漾濞大泡核桃JsWRKY1過表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性

王國東，陳朝銀，李金晶，普麗梅，關(guān)瑞攀，葛 鋒，劉迪秋

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500）

漾濞大泡核桃JsWRKY1過表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性

王國東，陳朝銀，李金晶，普麗梅，關(guān)瑞攀，葛 鋒，劉迪秋

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500）

為進(jìn)一步研究JsWRKY1的生物學(xué)功能，構(gòu)建JsWRKY1的植物超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入煙草中過表達(dá)。再生的JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在表型上無明顯差異。JsWRKY1過表達(dá)上調(diào)了轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)幾個防衛(wèi)相關(guān)基因MnSOD、Cu/ZnSOD、CN、NADPH oxidase和PR1的轉(zhuǎn)錄水平。與野生型煙草相比，JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶活性在正常生長以及膠孢炭疽菌接種后均顯著增強(qiáng)。平板抑菌試驗結(jié)果顯示，JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草葉片總蛋白對病原真菌葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長具有不同程度的抑制作用。此外，用膠孢炭疽菌接種煙草葉片，轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性明顯增強(qiáng)。顯然，JsWRKY1是漾濞大泡核桃中正調(diào)控病害防衛(wèi)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。

漾濞大泡核桃；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；防衛(wèi)相關(guān)基因；抗氧化酶類；膠孢炭疽菌

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族，主要參與植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［1］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控植物體內(nèi)抗病相關(guān)基因的表達(dá)提高植物體的抗性。WRKY轉(zhuǎn)錄因子中包含一個或更多高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，WRKY結(jié)構(gòu)域由大約60個氨基酸殘基組成，其中在N末端有高度保守的7個氨基酸殘基WRKYGQK。多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域中還含有一個鋅指結(jié)構(gòu)，C2H2型（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）或C2HC型（C-X7-C-X23-H-X1-C）鋅指結(jié)構(gòu)［2］。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及所含鋅指結(jié)構(gòu)的特征可以將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三大類，第Ⅰ類含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，第Ⅱ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，第Ⅲ類也含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和一個C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)［2］。

WRKY基因最早于1994年從甘薯（Impoea batatas）中分離出來［3］。至今為止，已經(jīng)在很多種植物中發(fā)現(xiàn)了WRKY基因的存在。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物對病原體防衛(wèi)反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用。水稻（Oryza sativa）Os-WRKY13的超表達(dá)無論在苗期還是成株期都增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對白葉枯?。╔anthomonas campestris pv. Oryzae）和稻瘟?。∕agnaporthe oryzae）的抗性［4］。OsWRKY22缺失的水稻突變體對稻瘟病的敏感性增強(qiáng)，而超表達(dá)OsWRKY22則可以提高轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的抗性［5］。在水稻中過表達(dá)OsWRKY53也增強(qiáng)了對稻瘟病的抗性［6］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達(dá)AtWRKY28增強(qiáng)對甘藍(lán)鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的抗性［7］。過表達(dá)Pt-WRKY23的轉(zhuǎn)基因楊樹（Populus tremula）對Melampsora spp.的抵抗能力顯著增加［8］。PtWRKY14超表達(dá)則可增強(qiáng)煙草（Nicotiana tabacum）對TMV侵染的抵抗能力［9］。研究表明，一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控植物對生物和非生物脅迫有防衛(wèi)反應(yīng)。擬南芥AtWRKY38和AtWRKY62與組蛋白去乙?；?9共同作用負(fù)調(diào)控擬南芥的基本防御［10］。

