不同休眠特性小麥中TaGAMyb-B基因的等位變異及其表達特性

劉進英，董 雪，馮玉梅，魏 旭，楊 燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物技術(shù)功能實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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不同休眠特性小麥中TaGAMyb-B基因的等位變異及其表達特性

劉進英，董 雪，馮玉梅，魏 旭，楊 燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物技術(shù)功能實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

摘要：GAMyb基因編碼蛋白作為GA信號途徑的轉(zhuǎn)錄激活因子，對促進植物種子的萌發(fā)具有重要作用。為探討GAMyb基因是否為導(dǎo)致小麥不同休眠特性的又一個原因，利用GAMyb基因在小麥3A、3B和3D染色體上的基因組序列設(shè)計了基因特異性引物，對不同休眠特性的白粒小麥中 TaGAMyb-B基因的等位變異和轉(zhuǎn)錄本的表達特性進行了研究。結(jié)果表明，TaGAMyb-B基因在不同休眠特性的材料中存在 SNPs和Indel的序列差異。根據(jù)不同休眠特性小麥材料TaGAMyb-B基因的序列差異，兩個新的等位變異TaGAMyb-Ba和 TaGAMyb-Bb被命名。進一步研究發(fā)現(xiàn)，兩種不同等位變異的小麥材料在種子發(fā)育的不同時期TaGAMyb-B基因表達水平存在差異，說明TaGAMyb-B基因在不同休眠特性小麥材料中的等位變異影響了其表達。

關(guān)鍵詞：小麥；TaGAMyb-B；等位變異；RT-PCR

GAMyb是赤霉素(GA)誘導(dǎo)的一種典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，最早是從大麥糊粉層細胞中鑒定出來的，分布在細胞核和細胞質(zhì)中，作用于種子的成熟、胚乳的發(fā)育、花的發(fā)育和莖稈的伸長過程[1-5]。在玉米和大麥中，GAMyb通過直接和GARE元件的核心序列(TAACAA/GA)結(jié)合，誘導(dǎo)與種子萌發(fā)有關(guān)的水解酶類基因的表達，包括α-淀粉酶、蛋白酶、細胞壁降解蛋白等水解酶[6-8]。當(dāng)大麥種子萌發(fā)時糊粉層中HvGAMyb基因的表達量隨著GA含量的上升而增加，α-淀粉酶的量也隨之增加[1]。隨后發(fā)現(xiàn)，HvGAMyb基因表達的時間在α-淀粉酶基因表達之前，證明α-淀粉酶基因是HvGAMyb基因調(diào)控的下游基因[1]。HvGAMyb基因不僅能誘導(dǎo)α-淀粉酶基因的表達，也能誘導(dǎo)蛋白酶和葡聚糖酶基因的表達[1]。小麥籽粒中α-淀粉酶、蛋白酶、細胞壁降解蛋白等水解酶的活性與穗發(fā)芽抗性密切相關(guān)。在小麥中，TaGAMyb基因已被克隆，并定位在染色體的3AL3-0.42-0.78、3BL7-0.63-1.00和3DL3-0.81-1.00位置[9]，同時Grit等[9]在155份大麥和42份小麥材料中對HvGAMyb和TaGAMyb基因的多態(tài)性進行了鑒定，結(jié)果在155份大麥中鑒定出18種單倍型，在42份小麥中的A、B和D染色體上分別鑒定出1種、7種和3種單倍型，也就是說不同基因型小麥材料中的TaGAMyb-A是完全保守的，但是TaGAMyb-B和TaGAMyb-D在不同基因型材料中具有很多的等位變異，而且TaGAMyb-B比TaGAMyb-D的變異更加豐富。也就是說TaGAMyb基因在小麥的B和D染色體上存在等位變異。而且利用QTL定位進一步發(fā)現(xiàn)，TaGAMyb基因影響小麥的穗發(fā)芽抗性[10-11]。種子的休眠特性是影響小麥穗發(fā)芽抗性的主要因素[12]。但是在不同休眠特性的小麥材料中TaGAMyb基因是否也存在等位變異？以及這些等位變異是否與小麥種子不同的休眠特性相關(guān)？到目前為止，這些疑問還沒有被回答?；贕AMyb基因在萌發(fā)種子中的功能以及小麥抗穗發(fā)芽機理研究的緊迫性，本研究擬對不同休眠特性小麥材料種子中TaGAMyb-B的等位變異和表達特性進行研究鑒定，以期進一步完善小麥籽粒休眠的分子機理。

