基于bchY的內(nèi)蒙古2個(gè)鹽堿湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌多樣性的分析

寶力德，冀錦華，劉柯瀾，馮福應(yīng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

基于bchY的內(nèi)蒙古2個(gè)鹽堿湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌多樣性的分析

寶力德，冀錦華，劉柯瀾，馮福應(yīng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

為進(jìn)一步了解和認(rèn)識(shí)APB及其在鹽堿湖中的生態(tài)功能及其作用機(jī)制，通過構(gòu)建和分析不產(chǎn)氧光合細(xì)菌bchY基因克隆文庫，揭示其中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其與生存環(huán)境的關(guān)系。樣品采自內(nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地鹽堿度較高的扎格斯臺(tái)和達(dá)格淖2個(gè)湖的水樣，提取了樣品總DNA。以bchY作為檢測(cè)APB的通用標(biāo)記，用PCR擴(kuò)增方法構(gòu)建了其bchY文庫，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖均為富營(yíng)養(yǎng)化鹽堿湖，且兩湖鹽度相差很大。利用bchY文庫中核酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行分析，兩文庫覆蓋度均達(dá)93.0%以上，代表性較強(qiáng)，共得到108條bchY編碼的氨基酸序列，以cutoff=0.03和0.12分別在種和屬水平進(jìn)行同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，在cutoff=0.03分為17個(gè)OTUs。兩湖的多樣性指數(shù)（Shannon-Weaver和Simpson）和均勻度指數(shù)（Evenness）較接近，其種群多樣性程度和均勻程度比較相似，但二者的Chao1都不太高，說明兩湖APB的多樣性較低，種群不豐富。達(dá)格淖湖的Margalef指數(shù)較高，說明前者物種數(shù)目比后者多。兩湖的不產(chǎn)氧光合細(xì)菌均屬Alphaproteobacteria綱，最優(yōu)勢(shì)菌群均為Roseibacterium elongatum。同源性及系統(tǒng)發(fā)育性分析表明，達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌的主要類型為AAPB-like類群、多樣性低。

鹽堿湖；不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（APB）；bchY基因；cutoff值；OTUs；系統(tǒng)發(fā)育分析；多樣性；基因克隆文庫

不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（Anoxygenic phototrophic bacteria，APB）多樣性高，APB廣泛分布于自然界的海洋、湖泊和土壤中［1］，對(duì)生物地球化學(xué)循環(huán)的作用舉足輕重［2-5］，具有降解污染物（如農(nóng)藥等）的功能，可作為類胡蘿卜素、維生素和輔酶Q等生物活性物質(zhì)或其他工業(yè)原料如聚羥基丁酯酸（生物塑料原料）等的生產(chǎn)來源［6-9］。多樣性的研究可為認(rèn)識(shí)和利用微生物資源提供基礎(chǔ)［10］。pufM基因被廣泛應(yīng)用于APB多樣性分析［11］?？墒牵琾ufM引物只覆蓋了含有光反應(yīng)中心RC2，含光反應(yīng)中心RC1類型的細(xì)菌如Chlorobi和Heliobacteria等并不包括在內(nèi)，而bchY引物同時(shí)覆蓋含RC1和RC2的細(xì)菌［12］。鹽堿湖具有較高的生產(chǎn)力［13］，是微生物的寶庫［14］。APB多樣性分析目前主要集中在海洋，而對(duì)鹽堿湖的相關(guān)研究還很少［15］。