核桃（Juglans）是世界重要的堅果類果樹和木本油料樹種，我國核桃栽培歷史已有2 000多年，現(xiàn)出口量居世界第2位。漾濞大泡核桃（J.sigillata Dode），原產(chǎn)云南省漾濞縣，現(xiàn)廣泛分布于云南10余個縣，以及貴州、四川等省份的部分地區(qū)，為云南的早期無性優(yōu)良品種。漾濞大泡核桃具有果大、殼薄、仁厚、味香、含油率高等優(yōu)點(diǎn)，是云南省重要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一，對云南的核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展起著重要的作用［11］。然而，隨著核桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，病蟲害問題日益凸顯，尤其是真菌病害。常見的核桃病害主要有灰斑病、黑斑病、炭疽病等。前期研究中，從漾濞大泡核桃中克隆獲得一個Ⅱc類WRKY基因JsWRKY1，水楊酸、茉莉酸、H2O2和乙烯等幾種逆境脅迫相關(guān)信號分子處理均上調(diào)JsWRKY1在漾濞大泡核桃葉片中的表達(dá)量，同時JsWRKY1快速響應(yīng)膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的侵染，膠孢炭疽菌接種后4 h，轉(zhuǎn)錄物在葉片中大量富集［12］。為進(jìn)一步研究JsWRKY1的生物學(xué)功能，構(gòu)建了JsWRKY1的植物超表達(dá)載體將其轉(zhuǎn)入煙草中超表達(dá)，并對轉(zhuǎn)基因煙草中幾個防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)以及抗氧化酶活性進(jìn)行分析，還檢測了JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草在體外對幾種病原真菌的抗性，尤其是JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

遺傳轉(zhuǎn)化所用無菌煙草苗由生物資源開發(fā)與利用實驗室培養(yǎng)。將煙草（N.tabacum L.cv Xanthi）種子表面消毒后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)的幼苗繼代培養(yǎng)8周后用于轉(zhuǎn)基因。所用病原真菌葡萄座腔菌（Botrosphaeria dothidea）、串珠狀赤霉菌（Gibberella moniliformis）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）均由本實驗室分離鑒定并保存，使用前接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。

1.2 JsWRKY1植物超表達(dá)載體構(gòu)建

本試驗采用pCAMBIA2300S作為植物超表達(dá)載體，其T-DNA區(qū)含有2個花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子，并具有卡那霉素抗性基因NPTⅡ。在擴(kuò)增JsWRKY1 ORF的特異引物的5′端分別添加限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ的識別位點(diǎn)，并合成特異性引物5′-GGATCCTGTAAAAC CTATTCGGACATTCTTC-3′和5′-GAATTCACCGAG GAGGGAGGCAGGT-3′擴(kuò)增JsWRKY1的ORF。擴(kuò)增產(chǎn)物首先連接到pMD-18T載體（TaKaRa，Japan）中。重組載體pMD-18T-JsWRKY1經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切后獲得JsWRKY1的ORF，并與用同樣的限制性內(nèi)切酶消化后的pCAMBIA2300S空載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物pCAMBIA2300S-JsWRKY1（圖1）轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株中，并通過PCR篩選獲得陽性克隆。

1.3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化

采用凍融法將重組載體pCAMBIA2300SJsWRKY1轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株中，通過PCR篩選陽性克隆。用含重組載體pCAMBIA2300S-JsWRKY1的農(nóng)桿菌LBA4404菌液浸染煙草無菌苗的葉盤。在無菌條件下將幼嫩的煙草葉片剪成約1 cm2的葉盤，將葉盤浸入農(nóng)桿菌菌液中，浸染15 min后用無菌濾紙將葉盤表面的菌液吸干，把葉盤平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)48 h。暗培養(yǎng)結(jié)束后，將葉盤轉(zhuǎn)至煙草篩選培養(yǎng)基上并放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃，光照16 h/d）。分化再生的幼苗轉(zhuǎn)入含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L頭孢霉素的煙草生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

圖1 JsWRKY1基因表達(dá)框Fig.1 The exp ression cassette of JsWRKY1

1.4 陽性轉(zhuǎn)基因煙草篩選

采用CTAB法提取再生煙草植株的基因組DNA，取1μL所提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性并測其濃度。并以再生煙草植株的基因組DNA為模板用JsWRKY1的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。分別以pMD-18T-JsWRKY1質(zhì)粒和野生型煙草（W ild type，WT）的基因組DNA為陽性對照和陰性對照。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取8μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并挑選陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株。T0陽性轉(zhuǎn)基因煙草于溫室中培養(yǎng)，獲得T1轉(zhuǎn)基因煙草。

