蓖麻標(biāo)雌/單雌/兩性系花序MSAP反應(yīng)體系的建立

趙 永，朱國(guó)立，何智彪，包春光，4，陳曉鳳，姜桐桐，李佳會(huì)，黃鳳蘭，3，5，周婷婷，常旭豐，劉佳琪

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古通遼 028000；

3.內(nèi)蒙古高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；4.通遼市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；5.內(nèi)蒙古蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古通遼 028000）

蓖麻標(biāo)雌/單雌/兩性系花序MSAP反應(yīng)體系的建立

趙 永1，朱國(guó)立2，3，5，何智彪2，包春光1，4，陳曉鳳1，姜桐桐1，李佳會(huì)1，黃鳳蘭1，3，5，周婷婷1，常旭豐1，劉佳琪1

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古通遼 028000；

3.內(nèi)蒙古高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；4.通遼市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古通遼 028000；5.內(nèi)蒙古蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古通遼 028000）

為了建立Lm型雌性系蓖麻不同發(fā)育時(shí)期的標(biāo)雌/單雌/兩性系花序MSAP反應(yīng)體系，提取不同類型不同發(fā)育時(shí)期的花序基因組DNA，混合成基因池；用Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的組合，12 h可將DNA酶切完全；16℃條件下，將酶切產(chǎn)物與Eco RⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接頭過(guò)夜連接；連接產(chǎn)物用于預(yù)擴(kuò)增。優(yōu)化后的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、ddH2O 12.75μL。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后用于選擇性擴(kuò)增。優(yōu)化后的選擇性擴(kuò)增體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。

蓖麻；花序；MSAP

蓖麻（Ricinus communis L.）是重要的工業(yè)油料作物之一［1-2］。蓖麻油是唯一可以替代石油在生產(chǎn)生活中廣泛應(yīng)用的植物油［3-6］。中國(guó)是蓖麻第二大生產(chǎn)國(guó)?，F(xiàn)階段中國(guó)蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨一個(gè)極其突出的矛盾，即種子供不應(yīng)求但收購(gòu)價(jià)格偏低。提高蓖麻單產(chǎn)水平，是解決這一矛盾的有效措施之一。因此，高產(chǎn)仍然是蓖麻育種的首要目標(biāo)。但是，蓖麻育種還未實(shí)現(xiàn)三系配套［7］，主要育種方法有“擬三系配套”和 “一系兩用”“兩系法”，后者使我國(guó)蓖麻雜優(yōu)利用的大面積制種技術(shù)問題基本得到解決，目前通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院主要采用這種育種方法，Lm型雌性系是該方法育種的基礎(chǔ)材料。Lm型雌性系蓖麻同時(shí)包含標(biāo)雌、單雌和兩性系3種花序類型。國(guó)內(nèi)雖有對(duì)蓖麻花序特征及花芽分化的研究，但是對(duì)標(biāo)雌、單雌和兩性系花序發(fā)育的基因水平差異研究尚未見報(bào)道。

DNA甲基化可以稱作是細(xì)胞記憶的一種機(jī)制，5′胞嘧啶甲基化是真核生物DNA甲基化的主要形式［8］，這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，由于甲基化的DNA不容易被轉(zhuǎn)錄，因此DNA甲基化被認(rèn)為在發(fā)育的時(shí)序上限制獲得可轉(zhuǎn)錄基因［9］。甲基化能引起生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)［10-13］。DNA甲基化參與抗逆基因表達(dá)調(diào)控［14］。其中，MSAP（DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性）由于其簡(jiǎn)便性與通用性成為DNA甲基化水平較為常用的檢測(cè)方法［15］。由于DNA甲基化是基因組DNA在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控的一種自然修飾方式，在高等植物中廣泛存在，所以MSAP技術(shù)被逐漸應(yīng)用于植物的DNA甲基化檢測(cè)［16-17］。

因此，本試驗(yàn)的目的是以Lm型雌性系蓖麻在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（4片真葉期）、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變期（5片真葉期）、主莖穗開花期、二級(jí)分枝開花期的標(biāo)雌、單雌、兩性系花序?yàn)檠芯繉?duì)象［18］，建立其MSAP反應(yīng)體系，為確定不同類型不同發(fā)育時(shí)期的花序差異表達(dá)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：Lm型雌性系蓖麻aLmAB2在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（4片真葉期）、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變期（5片真葉期）、主莖穗開花期、二級(jí)分枝開花期的標(biāo)雌、單雌、兩性系花序，共12個(gè)樣品，由通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蓖麻研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取及測(cè)定 提取12個(gè)花序樣品的基因組DNA。提取過(guò)程參照莊盟生物植物基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明，并用核酸分析儀分別測(cè)定260，280 nm時(shí)的吸光度。