有5個(gè)細(xì)菌門包含APB，Proteobacteria（紫色細(xì)菌）、Chlorobi（綠色硫細(xì)菌）、Chloroflexi（綠色非硫細(xì)菌）、Acidobacteria（Chloracidobacterium thermophilum）和Firm icutes（日光桿菌）［16］。本研究通過構(gòu)建bchY文庫來研究?jī)?nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地達(dá)格淖和扎各斯臺(tái)鹽堿湖中APB的多樣性，為更全面地了解和認(rèn)識(shí)APB的生態(tài)和資源分布提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品采自內(nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地鹽堿度較高的扎格斯臺(tái)和達(dá)格淖2個(gè)湖的水樣，采樣時(shí)間為2010年5月。用自制簡(jiǎn)便采樣器分別于水深0～20 cm處采樣后混合，混合后的樣品置于已滅菌的塑料瓶中，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水樣的pH值。采集的樣品置于低溫保溫箱中迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室處理。采集的樣品一部分用于測(cè)定水體的硝態(tài)氮（NO3-N）、銨態(tài)氮（NH3-N）、總磷（TP）、鹽度和碳酸根（CO）含量以確定湖中的環(huán)境和水質(zhì)狀況，另一部分用于APB群落結(jié)構(gòu)分析。先用10μm孔徑的濾膜（美國(guó)Millipore公司，直徑45 mm）預(yù)過濾以除去雜質(zhì)和多數(shù)真核生物，再過濾到0.22μm的濾膜上，過濾水樣約150μL，將過濾好的濾膜用錫箔紙包好，經(jīng)液氮速凍后放入-70℃保存?zhèn)溆梅治觯?7］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)境參數(shù)測(cè)定 水樣的鹽度和pH值現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，硝態(tài)氮（NO3-N）、銨態(tài)氮（NH3-N）、總磷（TP）、鹽度和碳酸根（CO）含量經(jīng)預(yù)處理后24 h內(nèi)測(cè)定。

1.2.2 樣品總DNA提取 水樣經(jīng)預(yù)處理后，用凍融和酶解結(jié)合的提取方法，參考Ausubel等［18］的方法進(jìn)行樣品總DNA的提取，所得DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及bchY文庫構(gòu)建 由于引物bchY可以作為檢測(cè)APB的通用標(biāo)記，本試驗(yàn)選用bchY引物bchY_fwd：5′-CCNCARACNATGTGYCCNGCNT TYGG-3′和bchY_rev：5′-GGRTCNRCNGGRAANA TYTCNCC-3′對(duì)湖樣總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增［17］。反應(yīng)體系：2.0μL 10×PCR Buffer（含15 mmol/L MgCl2），1.6μL dNTPs（2.5 mmol/L），引物（20 μmol/L）各0.5μL，0.3μL r Taq聚合酶（5 U/μL），樣品DNA 2.0μL，無菌水12.9μL。反應(yīng)條件使用熱啟動(dòng)和Touch-down PCR程序：97℃5 m in；80℃熱啟動(dòng)后加酶；94℃45 s，40～50℃30 s，72℃1 min，Touch-down 20個(gè)循環(huán)（-0.5℃/個(gè)循環(huán)）；94℃45 s，48℃30 s，72℃1 m in，10個(gè)循環(huán)；72℃10 m in。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（中科瑞泰有限公司）進(jìn)行膠回收。

把回收的產(chǎn)物連接到pEASYTM-T1克隆載體，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布培養(yǎng)，并用M13引物對(duì)克隆進(jìn)行陽性鑒定。

1.2.4 測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析 從構(gòu)建好的文庫中各隨機(jī)挑選90個(gè)陽性克隆送往上海生物工程有限公司（Sangon）進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后的序列用軟件Mallard 1.02檢測(cè)并去除可能的嵌合體（Chimeria），再把剩余序列用軟件DNAMAN翻譯成氨基酸序列后用DOTUR在種水平置信度進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonom ic units，OTUs）的聚類分析，以進(jìn)行兩湖bchY文庫多樣性分析。

把兩文庫的bchY核酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列一起進(jìn)行OTUs分類后，在屬的水平各OTU選取1條代表序列通過BlastP程序找出其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的最相似氨基酸序列，與相似度最低的氨基酸序列共同作為參比序列。用Jones-Taylor-Thornton距離矩陣模型計(jì)算進(jìn)化距離，以鄰接法（Neighbor-Joiningmethod，NJ）用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)驗(yàn)證數(shù)為1 000［19］。得到的序列均已提交至GenBank，登錄號(hào)為KP462748-KP462855。