1.5 煙草葉片RNA提取及qRT-PCR（Quan tita-tive reverse transcrip tion-PCR）

采用異硫氰酸胍一步法提取T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總RNA，并采用GoScriptTMReverse試劑盒（Promega）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。接著采用Real-time PCR分析JsWRKY1在T1煙草葉片中的表達(dá)水平。此外，還通過qRT-PCR分析7個防衛(wèi)相關(guān)基因（MnSOD、CN、NADPH oxidase、Cu/ZnSOD、MYC、PR1和Osmotin）在T1轉(zhuǎn)基因煙草植株和WT煙草葉片中的轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)條件為：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)，之后進(jìn)行熔解曲線分析。以煙草Actin基因作為內(nèi)參基因，qRT-PCR中每個反應(yīng)均設(shè)置3次重復(fù)，并采用2-ΔΔCT法計算得出相對表達(dá)水平?；虻囊镄蛄幸姳?。

1.6 酶活性測定

取正常生長及膠孢炭疽菌接種后10 d的煙草葉片，提取粗酶液，酶液中的蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法。煙草葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性測定參照Gay和Tuzun［13］的方法。試管中依次加入50 mmol/L PBS（pH值7.8） 0.8 mL、26 mmol/L L-蛋氨酸（L-methionine）1.5 mL、0.75 mmoL/L四唑氮藍(lán)（NBT）0.3 m L、粗酶液0.1 m L，20μmol/L核黃素（Riboflavin）0.3 m L，充分搖勻，以25℃暗反應(yīng)作為空白對照，在25℃、光強(qiáng)為45 000 lux的培養(yǎng)箱內(nèi)光照15 m in后迅速取出在560 nm波長下測定OD值，以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活單位?？箟难徇^氧化物酶（Ascorbateperoxidase，APX）活性的測定參照Nakano和Asada［14］的方法。取1.5 m L 50 mmol/L（pH值7.0）磷酸鈉緩沖液加入50μL粗酶液，混勻，作為控制參照。最后在其他比色皿中加入1.5 m L 50 mmol/L反應(yīng)液，并加入100μL 1 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，在290 nm處每20 s測定一次OD值。過氧化物酶（Peroxidase，POD）酶活測定采用愈創(chuàng)木酚法［15］，取試管加入3 mL反應(yīng)液以及30μL酶液，以PBS為對照調(diào)零，在波長為470 nm處每隔40 s測一次OD值。以每1 m in OD值變化0.01為1個酶活單位（U）。

表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 The prim er sequences used in qRT-PCR

1.7 轉(zhuǎn)基因煙草粗蛋白的體外平板抑菌試驗

參照Li等［16］的方法提取4個T1轉(zhuǎn)基因煙草和WT植株葉片的總蛋白。幾種供試病原真菌活化培養(yǎng)后取適量菌絲接種于新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，待真菌菌落直徑生長至大約2～3 cm時，在菌落周圍均勻放置直徑約為0.8 mm的無菌濾紙片，并將所提取的煙草粗蛋白濃度分別稀釋到5 mg/m L，分別取20μL蛋白溶液滴到濾紙片上，以蛋白提取緩沖液為空白對照。置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，培養(yǎng)期間觀察轉(zhuǎn)基因及野生型煙草葉片總蛋白對幾種真菌生長的抑制情況。

1.8 轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽菌的抗性分析

將膠孢炭疽菌接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)5～7 d，用無菌水洗脫分生孢子，并制成孢子懸液。以溫室栽培的JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草為試材，用砂紙在葉片上輕輕摩擦出同等規(guī)格的傷口，接上200μL的孢子懸液，然后用保鮮膜包裹葉片保持濕度。10 d后，收集接種葉片，觀察JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草葉片和野生型煙草葉片受膠孢炭疽菌侵染的發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)生與篩選