1材料與方法

1.1材 料

供試材料為9份具有不同休眠特性的小麥材料，具體包括京冬1號、豐抗15、克壯、白駱駝、許躍6號、萬縣白麥子、淄麥12、濟麥19和小白玉花，其發(fā)芽指數(shù)(Germination index, GI)分別為92.5%、92.0%、3.5%、0、2.0%、7.6%、40.1%、58.4%和4.0%，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)功能實驗室收集并保存。

1.2方 法

1.2.1引物設(shè)計

根據(jù)TaGAMyb-A、TaGAMyb-B和TaGAMyb-D基因[9]的序列差異，設(shè)計分段擴增TaGAMyb-B基因的特異性引物 GAMyb-B1、GAMyb-B2、GAMyb-B3和GAMyb-B4。TaGAMyb-B基因特異性表達引物RT-TaGAMyb-B的下游序列與引物GAMyb-B3的下游序列相同，而上游序列是根據(jù)目的片段適中的原則所設(shè)計(表1)。所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2TaGAMyb-B基因的克隆

利用CTAB法提取小麥幼葉中的總DNA。 PCR擴增體系(15 μL)：10 × ExTaqBuffer 1. 5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 1.2 μL，正、反向引物(20 μmol·L-1)各0.3 μL，DNA 0.6 μL，ExTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.15 μL(TaKaRa公司)，ddH2O 10.95 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶回收，連接到PMD19-T載體(TaKaRa公司)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，最后篩選陽性克隆并送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，把4對特異性引物GAMyb-B1、GAMyb-B2、GAMyb-B3和GAMyb-B4擴增得到的序列進行拼接后，得到TaGAMyb-B基因的全長。1.2.3TaGAMyb-B基因的半定量RT-PCR分析

分別取濟麥19和小白玉花拔節(jié)后第二莖節(jié)、葉片及開花后10、20和30 d的種子，用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa公司)試劑盒提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 RTaseM-MLV(TaKaRa公司)(200 U·μL-1)合成第一鏈cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，以小麥β-action基因為內(nèi)參進行半定量RT-PCR分析。反應(yīng)體系(15 μL)：10 × LA PCR Buffer 1.5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTP Mixture 1.2 μL，20 μmol·L-1的正、反向引物各0.3 μL，500 ng·μL-1的cDNA0.6 μL，LATaqDNA聚合酶 0.15 μL(TaKaRa 公司)，ddH2O 10.95 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測。試驗設(shè)置了3次生物學(xué)重復(fù)。

表1　本研究所用的引物

2結(jié)果與分析

2.1TaGAMyb-B基因的克隆及分析

利用引物GAMyb-B1、GAMyb-B2、GAMyb-B3和GAMyb-B4對9份不同休眠特性的小麥材料進行PCR擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，只有用引物GAMyb-B2擴增產(chǎn)物得到了多態(tài)性片段(圖2)，而用引物GAMyb-B1、GAMyb-B3和GAMyb-B4擴增的產(chǎn)物中沒有檢測到多態(tài)性片段(圖1、圖3、圖4)。將利用引物GAMyb-B2所擴增的兩種片段切膠回收、克隆及測序后，發(fā)現(xiàn)在京冬1號、豐抗15、克壯、白駱駝、萬縣白麥子和小白玉花中所擴增片段大小為764 bp，而在濟麥 19、淄麥 12和許躍 6 號中所擴增片段大小為659 bp。將擴增的兩種序列與TaGAMyb-A、TaGAMyb-B和TaGAMyb-D基因序列比對分析，結(jié)果表明，這兩種序列屬于TaGAMyb-B基因序列。與659 bp序列相比，764 bp序列在第一內(nèi)含子中有84 bp的插入，進一步對其二級結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)這個84 bp的插入序列具有一個比較完整的反相重復(fù)序列結(jié)構(gòu)(圖5)。