1.2.5 bchY核酸序列編碼氨基酸序列聚類時(shí)cutoff值的確定 在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過搜索bchY找到bchY氨基酸序列并下載，共191條bchY氨基酸序列，統(tǒng)計(jì)其分類信息及其登錄號(hào)。用Clustal X7.0進(jìn)行多重比對(duì)分析，然后把共有的序列用軟件MEGA 6.0［19］分析距離矩陣，計(jì)算種內(nèi)和屬內(nèi)的平均距離，作為bchY氨基酸序列在種和屬水平進(jìn)行聚類的cutoff值。

1.2.6 多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)分析 多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)反映某群落中物種多少及個(gè)體分布情況。根據(jù)Hill等［20］的方法對(duì)得到的OTUs分類結(jié)果進(jìn)行群落多樣性相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算以下參數(shù)：覆蓋度（Coverage）、多樣性指數(shù)（Shannon-Weaver和Simpson）、均勻度指數(shù)（Evenness和Chao1值）和Margalef多樣性指數(shù)。

Shannon-Weaver指數(shù)（H′）和Simpson指數(shù)（D）反映物種多樣性，前者是一個(gè)綜合了物種豐度和各物種相對(duì)比例的多樣性指數(shù)；后者代表某種生物在群落中所占的優(yōu)勢(shì)程度，公式分別為：

覆蓋率（Coverage）用于評(píng)估構(gòu)建的文庫對(duì)環(huán)境微生物多樣性的體現(xiàn)程度，計(jì)算公式為：C=1-nl/N，nl為僅包含1個(gè)克隆的OTUs數(shù)，N同上。

均勻度指數(shù)Evenness和Chao1值反映群落中不同物種多度分布的均勻程度，計(jì)算公式分別為：E=H′/Hmax；S=S+（a2/2b）。其中Hmax為最大Shannon指數(shù)，大小為log2（S），S同上，S代表預(yù)測(cè)的OTUs總數(shù)，a為只含1個(gè)克隆子的OTUs個(gè)數(shù)，b為含2個(gè)克隆子的OTUs個(gè)數(shù)。

Margalef指數(shù)能反映物種的豐富度，公式為：dMa=（S-1）/ln N，N、S同上所指［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境參數(shù)

對(duì)兩湖的環(huán)境參數(shù)（表1）分析表明，2個(gè)湖的pH值均高于9.0，無機(jī)鹽含量均大于3.5 g/L；且其總氮和總磷含量均超過國(guó)際上對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化定義的標(biāo)準(zhǔn)（TP＞0.11 mg/L，TN＞1.2 mg/L），說明達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖均屬富營(yíng)養(yǎng)化鹽堿湖。兩湖鹽度相差很大。

2.2 bchY氨基酸序列種屬水平聚類cutoff值的確定

通過對(duì)得到的bchY氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)并用MEGA 6.0［19］分析序列的距離矩陣后，統(tǒng)計(jì)得到種和屬內(nèi)的平均距離為0.03，0.12（表2），作為bchY氨基酸序列在種和屬水平進(jìn)行聚類的cutoff值。利用bchY文庫中核酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行分析，兩文庫覆蓋度均達(dá)93%以上，代表性較強(qiáng)，共得到108條bchY編碼的氨基酸序列，以cutoff=0.03和0.12分別在種和屬水平進(jìn)行同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，在cutoff=0.03分為17個(gè)OTUs.

表1 達(dá)格淖和扎各斯臺(tái)鹽堿湖環(huán)境參數(shù)Tab.1 Environm ent param eters of Dagenao and Zagesitai Lakes

表2 純培養(yǎng)不產(chǎn)氧光合細(xì)菌bchY氨基酸序列的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Databases of all bchY am ino acid sequences of APB from cultures