在前期研究中，基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果從漾濞大泡核桃中分離克隆了一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因JsWRKY1，本試驗成功構(gòu)建了JsWRKY1的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300S-JsWRKY1，并采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。利用攜帶有JsWRKY1表達(dá)框的根癌農(nóng)桿菌LBA4404分12次浸染200多個煙草葉盤。挑選生長良好的具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草再生植株49株，經(jīng)PCR分析檢測獲得具有目的基因JsWRKY1的陽性轉(zhuǎn)基因煙草35株，即為JsWRKY1的T0轉(zhuǎn)基因煙草，部分煙草轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果如圖2所示。將JsWRKY1的T0轉(zhuǎn)基因煙草種于溫室中培養(yǎng)并獲得 T1植株。JsWRKY1超表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株與WT煙草的生長發(fā)育及形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。隨后，隨機(jī)選取8個轉(zhuǎn)基因株系W 8、W 11、W 14、W 15、W 17、W 18、W 33和W 43進(jìn)行基因表達(dá)分析。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測Fig.2 PCR analysis of som e JsWRKY1 transgenic tobacco p lantlets w ith resistance to K anam ycin

2.2 JsWRKY1在T1轉(zhuǎn)基因煙草中大量表達(dá)

利用qRT-PCR檢測8個轉(zhuǎn)基因煙草株系中JsWRKY1的表達(dá)水平，試驗結(jié)果表明，JsWRKY1在8個陽性轉(zhuǎn)基因煙草株系中均檢測到JsWRKY1轉(zhuǎn)錄物的積累，而在WT中未檢測出JsWRKY1（圖3）。就相對表達(dá)水平而言，JsWRKY1在W 43株系中的表達(dá)量最高，在W15株系中的表達(dá)量最低，在W 17和W 18株系中也大量表達(dá)。可見受CaMV 35S啟動子控制的JsWRKY1基因在T1轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定表達(dá)。挑選JsWRKY1表達(dá)水平相對較高的4個轉(zhuǎn)基因株系W 8、W 17、W18、W 43進(jìn)行后續(xù)試驗。2.3 幾個防衛(wèi)相關(guān)基因在JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)

圖3 JsWRKY1在轉(zhuǎn)基因T1植株中的表達(dá)水平分析Fig.3 qRT-PCR analysis for JsWRKY1 expression levels in several transgenic T1 tobacco lines

利用qRT-PCR分析7個抗逆相關(guān)基因（Mn-SOD、C N、Cu/ZnSOD、NADPH oxidase、MYC、PR1和Osmotin）在JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)水平的變化，試驗如圖4所示。與野生型煙草（WT）相比，Osmotin在4個JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)量明顯降低。然而其他6個基因在JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)水平均表現(xiàn)出不同程度地上調(diào)。而且，不同轉(zhuǎn)基因煙草株系中同一個基因的表達(dá)水平也不盡相同。MYC和Cu/ZnSOD在各轉(zhuǎn)基因煙草株系中表達(dá)水平的上調(diào)幅度較為一致，分別約為WT的3.5～4.5，11.0～13.5倍；另外4個抗逆相關(guān)基因在幾個JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系中表達(dá)水平差異較大，尤其是PR1，PR1在轉(zhuǎn)基因煙草株系W 17中的表達(dá)水平約為WT的10.3倍，而在轉(zhuǎn)基因煙草株系W 18中的表達(dá)水平約為WT的86.5倍。上述結(jié)果表明，JsWRKY1在轉(zhuǎn)基因煙草中的過量表達(dá)提高了MnSOD、C N、NADPH oxidasec、Cu/ZnSOD、MYC和PR1等防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 幾個抗病相關(guān)基因在JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)水平分析Fig.4 qRT-PCR analysis of several disease resistance-related genes in the JsWRKY1 transgenic tobacco lines