對利用引物GAMyb-B1、GAMyb-B2、GAMyb-B3和GAMyb-B4擴增濟麥19和小白玉花對得到的序列進行拼接，得到濟麥19和小白玉花TaGAMyb-B基因的全長序列。將拼接得到的全長序列與已知TaGAMyb-B基因序列(GenBank登錄號為EF114880.1)進行比對分析，發(fā)現(xiàn)獲得的濟麥19和小白玉花TaGAMyb-B基因的全長序列分別為3 443 bp和3 535 bp，且與EF114880.1同源性分別為97.27%和95.02%；調(diào)控區(qū)均有824 bp；編碼區(qū)均有1 653 bp；共3個外顯子和2個內(nèi)含子。濟麥19和小白玉花的TaGAMyb-B基因序列在5′調(diào)控區(qū)均有1個位于-760 bp的單堿基C插入、1個位于-536 bp的單堿基T缺失及7個分別位于-767 bp(C→T)、-363 bp(A→G)、-304 bp(A→G)、-280 bp(G→C)、-248 bp(T→G)、-247 bp(C→T)和-188 bp(A→C)的SNP；在第一內(nèi)含子中，濟麥19來源的TaGAMyb-B基因序列有1個位于1 018 bp的單堿基T缺失、 1個位于1 073 bp的CT缺失及6個分別位于433 bp(C→A)、434 bp(A→G)、435 bp(G→T)、436 bp(T→A)、957 bp(T→C)和1 122 bp(G→C)的SNP，小白玉花來源的TaGAMyb-B基因序列有1個位于741 bp的84 bp序列插入及7個分別位于433 bp(C→A)、434 bp(A→G)、435 bp(G→T)、436 bp(T→A)、957 bp(T→C)、996 bp(T→C)和1 122 bp(G→C)的SNP；在第二外顯子中，濟麥19來源的TaGAMyb-B基因序列有1個位于2 161 bp的TTT(編碼苯丙氨酸)插入及5個分別位于1 473 bp(T→C)、1 839 bp(T→C)、1 841 bp(T→C)、1 904 bp(T→C)和 1 995 bp(T→C)的SNP，其中，位于1 839 bp和1 904 bp的SNP均造成推導(dǎo)編碼的氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔“子窕▉碓吹腡aGAMyb-B基因序列在1 839 bp、1 841 bp、1 904 bp、1 995 bp和2 161 bp處與濟麥來源的TaGAMyb-B基因序列具有相同的SNP和Indel。由以上分析可知，與濟麥19來源的TaGAMyb-B基因序列相比，小白玉花來源的TaGAMyb-B基因序列在第一內(nèi)含子中有1個位于996 bp(T→C)的SNP及3個分別位于741 bp、1 018 bp和1 073 bp的84 bp的插入、CT的插入和T的插入；在第二外顯子中，有1個位于1 473 bp的SNP(C→T)。說明濟麥19和小白玉花來源的2個TaGAMyb-B基因為2個新的等位變異，分別命名為TaGAMyb-Ba和TaGAMyb-Bb，并將其提交至GenBank數(shù)據(jù)庫得到注冊號分別是KU589288和 KU589289。

M：DL2000；1：京冬1號；2：豐抗 15；3：克壯；4：白駱駝；5：濟麥 19；6：淄麥 12；7：許躍 6 號；8：萬縣白麥子；9：小白玉花。下同

M：DL2000；1：Jingdong 1；2：Fengkang 15；3：Kezhuang；4：Bailuotuo；5：Jimai 19；6：Zimai 12；7：Xuyue 6；8：Wanxianbaimaizi；9：Xiaobaiyuhua. The same as below