1.2.2 DNA的雙酶切及與接頭連接 將12個(gè)樣品的基因組DNA按等濃度混合成基因池。以低頻限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和一組同裂酶HpaⅡ/MspⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：DNA 10μL，Cut SmartTMBuffer 3μL，10×Eco RⅠBuffer 3μL，Eco RⅠ1μL，HpaⅡ/MspⅠ1μL，ddH2O 12μL。將酶切混合物置于37℃水浴鍋中12 h，酶切結(jié)束后65℃5 min滅活。瓊脂糖電泳檢測(cè)后，-40℃冰箱中凍存。

將酶切產(chǎn)物稀釋2倍后與Eco RⅠ接頭和HpaⅡ/ MspⅠ接頭進(jìn)行連接。將連接體系混合后16℃連接12 h。連接體系如下：DNA酶切產(chǎn)物30μL，Eco RⅠ接頭1μL，HpaⅡ/MspⅠ接頭1μL，10×T4Ligase Buffer 1μL，T4Ligase 1μL，ddH2O 30μL。

1.2.3 預(yù)擴(kuò)增 25μL反應(yīng)體系中分別加入10× PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、模板、引物（10 pmol/μL）、Taq（5 U/m L），連接產(chǎn)物作為反應(yīng)體系模板稀釋5，10，15，20，25倍后進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增引物E0：5′-GACTGCG TACCAATTC-3′；H/M0：5′-ATCATGAGTCCTGCTCG G-3。反應(yīng)體系的設(shè)置見表1。反應(yīng)程序：94℃4 m in；94℃30 s，56℃1 m in，72℃1 m in，30個(gè)循環(huán)；72℃6 m in；16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.4 選擇性擴(kuò)增 選擇性擴(kuò)增引物序列見表2。25μL反應(yīng)體系中分別加入10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、模板、引物（10 pmol/μL）、Taq（5 U/m L），預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的模板稀釋3，5，10，20倍后作為選擴(kuò)的模板。選擇性擴(kuò)增的反應(yīng)體系見表3，反應(yīng)條件為94℃150 s；94℃1 min，65℃45 s，72℃1 min，共13個(gè)循環(huán)；退火溫度每個(gè)循環(huán)下降0.7℃；94℃1 min，56℃45 s，72℃1 min，共23個(gè)循環(huán)；72℃6 m in；16℃保存。經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物，100 V預(yù)電泳30 min，再700 V電泳4 h電泳后銀染觀察。

表1 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系各組分的加入量Tab.1 Pre-am p lification system added am ount of each com ponent μL

表2 選擇性擴(kuò)增引物Tab.2 Selective am p lification p rim er

表3 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系各組分的加入量Tab.3 Selectiveamplificationsystemaddedamountofeachcomponent μL

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

12個(gè)樣品的基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。取出1μLDNA樣品稀釋100倍后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260、OD280值，并計(jì)算OD260/280比值。12個(gè)樣品的OD260/280比值均為1.6～ 1.8，說(shuō)明蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)污染較小，且提取的DNA亮度大完整性好，符合PCR的要求。

圖1 基因組DNA提取結(jié)果Fig.1 GenomicDNAextractionresults

2.2 DNA雙酶切及連接結(jié)果

DNA的雙酶切及與接頭連接結(jié)果見圖2。通過(guò)圖2得知100～1000bp呈涂抹帶，說(shuō)明DNA被完全切開，符合MSAP的技術(shù)要求。

圖2 DNA雙酶切及連接結(jié)果Fig.2 DNAdoubledigestionandjoinresult

2.3 預(yù)擴(kuò)增結(jié)果

連接產(chǎn)物稀釋不同倍數(shù)后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增的結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，連接產(chǎn)物稀釋10倍后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶亮度大，且條帶為100～1500bp，能夠滿足MSAP的技術(shù)要求。連接產(chǎn)物稀釋10倍后，對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、ddH2O 12.75μL。

圖3 DNA預(yù)擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 DNA p re-am p lification resu lts

圖4 預(yù)擴(kuò)增體系優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Pre-am p lification system optim ization resu lts