2.4 JsWRKY1過表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草中3種抗氧化酶的酶活性

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞正常氧代謝的副產(chǎn)物，并在細(xì)胞信號傳遞和保護(hù)機(jī)體方面起到重要作用，但是在遭受逆境脅迫后，植物細(xì)胞中會積累大量ROS。當(dāng)ROS的積累量超出活性氧清除系統(tǒng)的能力時，植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、膜脂以及其他細(xì)胞組分受到氧化損傷，從而使植物產(chǎn)生各種不良的生理反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至?xí)斐芍仓晁劳?。?xì)胞表達(dá)的POD、SOD和APX等抗氧化酶類，他們協(xié)同作用可以將植物體內(nèi)的活性氧維持在穩(wěn)定水平，從而保證植物的正常生長代謝。為了研究轉(zhuǎn)基因株系中JsWRKY1是否調(diào)控這些抗氧化酶的活性，筆者測定了轉(zhuǎn)基因株系W8、W17、W18、W 43和WT煙草中的POD、SOD和APX酶活（圖5）。正常生長情況下，與野生型煙草相比，幾個JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系中POD、SOD、APX顯著提高，尤其是POD，在所有供試JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系中均極顯著上調(diào)。接種膠孢炭疽菌后，轉(zhuǎn)基因煙草及野生型煙草中POD、SOD、APX均明顯增強(qiáng)，但所有轉(zhuǎn)基因株系中3種抗氧化酶的活力遠(yuǎn)高于野生型煙草。上述結(jié)果無疑表明，POD、SOD和APX活性在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的顯著增強(qiáng)與JsWRKY1的超表達(dá)緊密相關(guān)。

2.5 JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草葉片總蛋白在體外抑菌活性

提取4個JsWRKY1 T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片及WT煙草葉片的總蛋白進(jìn)行體外平板抑菌試驗，結(jié)果如圖6所示，蛋白提取緩沖液（空白對照）對病原真菌葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的生長沒有抑制作用。WT煙草的葉片總蛋白對4種病原真菌的菌絲生長具有較弱的抑制作用。盡管各個株系對不同病原菌的抑菌作用不盡相同，但是4個JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草葉片總蛋白對這4種病原真菌菌絲的生長均表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

圖5 W T及JsWRKY轉(zhuǎn)基因煙草中POD、SOD和APX的酶活Fig.5 The antioxidant enzym e activity of W T and JsWRKY1 transgenic tobacco lines

圖6 JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片總蛋白的體外抑菌活性Fig.6 Antifungal activity of the crude p rotein extract of JsWRKY1 transgenic tobacco lines

圖7 JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系增強(qiáng)對膠孢炭疽菌的抗性Fig.7 Resistance of JsWRKY1 transgenic tobacco lines against C.gloeosporioides in vivo inoculation assay

2.6 JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草增強(qiáng)對膠孢炭疽菌的抗性

用膠孢炭疽菌侵染JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草葉片和野生型煙草葉片，接種10 d后，野生型煙草葉片出現(xiàn)了嚴(yán)重的褪綠黃化，接種部位腐爛，而4個JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草葉片接種后褪綠黃化現(xiàn)象并不明顯，接種部位只表現(xiàn)出輕微的腐爛，可見JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草增強(qiáng)了對膠孢炭疽菌的抗性（圖7）。

