酶鏈式反應技術檢測閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）mRNA和ROCK mRNA表達情況；蛋白免疫印跡技術檢測ZO-1蛋白和ROCK蛋白表達水平。結果與C組比較，H組12、24 h TEER值升高（P＜0.05），F(xiàn)ITC-右旋糖酐通過率、ZO-1蛋白和ROCK蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義；Y組6、12、24 h TEER值升高（P＜0.05），F(xiàn)ITC-右旋糖酐通過率差異無統(tǒng)計學意義，ZO-1 mRNA表達增加，ROCK mRNA表達減少（均P＜0.05）；L組6、12、24 h TEER值降低，F(xiàn)ITC-右旋糖酐通過率增高，ZO-1 mRNA和蛋白表達均下降，ROCK mRNA和蛋白表達均增加（P＜0.05）。與L組比較，6、12、24 h YL組TEER值增高，F(xiàn)ITC-右旋糖酐通過率降低，ZO-1 mRNA表達增加，ROCK mRNA表達降低（均P＜0.05）。與L組比較，HL組6、12、24 h TEER值增高，F(xiàn)ITC-右旋糖酐通過率降低，各時間點ZO-1蛋白表達上升，ROCK蛋白表達下降（均P＜0.05）。結論氫氣可保護膿毒癥腸屏障功能，改善腸上皮屏障完整性和通透性，增加腸細胞間緊密連接蛋白表達，這些保護機制可能與氫氣抑制LPS誘導的ROCK過度表達有關。

關鍵詞：rho相關激酶類；氫；脂多糖類；膿毒癥；Caco-2細胞；腸上皮屏障功能

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81071533，81372033）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（13JCQNJC11400）

作者單位：1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院麻醉科（郵編300052）；2天津市麻醉學研究所

作者簡介：馬小葉（1989），女，碩士在讀，主要從事氫氣對膿毒癥器官功能保護方面的研究

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通訊作者E-mail:yuyonghao@126.com

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器胎牛血清（BioInd公司，以色列）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）；GCH300高純氫氣發(fā)生器（天津同普分析儀器科技有限公司）；Transwell小室（Corning公司，美國）；EVOM細胞電阻儀（WPI公司，美國）；FITC-右旋糖酐、大腸桿菌脂多糖（LPS）、Rho激酶抑制劑Y-27632（Sigma公司，美國）；熱啟動熒光定量PCR試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；小鼠單克隆抗閉鎖小帶蛋白1 （zonula occludens-1，ZO-1）抗體、兔單克隆抗ROCK抗體（Abcam，英國）；小鼠單克隆抗β-actin抗體、HRP標記山羊抗小鼠抗體、HRP標記山羊抗兔抗體（杭州華安生物技術有限公司）。

1.2Caco-2細胞培養(yǎng)人結腸上皮Caco-2細胞購自上海中科院細胞庫，以含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入1%青霉素-鏈霉素雙抗。生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，1∶2傳代，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，傳代24 h后更換培養(yǎng)基，以后每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，5～6 d傳代1次。

1.3富氫培養(yǎng)基制備通過高純氫氣發(fā)生器將高純度氫氣（純度＞99.999 9%）加壓充入DMEM高糖培養(yǎng)基中。富氫培養(yǎng)基現(xiàn)用現(xiàn)配，以氫電極檢測氫氣濃度為0.6 mmol/L，過濾消毒后留作細胞處理。

1.4分組及處理

1.4.1實驗分組取狀態(tài)良好，處于生長對數(shù)期的Caco-2細胞進行實驗。實驗分為對照組（C組）、富氫培養(yǎng)基組（H組）、LPS處理組（L組）、富氫培養(yǎng)基+LPS組（HL組）、ROCK抑制劑Y-27632組（Y組）、ROCK抑制劑Y-27632+LPS組（YL組）。C組與H組分別加入等容量DMEM高糖培養(yǎng)基和0.6 mmol/L富氫培養(yǎng)基。LPS處理濃度為50 mg/L，Y-27632處理濃度為25 μmol/L。