2.3 文庫多樣性指數(shù)分析

分別對(duì)兩湖樣品進(jìn)行了bchY基因克隆文庫的構(gòu)建。經(jīng)去除嵌合體分析后，2個(gè)文庫分別得到65，43條可用序列，用軟件DNAMAN翻譯成氨基酸序列后，再以cutoff值為0.03在種水平將其分別劃分為12，9個(gè)OTUs（表3）。經(jīng)過分析兩湖文庫中bchY多樣性，發(fā)現(xiàn)兩湖的多樣性指數(shù)（Shannon-Weaver和Simpson）和均勻度指數(shù)（Evenness）都非常接近，表明兩湖中種群多樣性程度和均勻程度較為相似，但二者的Chao1都不太高，說明兩湖中兩湖APB的多樣性較低，種群不豐富。達(dá)格淖湖的Margalef指數(shù)較高，說明前者物種數(shù)目比后者多。

圖1為兩湖bchY基因文庫的稀釋曲線（Rarefaction curve），可以看出樣品的稀釋曲線均趨于平緩，并且兩湖的覆蓋度為93.8%，93.0%，說明得到的文庫序列有很好的代表性，能夠很好地反映兩湖中APB的多樣性。

2.4 兩文庫中bchY編碼氨基酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究把2個(gè)文庫得到的108條bchY序列進(jìn)行OTUs分類，在cutoff=0.03水平上從每個(gè)OTU中選取一條代表序列，通過BlastP程序分析其在GenBank數(shù)據(jù)庫中最同源序列以及編碼蛋白（表3）。由于代表序列與其他處于同一OTU中的序列同源性分析結(jié)果基本一致，因此，每個(gè)OTU只選擇一條代表序列翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行同源性（在cutoff=0.03）和系統(tǒng)發(fā)育分析（在cutoff=0.12）。

表3 兩湖樣中bchY序列多樣性指數(shù)分析Tab.3 Diversity index analysis of bchY sequences in two lakes

利用BlastP分析序列的同源性時(shí)發(fā)現(xiàn)，達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖文庫中分別有61，35條bchY序列編碼的氨基酸序列與Roseibacterium elongatum DSM 19469編碼的脫植酸葉綠素還原酶亞基（Chlorophyllide reductase subunit，BchY）同源，約各占兩湖文庫序列的94%，81%，可見2個(gè)文庫中Roseibacterium為最主要的APB類群。扎各斯臺(tái)文庫中有6條（代表序列為b161、b81、b13、b44，約占14%）序列與Loktanella vestfoldensis最接近，而達(dá)格淖文庫中只有a66與之同源。達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖文庫中分別有3條bchY氨基酸序列a8、a119、a125和1條序列b12與Alphaproteobacterium Q-1編碼的脫植酸葉綠素還原酶的52.5 kDa的蛋白鏈同源。扎各斯臺(tái)湖文庫中有1條bchY氨基酸序列b12與Citromicrobium bathyomarinum同源。達(dá)格淖和扎各斯臺(tái)文庫各有2條氨基酸序列（a96、a31和b35、b70）分別與紅桿菌屬的Rhodobacter sp.SW2和Rhodobacter sp.CACIA14H1同源。同源性整體比較發(fā)現(xiàn)，兩文庫中bchY編碼的氨基酸與Loktanella vestfoldensis的同源性最高，均在95%以上。與Roseibacterium elongatum DSM 19469編碼的脫植酸葉綠素還原酶亞基（Chlorophyllide reductase subunit，BchY）同源性在88%～91%。達(dá)格淖文庫中a96、a31編碼的氨基酸序列與Rhodobacter sp.SW 2的同源性較高，為93%。

圖1 兩湖bchY基因克隆文庫稀釋曲線Fig.1 The rarefaction cu rve of bchY gene clone library of two lakes