3 討論與結(jié)論

在與病原微生物的長期斗爭過程中植物形成了復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)對病原菌的攻擊。植物防衛(wèi)反應(yīng)由相互聯(lián)系的2個分支組成，一是病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP）激發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI），二是效應(yīng)物激發(fā)的免疫（Effector-triggered immunity，ETI）［17］。PTI以及ETI激活局部抗性及系統(tǒng)獲得抗性（System ic acquired resistance，SAR）。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)中的一個調(diào)控蛋白基因家族，主要參與植物免疫系統(tǒng)應(yīng)對多種不同的生物和非生物脅迫［18-19］。WRKY蛋白與靶基因啟動子區(qū)的順式作用元件核心結(jié)構(gòu)是TTGAC（C/T）的W-box特異結(jié)合，即所有啟動子中含W-box的基因都可能是WRKY的靶基因，包括WRKY本身［20］。WRKY結(jié)構(gòu)域由4股β折疊構(gòu)成，保守的WRKYGQK殘基對應(yīng)于N端的β折疊（Strandβ-1），能夠進(jìn)入DNA溝并與DNA上的W盒發(fā)生作用［21］。

已經(jīng)明確WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是PTI以及ETI的關(guān)鍵調(diào)控因子，正向或負(fù)向調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［18，22-23］。OsWRKY13通過激活水楊酸（SA）的生物合成以及SA反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)同時抑制茉莉酸（JA）信號途徑調(diào)控水稻對細(xì)菌病害白葉枯病以及真菌病害稻瘟病的抗性［4，24］。Os-WRKY30超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻提高了對稻瘟病以及紋枯病菌的抗性，抗性的提高與JA生物合成相關(guān)基因、PRs基因的表達(dá)激活以及內(nèi)源JA積累的增強(qiáng)相關(guān)［25］。本試驗對漾濞大泡核桃的一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因JsWRKY1的功能進(jìn)行分析，JsWRKY1超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草株系中，幾個逆境脅迫相關(guān)基因C N、NADPH oxidasec、MYC和PR1的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，暗示JsWRKY1正調(diào)控這些防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)。

植物受病原物侵染過程中，活性氧是一類很重要的信號分子，活性氧分子可以誘導(dǎo)植物對病原物的抗性。但是，氧爆發(fā)時植物體內(nèi)將會產(chǎn)生大量的活性氧，過多的活性氧積累將會對植物產(chǎn)生毒害，并可破壞植物細(xì)胞的正常代謝。本試驗中，qRT-PCR結(jié)果顯示2個編碼SOD的基因MnSOD以及Cu/Zn-SOD在幾個JsWRKY1轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)水平較野生型而言明顯上升。此外，轉(zhuǎn)基因株系的3種抗氧化酶酶活，即SOD、APX、POD在正常生長情況下及接種膠孢炭疽菌接種后顯著增強(qiáng)。顯然，JsWRKY1在煙草中過量表達(dá)不僅調(diào)控幾個SOD基因的轉(zhuǎn)錄水平，還激活了體內(nèi)的SOD、APX、POD酶活性。

目前已從模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中分離了大量WRKY轉(zhuǎn)錄因子。AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY33作為正調(diào)控因子對死體營養(yǎng)型真菌Alternaria brassicicola以及Botrytis cinerea具有抗性［26-27］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族的多個成員正調(diào)控水稻對稻瘟病菌、紋枯病菌等的抗性［4，24-25，28］。在非模式植物中關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的研究也越來越多，如毛白楊（Populus tomentosa）PtoWRKY60、毛果楊（P.trichocarpa）PtrWRKY73、麝香葡萄（Muscadinia rotundifolia）M rWRKY30等WRKY轉(zhuǎn)錄因子均正調(diào)控植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)［29-31］。本試驗中，JsWRKY轉(zhuǎn)基因煙草葉片粗蛋白在體外能夠抑制病原真菌葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長，并且葉片接種試驗結(jié)果也顯示JsWRKY轉(zhuǎn)基因煙草對膠孢炭疽病的抗性明顯增強(qiáng)。上述試驗無疑表明JsWRKY1是漾濞大泡核桃中參與應(yīng)對膠孢炭疽菌防衛(wèi)反應(yīng)的重要調(diào)控因子。

［1］ Rushton P J，Somssich IE，Ringler P，et al.WRKY transcription factors［J］.Trends in Plant Science，2010，15（5）：247-258.

［2］ Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors［J］.Trends in Plant Science，2000，5（5）：199-206.