1.4.2Caco-2細胞單層模型的建立和模型完整性檢驗取生長狀態(tài)良好的Caco-2細胞以5.5×105個/mL的密度接種于Transwell小室內（500 μL/孔），外室內加培養(yǎng)基600 μL/孔。接種24 h后換培養(yǎng)基，接種后第1周隔1 d換1次培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。每天在顯微鏡下觀察小室內細胞生長情況，定期用EVOM細胞電阻儀檢測小室底層細胞跨上皮電阻值（TEER），具體操作方法參照儀器說明書。當TEER值達到800 Ω·cm2后分別給予細胞6組不同處理（n=3），于37℃溫箱中無菌孵育，分別于處理前（0 h），處理后6、12、24 h檢測TEER值。若TEER值降低則表明模型的完整性降低。

1.4.3Caco-2細胞單層模型通透性的檢測同上述建立Caco-2細胞小室模型，TEER值達800 Ω·cm2后分別給予6組不同處理（n=3），于37℃溫箱中孵育至24 h。小心吸出內室及外室的培養(yǎng)基，無菌PBS清洗3次，向內室中加入1 g/L FITC-右旋糖酐，外室中加入無菌PBS。避光置于37℃溫箱中，2 h后在外室取樣100 μL于黑色96孔板中，熒光分光光度計檢測FITC的熒光強度。

1.4.4實時聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測ZO-1和ROCK mRNA表達將培養(yǎng)的Caco-2細胞制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后以1×106/mL密度均勻接種于6孔板，2 mL/孔。細胞融合達80%～90%時，分別給予細胞C組、L組、Y組和YL組4種處理（n=3），培養(yǎng)24 h后用Trizol試劑法提取細胞總RNA。用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA（2步法），SYBR GreenⅠ法進行RT-PCR檢測。引物序列為：GAPDH引物上游 5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′，下游 5′-CAGT?GGGAACACGGAAAGC-3′；ZO-1引物上游5′-AAAGTGCT?GGCTTGGTCTGT-3′，下 游 5′-TAGGTGACGCTGGGT?GATAG-3′；ROCK引物上游5′-TCCTCTGCTAAGTCTC?CATCG-3′，下游5′-GACAGCCTCACTCTCCCATT-3′，擴增片段長度分別為206、105、103 bp。94℃預變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)后72℃延伸7 min，每個循環(huán)在72℃時采集熒光，所得Ct值用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.4.5蛋白免疫印跡技術（Western blot）檢測ZO-1及ROCK蛋白表達6孔板培養(yǎng)細胞至細胞融合達80%～90%時，給予C組、H組、L組、HL組4種處理（n=3），分別于6、12、24 h用細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經6%SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后分別孵以小鼠抗ZO-1抗體（1∶200）、兔抗ROCK抗體（1∶500）、小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000）4℃過夜。TBST洗膜后，分別孵育辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗鼠或山羊抗兔抗體，室溫下置于搖床上1 h。TBST清洗后于暗室中滴加顯影液顯影。Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白灰度值比值得到目的蛋白相對表達量。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1顯微鏡下觀察各組處理后細胞形態(tài)改變倒置顯微鏡下觀察可見C組、H組、Y組細胞生長狀態(tài)良好，細胞連接緊密，呈鵝卵石狀，形態(tài)飽滿，折光性好。L組細胞數(shù)目顯著減少，細胞生長分散稀疏，相鄰細胞間彼此脫離，細胞形態(tài)改變，呈不規(guī)則狀，折光性減弱；隨時間延長，這些改變更加明顯。HL組和YL組與L組相比細胞數(shù)量增多，生長更緊密，折光性增強。

2.2Caco-2細胞小室模型TEER值和小室FITC-右旋糖酐通過率的改變與C組相比，H組12、24 h TEER值升高；Y組6、12、24 h TEER值升高（P＜0.05）；L組、HL組和YL組細胞6、12、24 h TEER值均降低（P＜0.05）。與L組相比，HL組和YL組6、12、24 h TEER值增高（P＜0.05）。處理24 h后，與C組相比，L組、HL組和YL組小室模型FITC-右旋糖酐通過率升高（P＜0.05），與L組相比，HL組和YL組小室FITC-右旋糖酐通過率降低（P＜0.05）；H組和Y組小室FITC-右旋糖酐通過率與C組相比差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.3Caco-2細胞ZO-1 mRNA與ROCK mRNA表達與C組相比，Y組ZO-1 mRNA表達顯著增多，L組和YL組ZO-1 mRNA表達減少；YL組比L組表達量增多，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與C組相比，Y組ROCK mRNA表達顯著減少，L組和YL組顯著增加；與L組相比，YL組ROCK mRNA表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