對(duì)兩湖bchY文庫中在氨基酸序列cutoff=0.12（屬）水平的代表OTU序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。對(duì)其分析發(fā)現(xiàn)，兩湖文庫中所有bchY核酸序列編碼的氨基酸序列均屬于Alphaproteobacteria綱。其中，a92、a 64、a 37、a 54、a 169、a 24、a 83、b70屬于Unknown Group；達(dá)格淖文庫中以a85和a125為代表的bchY序列編碼的氨基酸序列分別與Roseibacterium elongatum DSM 19469和Alpha proteobacterium Q-1聚在同一進(jìn)化分支，且序列編碼脫植酸葉綠素還原酶，說明這類序列與細(xì)菌葉綠素合成有關(guān)［22-23］。扎各斯臺(tái)文庫中以b200和b44為代表的氨基酸序列分別與Citrom icrobium bathyomarinum和Loktanella vestfoldensis聚在同一進(jìn)化分支。b81、a66、b13、b161、b44代表的核酸序列編碼的氨基酸序列均屬于Loktanella屬，根據(jù)最新含細(xì)菌葉綠素a好氧細(xì)菌的分類系統(tǒng)［24］以及Yutin等［12］的研究，Roseibacterium屬和Citrom icrobium屬均屬于含細(xì)菌葉綠素a好氧細(xì)菌，即好養(yǎng)不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（AAPB類群），Loktanella vestfoldensis屬于厭氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌中的紫色硫細(xì)菌或紫色非硫細(xì)菌［12］，結(jié)合表4，在兩湖文庫中，不產(chǎn)氧光合細(xì)菌中的AAPB占主導(dǎo)地位，厭氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌處于居中優(yōu)勢(shì)。

以上結(jié)果表明兩湖的不產(chǎn)氧光合細(xì)菌均屬Alphaproteobacteria綱，最優(yōu)勢(shì)菌群均為Roseibacterium elongatum。同源性及系統(tǒng)發(fā)育性分析表明，達(dá)格淖和扎各斯臺(tái)湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌的主要類型為AAPB-like類群、多樣性低。

表4 達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖不產(chǎn)氧光合細(xì)菌bchY氨基酸序列同源性分析Tab.4 Sim ilarity analysis of Anoxygenic phototrophic bacteria bchY am ino acids sequences of Dagenao Lake and Zagesitai Lake

圖2 達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖bchY核酸序列的編碼氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of am ino acid sequences encoded by bchY nucleotide sequences in Dagenao Lake and Zagesitai Lake

3 討論

3.1 兩湖環(huán)境參數(shù)

達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖的pH值都高于9.0，無機(jī)鹽含量均大于3.5 g/L，屬于鹽堿湖，另外根據(jù)國(guó)際上對(duì)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化定義的標(biāo)準(zhǔn)（TP＞0.11 mg/L，TN＞1.2 mg/L），因此，可以把2個(gè)湖劃在富營(yíng)養(yǎng)化鹽堿湖的范疇。這主要與兩湖所處地理位置以及湖中微生物的群落結(jié)構(gòu)有關(guān)，兩湖位于渾善達(dá)克沙地，該沙地是內(nèi)蒙古中部和東部的四大沙地之一［25］，降雨量逐年減少，夏季蒸騰作用加強(qiáng)，是致使2個(gè)湖泊成為鹽堿湖的主要原因。另外兩湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌能夠通過固氮和固碳作用增加湖水中的氮、碳含量，進(jìn)而增加湖水中碳源和氮源含量，導(dǎo)致了兩湖的富營(yíng)養(yǎng)化，這與張彥茹［26］得出達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖中主要優(yōu)勢(shì)類群為Cyanobacteria和Alphaproteobacteria的結(jié)果一致。兩湖的其他環(huán)境參數(shù)基本相近，只有鹽度相差較大，這可能與采樣的地點(diǎn)選擇有關(guān)。本研究中對(duì)兩湖不產(chǎn)氧光合細(xì)菌多樣性研究對(duì)兩湖富營(yíng)養(yǎng)化的治理提供了一定的理論依據(jù)。

3.2 兩湖文庫多樣性指數(shù)分析

Koblí ek［27］、Yutin［12］和楊彩霞［28］等均做了有關(guān)bchY序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，但并沒有給出確切的不產(chǎn)氧光合細(xì)菌在種屬水平進(jìn)行聚類的cutoff值。關(guān)于bchY文庫中核酸序列編碼氨基酸序列在種和屬水平進(jìn)行OTUs分類所設(shè)定的cutoff值定在0.03（種水平）和0.12（屬水平），本研究是通過下載數(shù)據(jù)庫中所有bchY氨基酸序列，并去除不能進(jìn)行分類的環(huán)境克隆和進(jìn)化距離大于1.0的序列之后，用軟件MEGA 6.0計(jì)算種和屬分類單元內(nèi)序列間的平均距離后得到的。