［3］ Ishiguro S，Nakamura K.Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein，SPF1，that recognizes SP8 sequences in the 5′upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato［J］.Molecular&General Genetics，1994，244（6）：563-571.

［4］ Qiu D，Xiao J，Xie W，et al.Rice gene network inferred from expression profiling of p lants overexpressing Os-WRKY13，a positive regulator of disease resistance［J］. Molecular Plant，2008，1（3）：538-551.

［5］ Abbruscato P，Nepusz T，Mizzi L，et al.OsWRKY22，a monocot WRKY gene，plays a role in the resistance response to blast［J］.Molecular Plant Pathology，2012，13（8）：828-841.

［6］ Chujo T，Takai R，Akimoto-Tomiyama C，et al.Involvement of the elicitor-induced gene OsWRKY53 in the expression of defense-related genes in rice［J］.Biochimica et Biophysica acta，2007，1769（7/8）：497-505.

［7］ 伍林濤，鐘貴買，王健美，等.轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY28在擬南芥與甘藍(lán)鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）親和性互作中的功能分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2012，14（1）：65-71.

［8］ Levée V，Major I，Levasseur C，et al.Expression profiling and functional analysis of PopulusWRKY23 reveals a regulatory role in defense［J］.The New Phytologist，2009，184（1）：48-70.

［9］ 王 興，林善枝.PtWRKY14基因轉(zhuǎn)化煙草及對TMV的抗性影響研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（7）：130-133，141，封2.

［10］ Kim K C，Lai Z，F(xiàn)an B，et al.Arabidopsis WRKY38 and WRKY62 transcription factors interact with histone deacetylase 19 in basal defense［J］.The Plant Cell，2008，20（9）：2357-2371.

［11］ 楊 恩，陳少瑜，張 雨，等.漾濞核桃葉片基因組DNA的兩種提取方法效果比較［J］.西部林業(yè)科學(xué)，2005，34（4）：72-75.

［12］ 張南南，陳朝銀，季 博，等.漾濞大泡核桃WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因JsWRKY1的克隆及表達(dá)特性分析［J］.植物生理學(xué)報，2014（7）：960-966.

［13］ Gay P A，Tuzun S.Temporal and spatial assessment of defense responses in resistant susceptible cabbage varieties during infection with Xanthomonas campestris pv. Campestris［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，2000，57（5）：201-210.

［14］ Nakano Y，Asada K.Hydrogen-peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach-chloroplasts［J］.Plant and Cell Physiology，1981，22（5）：867-880.

［15］ 李合生.植物生理化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000：164-165.

［16］ Li H L，Liu D Q，He H，et al.Molecular cloning of a 14-3-3 protein gene from Lilium regale Wilson and overexpression of this gene in tobacco increased resistance to pathogenic fungi［J］.Scientia Horticulturae，2014，168（3）：9-16.

［17］ Chisholm S T，Coaker G，Day B，et al.Host-microbe interactions：shaping the evolution of the plant immune response［J］.Cell，2006，124（4）：803-814.

［18］ Pandey S P，Somssich IE.The role of WRKY transcription factors in plant immunity［J］.Plant Physiology，2009，150（4）：1648-1655.

［19］ Bakshi M，Oelmüller R.WRKY transcription factors：Jack ofmany trades in plants［J］.Plant Signaling&Behavior，2014，9（2）：e27700.

［20］ Dong J，Chen C，Chen Z.Expression profiles of the ArabidopsisWRKY gene superfamily during plant defense response［J］.Plant Molecular Biology，2003，51（1）：21-37.

［21］ Ciolkowski I，Wanke D，Birkenbihl R P，et al.Studies on DNA-binding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function［J］. Plant Molecular Biology，2008，68（1/2）：81-92.

［22］ Peng Y，Bartley L E，Canlas P，et al.OsWRKY IIa transcription factors modulate rice innate immunity［J］. Rice，2010，3（1）：36-42.