2.4Caco-2細胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白表達量與C組比較，3個時間點處L組ZO-1蛋白表達均有下降（均P＜0.05）；與L組相比，HL組ZO-1蛋白表達均升高（均P＜0.05）。與C組相比，3個時間點L組ROCK蛋白表達均增加，與L組相比，HL 組ROCK蛋白表達下降，隨時間延長下降幅度增加，但仍高于C組（均P＜0.05）。各個時間點H組與C組ZO-1蛋白和ROCK蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1、表3。

Tab.1　Effects of different treatments on TEER value and FITC-dextran permeability of Caco-2 cell chamber model表1　不同處理對Caco-2細胞小室模型TEER值和FITC-右旋糖酐通過率的影響　?。╪=3,±s）

Tab.1　Effects of different treatments on TEER value and FITC-dextran permeability of Caco-2 cell chamber model表1　不同處理對Caco-2細胞小室模型TEER值和FITC-右旋糖酐通過率的影響　?。╪=3,±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與L組比較，P＜0.05

組別C組H組L組HL組Y組YL組F TEER相對值（%）0 h 100.00±2.38 101.00±2.82 100.60±3.41 100.24±2.80 100.84±2.71 101.20±2.50 0.082 6 h 101.61±2.07 103.13±2.41 78.30±3.14a90.61±3.04ab105.72±3.03ab93.70±2.80ab40.642＊＊12 h 103.50±2.02 108.30±2.02a74.72±2.48a91.30±2.32ab107.60±2.12ab88.84±2.64ab100.272＊＊24 h 103.94±2.17 110.74±2.25a71.57±2.44a94.70±2.98ab108.12±2.27ab87.95±2.54ab108.416＊＊FITC-右旋糖酐通過率（24 h）1.00±0.19 0.86±0.18 2.27±0.21a1.47±0.21ab0.89±0.20b1.54±0.19ab22.477＊＊

Tab.2　The effects of Y-27632 on ZO-1 mRNA and ROCK mRNA expressions in LPS-induced Caco-2 cells 表2Y-27632對LPS誘導Caco-2細胞ZO-1 mRNA和ROCK mRNA表達改變的影響?。╪=3，±s）

Tab.2　The effects of Y-27632 on ZO-1 mRNA and ROCK mRNA expressions in LPS-induced Caco-2 cells 表2Y-27632對LPS誘導Caco-2細胞ZO-1 mRNA和ROCK mRNA表達改變的影響　（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與L組比較，P＜0.05

組別C 組L 組Y 組Y L 組F Z O -1 m R N A 1 . 0 0 ± 0 . 0 9 0 . 4 7 ± 0 . 0 9a1 . 3 8 ± 0 . 1 0ab0 . 7 1 ± 0 . 1 7ab3 5 . 2 6 4＊＊R O C K m R N A 1 . 0 0 ± 0 . 1 3 1 . 7 5 ± 0 . 2 1a0 . 4 5 ± 0 . 1 3ab1 . 3 3 ± 0 . 1 5ab3 5 . 0 1 8＊＊

Fig.1　The relative protein expressions of ZO-1 and ROCK in Caco-2 cells圖1　Caco-2細胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白相對表達量

Tab.3　The relative protein expression levels of ZO-1 and ROCK at different time points in Caco-2 cells表3不同時間點Caco-2細胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白相對表達量　?。╪=3,±s）

Tab.3　The relative protein expression levels of ZO-1 and ROCK at different time points in Caco-2 cells表3不同時間點Caco-2細胞ZO-1蛋白和ROCK蛋白相對表達量　?。╪=3,±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與L組比較，P＜0.05

組別C組H組L組HL組F ZO-1蛋白相對表達量6 h 1.00±0.08 0.99±0.10 0.53±0.07a0.65±0.10ab21.126＊＊12 h 1.00±0.09 1.01±0.10 0.45±0.12a0.70±0.10ab19.684＊＊24 h 1.00±0.05 0.96±0.07 0.41±0.08a0.77±0.08ab45.472＊＊組別C組H組L組HL組F ROCK蛋白相對表達量6 h 1.00±0.08 1.03±0.08 1.33±0.07a1.16±0.09ab10.240＊＊12 h 1.00±0.11 0.91±0.10 1.48±0.08a1.22±0.07ab22.437＊＊24 h 1.00±0.11 1.05±0.11 1.56±0.13a1.24±0.09ab15.812＊＊