通過分析本研究中兩湖文庫的多樣性指數(shù)，兩文庫中序列能代表并反映兩湖中APB的多樣性，但兩湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌多樣性不豐富，這與楊彩霞［28］研究接近富營(yíng)養(yǎng)化的烏梁素海bchY多樣性和Salka等［29］對(duì)德國(guó)湖泊以及Jiang等［15］研究堿性西藏湖泊得到的結(jié)論相似，而與Berman等［30］對(duì)淡水湖Lake Kinneret的研究結(jié)果相反。結(jié)合孫鑫鑫等［31］對(duì)烏梁素海富營(yíng)養(yǎng)化湖區(qū)浮游細(xì)菌多樣性研究以及馮勝等［32］對(duì)太湖中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化的響應(yīng)研究，原因可能為兩湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌受富營(yíng)養(yǎng)化等因素的影響而較低。達(dá)格淖湖的Margalef指數(shù)較高，說明前者物種數(shù)目比后者多，可能原因是分析兩湖不產(chǎn)氧光合細(xì)菌多樣性時(shí)所用序列為文庫中bchY核酸序列編碼的氨基酸序列或扎各斯臺(tái)湖文庫中bchY序列經(jīng)去除嵌合體后可用的較少，以致其代表的物種少于達(dá)格淖湖。

3.3 兩湖文庫bchY編碼氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析與類群組成

本研究利用兩湖文庫中bchY核酸序列編碼的氨基酸序列而沒有用bchY核酸序列進(jìn)行兩湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌多樣性的分析，主要是因?yàn)閎chY為功能基因，與核酸序列相比，其編碼的氨基酸序列在APB進(jìn)化過程中變化較小，且其功能隨著核酸序列的突變有可能不會(huì)改變，利用bchY編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析更為可信。

對(duì)兩湖文庫中bchY編碼的氨基酸序列的同源性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩湖中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌種類相似，只有Citromicrobium bathyomarinum和Alpha proteobacterium Q-1分別分布于扎各斯臺(tái)湖和達(dá)格淖湖。其中達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖文庫中分別有61，35條bchY序列（各占總序列的94%，81%）編碼的氨基酸序列與Roseibacterium elongatum DSM 19469編碼的脫植酸葉綠素還原酶亞基（Chlorophyllide reductase subunit，BchY）同源，與b200（Citrom icrobium屬）一起歸為AAPB-like亞群，可見兩湖中的APB主要類群為AAPB-like類群。其余類群包括Loktanella vestfoldensis（厭氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌類群）、Alpha proteobacterium Q-1均為劣勢(shì)類群，但所有這些類群都屬于Alphaproteobacteria綱。這與Salka等［29］和Waidner等［33］的研究結(jié)果以及Maˇsín等［34］認(rèn)為AAPB大量存在于寡營(yíng)養(yǎng)和恒存性的水體中的結(jié)論不太一致，但與Hojerova等［35］認(rèn)為AAPs在更加富營(yíng)養(yǎng)化的環(huán)境中繁殖更加一致。原因一方面是本研究利用氨基酸序列進(jìn)行OTUs的分類并進(jìn)行同源性分析，結(jié)果可能會(huì)與利用核酸序列進(jìn)行分析的結(jié)果有差異性，另一方面可能是在具體試驗(yàn)如從文庫中隨機(jī)挑選克隆子等方面有偏好性或菌群結(jié)構(gòu)地理分布不同以及湖水水質(zhì)情況等其他原因，其具體原因還有待進(jìn)一步分析。