［23］ Hu Y，Dong Q，Yu D.Arabidopsis WRKY46 coordinates with WRKY70 and WRKY53 in basal resistance against pathogen Pseudomonas syringae［J］.Plant Science，2012，185-186：288-297.

［24］ Qiu D Y，Xiao J，Ding X H，et al.OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate-and jasmonate-dependent signaling［J］.Molecular Plant-M icrobe Interactions，2007，20（5）：492-499.

［25］ Peng X，Hu Y，Tang X，et al.Constitutive expression of rice WRKY30 gene increases the endogenous jasmonic acid accumulation，PR gene expression and resistance to fungal pathogens in rice［J］.Planta，2012，236（5）：1485-1498.

［26］ Zheng Z，Qamar S A，Chen Z，et al.Arabidopsis WRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens［J］.The Plant Journal，2006，48（4）：592-605.

［27］ Lai Z，Vinod K，Zheng Z，et al.Roles of Arabidopsis WRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant responses to pathogens［J］.BMC Plant Biology，2008，8：68.

［28］ Wei T，Ou B，Li J，et al.Transcriptional profiling of rice early response to Magnaporthe oryzae identified Os-WRKYs as important regulators in rice blast resistance［J］.PLoSOne，2013，8（3）：e59720.

［29］ Ye S，Jiang Y，Duan Y，et al.Constitutive expression of the pop lar WRKY transcription factor PtoWRKY60 enhances resistance to Dothiorella gregaria Sacc.in transgenic p lants［J］.Tree Physiology，2014，34（10）：1118-1129.

［30］ Duan Y，Jiang Y，Ye S，et al.PtrWRKY73，a salicylic acid-inducible poplar WRKY transcription factor，is involved in disease resistance in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Cell Reports，2015，34（5）：831-841.

［31］ Jiang W，Wu J，Zhang Y，et al.Isolation of a WRKY30 gene from Muscadinia rotundifolia（M ichx）and validation of its function under biotic and abiotic stresses［J］. Protoplasma，2015，252（5）：1361-1374.

Overexpression of a WRKY Transcription Factor Gene from Juglans sigillata Dode Confers Resistance to Colletotrichum gloeosporioides in Transgenic Tobacco Plants

WANG Guodong，CHEN Chaoyin，LI Jinjing，PU Limei，GUAN Ruipan，GE Feng，LIU Diqiu
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

To investigate the function of JsWRKY1，a constitutive expression vector of JsWRKY1 was constructed and transferred into Nicotiana tabacum L.cv Xanthi.There were no visible differences between the positive transgenic plants and WT.The expression levels of several defense-related genes MnSOD，Cu/ZnSOD，CN，NADPH oxidase，and PR1 resistance gene were up-regulated in the transgenic tobacco lines，and the SOD，APX and POD showed significantly higher activities in the transgenic lines than in wild type under normal conditions or after inoculation with C.gloeosporioides.The crude protein extract of transgenic tobacco lines inhibited the hyphal growth of the following four fungi，Botrosphaeria dothidea，Gibberella moniliformis，C.gloeosporioides and Fusarium oxysporum at different degrees.The antifungal activity in vitro plates demonstrated that the activities of SOD in the transgenic tobacco lines were significantly higher than those in WT.Moreover，the transgenic tobacco plants showed strong resistance after inoculation with C.gloeosporioides in the leaves.In conclusion，the JsWRKY1 is a positive transcription factor of J.sigiuata regulating the defense response to pathogens.

Juglans sigillata dode；WRKY transcription factor；Defense-related genes；Antioxidant enzyme；Colletotrichum gloeosporioides

Q78；S436.62 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0155-08

10.7668/hbnxb.2016.03.023

2016-03-11

科技部支撐計劃項目（2011BAD46B00）

王國東（1993-），男，云南普洱人，主要從事生物工程研究。

劉迪秋（1979-），女，湖北建始人，教授，博士，主要從事植物抗病基因工程研究。