圖1引物GAMyb-B1在不同休眠特性小麥材料中的擴增結(jié)果

Fig.1The PCR fragments amplified with the primer set GAMyb-B1 in wheat cultivars with different depth of dormancy

圖2　引物GAMyb-B2在不同休眠特性小麥材料中的擴增結(jié)果

圖3　引物GAMyb-B3在不同休眠特性小麥材料中的擴增結(jié)果

圖4　引物GAMyb-B4在不同休眠特性小麥材料中的擴增結(jié)果

圖5　TaGAMyb-Bb基因中84 bp插入堿基的二級結(jié)構(gòu)圖

2.2TaGAMyb-B基因的表達特性

用半定量RT-PCR方法對濟麥19和小白玉花的TaGAMyb-B基因轉(zhuǎn)錄本進行研究，測序結(jié)果表明，兩品種TaGAMyb-B基因轉(zhuǎn)錄本沒有結(jié)構(gòu)差異，只存在轉(zhuǎn)錄本表達水平的差異。在開花后10 d和20 d時，小白玉花中TaGAMyb-B基因的轉(zhuǎn)錄本表達水平均高于濟麥19，而在開花后30 d的種子中，濟麥19中該基因的轉(zhuǎn)錄本表達水平略高于小白玉花，說明TaGAMyb-B基因在種子發(fā)育的較早期時單倍型TaGAMyb-Bb的表達量高于單倍型TaGAMyb-Ba的表達量，而在種子發(fā)育的較晚期單倍型TaGAMyb-Ba的表達量高于單倍型TaGAMyb-Bb的表達量。另外，在拔節(jié)期，濟麥19在第二莖節(jié)和葉片中該基因的轉(zhuǎn)錄本表達水平均高于小白玉花(圖 6)。

M：DL2000；1：濟麥 19；2：小白玉花；A～C:花后10、20和30 d的種子；D:拔節(jié)期的第二莖節(jié)；E:拔節(jié)期的葉片

M：DL2000；1：Jimai 19；2：Xiaobaiyuhua；A-C：Seeds of 10, 20 and 30 d after flowering；D:The second internode at elongation stage；E:Leaves at jointing stage

圖6濟麥19和小白玉花TaGAMyb-B基因的半定量RT-RCR分析

Fig.6Characterization of transcriptional pattern ofTaGAMyb-Bgene with semi-quantitative RT-PCR in Jimai 19 and Xiaobaiyuhua