3　討論

TEER和FITC-右旋糖酐通過率是常用的檢測Caco-2細胞單層屏障功能變化的敏感指標，TEER值主要反映了腸屏障模型離子通透性的改變，而FITC-右旋糖酐通過率則反映了大分子物質透過腸屏障模型的能力。不同實驗條件和不同克隆Caco-2細胞測得的TEER值差別較大，可從500～1 500 Ω·cm2不等［6］。本實驗中建立的Caco-2細胞單層模型TEER值均達到800 Ω·cm2，可完全滿足實驗的要求。

相鄰腸上皮細胞間緊密連接蛋白相互連接，在細胞的頂端形成環(huán)狀帶，控制物質從細胞旁途徑跨越腸上皮的移動。ZO-1是第一個被分離出來的緊密連接蛋白，其連接于其他緊密連接蛋白和細胞骨架蛋白之間，調節(jié)細胞間連接和細胞旁通透性［7］。ROCK于20世紀90年代被分離出來，廣泛分布于各組織器官，有2種亞型：ROCK1和ROCK2。ROCK主要通過調節(jié)細胞骨架影響細胞的生命活動［4］。Y-27632是ROCK的特異性抑制劑，對ROCK1和ROCK2均有抑制作用。有文獻報道，ZO-1蛋白與細胞中的肌動蛋白絲相連［7］，而ROCK也可通過調節(jié)細胞內肌動蛋白絲的聚集與解離使細胞骨架重組，連接旁肌動球蛋白環(huán)（perijunctional actomyosin ring，PAMR）收縮，增加腸上皮的通透性［8］。Van Itallie等［9］發(fā)現(xiàn)ROCK可通過影響ZO-1蛋白改變腸屏障的功能狀態(tài)。Mirza等［10］認為ROCK通過使致病性酵母菌誘導的Caco-2細胞的肌動蛋白細胞骨架重組和ZO-1蛋白丟失，進而增加腸上皮通透性。本實驗結果表明，LPS可誘導Caco-2細胞ROCK mRNA表達增高，ROCK蛋白表達上調，降低ZO-1 mRNA和蛋白的表達水平。而ROCK抑制劑Y-27632可有效改善Caco-2單層細胞膿毒癥模型的完整性和通透性，緩解LPS引起的Caco-2細胞ZO-1 mRNA表達下調，與本課題組的在體研究結果一致［11］。因此本實驗表明，ROCK參與了LPS誘導的Caco-2細胞膿毒癥模型中ZO-1蛋白的表達改變，抑制ROCK過度表達可改善離體腸屏障模型的功能狀態(tài)。

氫氣是一種選擇性抗氧化劑，對多種疾病具有治療作用［12］，但其治療機制尚不清楚；由于其安全溫和、易透過生物膜等優(yōu)點［13］，在臨床上有廣闊的應用前景。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氫氣能有效改善膿毒癥腸屏障功能障礙［3］。本實驗研究顯示氫氣可改善Caco-2細胞膿毒癥腸屏障模型的完整性和通透性，抑制細胞內ROCK過度表達，增加ZO-1蛋白表達。結合上述實驗結論，可推測氫氣可能通過ROCK改善離體膿毒癥腸屏障的功能狀態(tài)。然而氫氣治療作用廣泛，對多種疾病都有治療作用，也有文獻報道氫氣的治療作用可能通過其他作用靶點實現(xiàn)［6，13］。因此推測，氫氣可通過多種途徑調節(jié)保護膿毒癥腸屏障功能狀態(tài)，ROCK可能參與了氫氣的保護機制，而氫氣對膿毒癥腸屏障復雜的保護機制仍有待研究。

綜上所述，氫氣可保護膿毒癥腸屏障功能，改善腸上皮屏障完整性和通透性，增加腸細胞間緊密連接蛋白表達，這些保護機制可能與氫氣抑制LPS誘導的ROCK過度表達有關。

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（2016-01-21收稿2016-03-10修回）

（本文編輯李國琪）

中圖分類號:R364.5

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20160025

The role of Rho kinase in the protective effects of hydrogen on the damage of Caco-2 epithelial barrier induced by LPS