兩文庫中約有90%bchY序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與脫植酸葉綠素還原酶亞基和酶鏈（Chlorophyllide reductase subunit&Chlorophyllide reductase 52.5 kDa chain）同源，說明兩湖中約有90%的不產(chǎn)氧光合細(xì)菌可以產(chǎn)生細(xì)菌葉綠素，能夠進(jìn)行光合作用［21-22］。且有研究發(fā)現(xiàn)，許多光合細(xì)菌在含有光合基因的同時(shí)含有固氮鐵蛋白基因nif［36］，由于APB的固氮和產(chǎn)氫作用是同時(shí)進(jìn)行的，因此，不產(chǎn)氧光合細(xì)菌在利用光合作用進(jìn)行生長(zhǎng)的同時(shí)能進(jìn)行固氮和產(chǎn)氫作用。而且當(dāng)富營(yíng)養(yǎng)化產(chǎn)生的浮游生物死亡沉入水底后被腐敗菌分解產(chǎn)生有毒物質(zhì)，嚴(yán)重污染水質(zhì)，APB能夠利用這些有毒的胺類、H2S、有機(jī)酸等有機(jī)化合物［37-38］作為光合作用的供氫體、碳源和氮源，有較強(qiáng)的分解去除有機(jī)物的生理特性，對(duì)湖水的污染有預(yù)防作用。但與Boeuf等［39］對(duì)北極深海中光合細(xì)菌的多樣性及其對(duì)海洋的重要意義的研究相比，本研究中不產(chǎn)氧光合細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及其與鹽堿湖達(dá)格淖湖和扎各斯臺(tái)湖環(huán)境和水質(zhì)情況之間的生態(tài)關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。

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Diversity of Anoxygenic Photosynthetic Bacterial and Environm ent Adaptation Relationship in Dagenao and Zagesitai Haloalkaline Lakes in Desert Hunshandake

BAO Lide，JI Jinhua，LIU Kelan，F(xiàn)ENG Fuying
（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China）

Reports about research on the diversity of Anoxygenic phototrophic bacteria（APB）in haloalkaline lakes are too rarely.This experiment constructed and analyzed Anoxygenic phototrophic bacteria bchY gene library of Dagenao Lake and Zagesitai Lake to reveal the diversity and community structure of APB in two lakes and their relation with living environment for the sake of understanding APB and their ecology function and its mechanism.The water samples were collected from the Dagenao Lake and Zagesitai Lake which have higher salinity in Hunshandake desert in Inner Mongolia，and their total DNA were extracted.Their bchY libraries were constructed by PCR amp lification method using bchY as standard marker for the detection of APB，the amplification products were sequenced and the phylogenetic analysis has been carried out.The results showed that Dagenao Lake and Zagesitai Lake were Eutrophical haloalkaline lakes and the salinity of two lakes was obviously different.Analysis of the amino acid sequences encoded by bchY nucleotide sequences in two libraries discovered that the coverages of two lakes were over 93%and strongly representative.108 amino acid sequences encoded by bchY were obtained from the two libraries totally and these sequences were divided into 17 operational taxonom ic units（OTUs）with the cutoff value of 0.03and analyzed the similarity and phylotype composition under the genus（0.12）and species（0.03）lever.The diversity index and evenness index of two lakeswere too approaching，therefore the diversity and evenness of species in two lakes were very similar，while their Chao1 values were law，indicated that the diversities of APB in two lakes were relatively low and the species were not too abundant.The Margalef index of Dagenao Lake was more higher，which indicated that the number of species in Dagenao Lake wasmore than Zagesitai Lake.In both libraries all of APB belonged to A lphaproteo bacteria class，and the predom inant OTUs was Roseibacterium elongatum，diversity of APB in two lakes were similar and lower.Analysis of the similarity and phylotype composition revealed that themain type of APB was AAPB-like group，and the diversity of APB was lower.This study provided theoretical foundation and basis for understanding APB and their ecological role and function.

Haloalkaline lake；Anoxygenic phototrophic bacteria（APB）；bchY gene；Cutoff value；OTUs；Analysis of phylotype composition；Diversity；Gene library

Q938.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0147-08

10.7668/hbnxb.2016.03.022

2016-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30760004）

寶力德（1961-），男，內(nèi)蒙古西烏珠穆沁人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

馮福應(yīng)（1973-），男，內(nèi)蒙古包頭人，教授，博士，主要從事微生物資源與應(yīng)用研究。