3討 論

種子休眠特性與小麥的穗發(fā)芽抗性高度相關(guān)[12]。目前已經(jīng)知道GA和ABA是影響小麥籽粒休眠的兩大內(nèi)源性激素[13]。其中，TaGAMyb是GA信號途徑中參與種子萌發(fā)的一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子[14]。本研究在不同休眠特性的小麥材料中發(fā)現(xiàn)TaGAMyb-B基因存在2種新的等位變異TaGAMyb-Bb和TaGAMyb-Ba。與TaGAMyb-Ba基因相比，TaGAMyb-Bb基因在第一內(nèi)含子中存在一個84 bp的插入序列，而且該插入序列的二級結(jié)構(gòu)是一個比較完整的反向重復(fù)序列，可能扮演轉(zhuǎn)座子的功能。該序列與小麥中國春的一個腳手架基因(GenBan登錄號為HG670306.1)有100%的同源性。目前的研究已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子區(qū)域的差異在功能特性方面扮演著非常重要的角色。例如，MYCH(肌球蛋白重鏈)基因的內(nèi)含子包含一個重要的正調(diào)控元件，類似TATA內(nèi)含子啟動子，有一個共識別轉(zhuǎn)錄起始元件，它能夠上調(diào)內(nèi)源或異源肌肉啟動子，驅(qū)動報告基因[15]。本研究在種子發(fā)育的不同時間，等位變異TaGAMyb-Bb與TaGAMyb-Ba相比，轉(zhuǎn)錄本的表達量增加較緩慢，到開花后30 d時等位變異TaGAMyb-Ba的表達量大于TaGAMyb-Bb。進一步說明TaGAMyb-B基因在內(nèi)含子中的SNPs和Indel確實影響了該基因轉(zhuǎn)錄本的表達量，而TaGAMyb是GA信號途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，GA具有破除種子休眠的能力，TaGAMyb-B基因在小白玉花和濟麥19 中的基因序列差異可能是導(dǎo)致種子在蠟熟期間小白玉花的發(fā)芽指數(shù)顯著低于濟麥19的另一個重要的原因。但是在本研究中，京冬1號和豐抗15雖然屬于TaGAMyb-Bb等位基因類型，但是其發(fā)芽指數(shù)卻分別高達92.5%和92.0%；另外許躍6號雖然屬于TaGAMyb-Ba等位基因類型，但是其發(fā)芽指數(shù)只有2.0%。那么TaGAMyb-B基因不同的等位變異究竟是否為影響小麥不同休眠特性的原因呢？這還需要通過轉(zhuǎn)基因或者培育一個更大的雜交群體進行更為深入的研究來證實。另外影響小麥休眠特性的因素很多。目前我們的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn) Vp-1B基因和 Vp-1A基因[16-17]以及Tamyb-D基因[18]的不同等位變異均與小麥的休眠特性密切相關(guān)。根據(jù)影響小麥不同休眠特性的這些基因的等位變異開發(fā)了與小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，如果把這些標(biāo)記結(jié)合起來一起對小麥的穗發(fā)芽抗性或休眠特性進行篩選，篩選準(zhǔn)確率將會得到很大提高[17,19]，例如許躍6號在本研究中屬于TaGAMyb-Ba基因型，但同時又屬于 TaVp1-Bc抗穗發(fā)芽的等位基因類型。

小白玉花是地方小麥品種，濟麥19是栽培小麥品種。在植株的發(fā)育早起，濟麥19具有更強的生長勢，表現(xiàn)在植株葉片的顏色、葉片的寬度、莖干的粗度和分蘗能力等方面。TaGAMyb基因具有促進植株生長的功能[9]。小麥植株的第二莖節(jié)是聯(lián)系根和葉的營養(yǎng)器官。拔節(jié)期后，第二莖節(jié)中濟麥19的TaGAMyb基因表達量大于小白玉花，這與其整個發(fā)育期表現(xiàn)相符。另外，在不同休眠特性小麥材料中，TaGAMyb-B基因比TaGAMyb-D和TaGAMyb-A基因具有更為豐富的突變類型(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這一結(jié)果與Grit等[9]的研究結(jié)果相符，進一步證實了在小麥的進化過程中有更豐富的B基因組供體參與。

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收稿日期：2016-01-26修回日期：2016-03-12

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31260320; 31160247)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2014MS0338)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)秀青年科學(xué)基金項目(2014XYQ-18)

通訊作者：楊 燕(E-mail：yangyanchutao@126.com)

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)06-0708-06

Identification and Expression ofTaGAMyb-Bin Wheat with Different Depth of Dormancy

LIU Jinying, DONG Xue, FENG Yumei, WEI Xu, YANG Yan

(The functional laboratory of plant biotechnology, College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot, Inner Mongolia 010018, China)

Abstract:The protein encoded by GAMyb was an activated transcription factor in gibberellin signalling, which plays an important role in promoting seed development. In this study, the specific primers were designed according the TaGAMyb sequence which located on 3A,3B and 3D chromosomes and allelic variations and transcriptional level were identified in order to investigate whether the GAMyb is one of reasons leading wheat seeds with different depth of dormancy. The data showed that there are many SNPs and Indels in TaGAMyb-B in cultivars with different dormancy levels. Thus, two alleles were designated as TaGAMyb-Ba and TaGAMyb-Bb. Moreover, different transcriptional levels were detected in different cultivars with allelic variation of TaGAMyb-B. This results indicated that the allelic variations in TaGAMyb-B affect its transcriptional level.

Key words:Wheat; TaGAMyb-B; Allelic variants; RT-PCR

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1535.008.html

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