MA Xiaoye1,YU Yang1,ZHANG Hongtao1,XIE Keliang1,2,YU Yonghao1,2△
1 Department of Anesthesiology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;
2 Tianjin Institute of Anesthesiology
△Corresponding AuthorE-mail:yuyonghao@126.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of Rho kinase(ROCK)in the protective effects of hydrogen on intestinal epithelial barrier function in sepsis.MethodsCaco-2 cells were cultured routinely,and divided into 6 groups randomly(n= 3):control group(C group),hydrogen-rich medium group(H group),lipopolysaccharide(LPS)-treatment group(L group),hy?drogen+LPS-treatment group(HL group),Rho kinase inhibitor(Y-37632)treatment group(Y group)and Rho kinase inhibi?tor Y-27632+LPS-treatment group(YL group).H group was treated with 0.6 mmol/L hydrogen-rich media.The concentra?tion of LPS and Y-27632 were 50 mg/L and 25 μmol/L separately.After the Caco-2 monolayer model was established,the transepithelial electrical resistance(TEER)values were measured regularly.When the TEER value reached 800 Ω·cm2,the treatment was administered.Then TEER values were measured at 6 h,12 h and 24 h,and FITC-dextran permeability was de?tected at 24 h.Cells were seeded on 6-well plates.After cell density reached 80%-90%,treatments were given randomly. The real time-polymerase chain reaction(RT-PCR)was conducted to assess mRNA levels of ZO-1 and ROCK mRNA.ZO-1 and ROCK protein expression levels were detected by Western blot assay.ResultsCompared with C group,TEER values were elevated in 12 h and 24 h in H group(P<0.05).There were no statistical significances in FITC-dextran permeability,protein expression levels of ZO-1 and ROCK between C group and H group(P>0.05).TEER values were elevated at 6 h,12 h and 24 h in Y group(P<0.05).There was no significant difference in FITC-dextran permeability between C group and Y group(P>0.05).The mRNA expression of ZO-1 increased and mRNA expression of ROCK decreased in Y group(P< 0.05).The TEER values reduced at 6 h,12 h and 24 h in L group.The FITC-dextran permeability increased significantly, mRNA and protein expressions of ZO-1 significantly decreased,mRNA and protein expressions of ROCK significantly in?creased in L group(all P<0.05).Compared with L group,TEER values increased significantly at 6 h,12 h and 24 h in YL group,FITC-dextran permeability decreased,mRNA expressions of ZO-1 increased,mRNA expressions of ROCK de?creased in YL group(P<0.05).Compared with L group,TEER values increased at 6 h,12 h and 24 h in HL group,FITC-dextran permeability reduced markedly,protein expressions of ZO-1 increased at each time point,protein expressions of ROCK decreased at each time point in HL group(P<0.05).ConclusionHydrogen can protect intestinal barrier function against sepsis,ameliorate the integrity and permeability of intestinal epithelium and increase the expressions of intercellular tight junction proteins.The suppression of Rho kinase over-expression induced by LPS may be involved in these protective effects of hydrogen.

Key words:rho-associated kinases;hydrogen;lipopolysaccharides;sepsis;Caco-2 cells;intestinal epithelial barrier function膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征（SIRS）。膿毒癥常繼發(fā)于創(chuàng)傷、大手術等引發(fā)的嚴重感染，可發(fā)生于各年齡段的患者。膿毒癥發(fā)生率、病死率高，在美國，每年因膿毒癥死亡人數(shù)約占總死亡人數(shù)的10%，是重癥監(jiān)護室（ICU）患者的第二大死因，幸存者也常因為并發(fā)癥和后遺癥而導致生活質量嚴重下降［1］。腸屏障一直被認為是膿毒癥的“motor”［2］，其構成錯綜復雜，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色，是膿毒癥治療的研究熱點。腸道細胞間的緊密連接使相鄰腸細胞緊密錨定、相互溝通，與腸細胞共同構成了腸上皮的機械屏障。近年來研究顯示，氫氣對多種疾病具有治療作用，本課題組前期研究顯示，氫氣在膿毒癥模型中對腸屏障具有保護作用［3］，然而具體作用機制并不明確。Rho激酶（ROCK）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種細胞內生命活動，可對細胞骨架蛋白起到調節(jié)作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，ROCK可以通過調節(jié)腸上皮細胞間緊密連接蛋白進而影響腸屏障通透性［5］。本實驗旨在探討ROCK在氫氣對膿毒癥腸屏障保護中的作用機制。