2.4 選擇性擴(kuò)增結(jié)果

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋不同倍數(shù)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后條帶亮度大，能夠滿足MSAP的技術(shù)要求。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后，對(duì)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果見圖6，結(jié)果表明，最佳反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。12個(gè)樣品的選擴(kuò)結(jié)果見圖7，結(jié)果表明條帶明亮且清晰，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

圖5 選擇性擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Selective am p lification result

圖6 選擇性擴(kuò)增體系優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optim ization result of selective am p lification

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

蓖麻是一種重要的油料作物，花序是與其產(chǎn)量直接相關(guān)的性狀。本試驗(yàn)以Lm型雌性系蓖麻aLmAB2在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（4片真葉期）、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變期（5片真葉期）、主莖穗開花期、二級(jí)分枝開花期的標(biāo)雌、單雌、兩性系花序，共12個(gè)樣品建立其MSAP反應(yīng)體系。提取不同類型不同發(fā)育時(shí)期的花序基因組DNA，混合成基因池；用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的組合，12 h可將DNA酶切完全；16℃條件下，將酶切產(chǎn)物與EcoRⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接頭過(guò)夜連接；連接產(chǎn)物用于預(yù)擴(kuò)增。優(yōu)化后的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25 μL、ddH2O 12.75μL。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后用于選擇性擴(kuò)增。優(yōu)化后的選擇性擴(kuò)增體系為10× PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX擴(kuò)增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。為確定不同類型不同發(fā)育時(shí)期的花序差異表達(dá)基因研究奠定基礎(chǔ)。

圖7 12個(gè)樣品選擇性擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 12 sam p les op tim ization resu lt of selective am p lification

3.2 討論

3.2.1 酶切對(duì)擴(kuò)增效果的影響 本試驗(yàn)的雙酶切組合是Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ，對(duì)DNA的酶切時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終確定12 h酶切完全，能夠最大限度地使整個(gè)基因池里的DNA得到充分的酶切，并且酶切片段為100～1 000 bp呈彌散狀態(tài)，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。在試驗(yàn)過(guò)程中酶切不充分，PCR過(guò)程中就會(huì)丟失遺傳信息，不利于分析差異表達(dá)基因。3.2.2 PCR反應(yīng)體系對(duì)擴(kuò)增效果的影響 PCR預(yù)擴(kuò)增的結(jié)果直接影響選擇性擴(kuò)增的結(jié)果，因此，預(yù)擴(kuò)增在本試驗(yàn)中至關(guān)重要［19］。連接產(chǎn)物作為預(yù)擴(kuò)增的模板，濃度過(guò)高會(huì)增加非特異性條帶的數(shù)目，濃度過(guò)低會(huì)影響預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，當(dāng)連接產(chǎn)物稀釋10倍時(shí)，條帶分布在100～1 000 bp能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。成功建立蓖麻預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系。PCR的選擇性擴(kuò)增影響對(duì)差異條帶的獲得。Mg2+濃度的增加會(huì)增加Taq酶的活性從而增加特異性條帶，但當(dāng)Mg2+濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性，從而使特異性條帶的數(shù)量降低［20］。反應(yīng)體系中加入的Mg2+（25 mmol/L）是4.0μL時(shí)，酶的活性達(dá)到最高。

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Estab lish Castor M arked Fem ale Lm Per Fem ale Am photeric Linein flores Cence M SAP Reaction System

ZHAO Yong1，ZHU Guoli2，3，5，HE Zhibiao2，BAO Chunguang1，4，CHEN Xiaofeng1，
JIANG Tongtong1，LI Jiahui1，HUANG Fenglan1，3，5，ZHOU Tingting1，CHANG Xufeng1，LIU Jiaqi1
（1.College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China；2.Tongliao Academy of Agricultural Science，Tongliao 028000，China；3.Inner Mongolia Region Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor，Tongliao 028000，China；4.Tongliao Quality and Safety of Agricultural and Livestock Center，Tongliao 028000，China；5.Inner Mongolia Autonomous Key Laboratory of Castorbreeding，Tongliao 028000，China）

The purpose of this experiment was to establish Lm-type female system castor different developmental stagesmarked female，per female，amphoteric system inforescence establish MSAP reaction system.MSAP reaction system established to determine differences in inflorescence type genes at different developmental stages of research to lay the foundation.The results were as follows：extraction of different types at different developmental stages of inflorescence genom ic DNA m ixed into the gene pool.Eco RⅠand HpaⅡ/MspⅠdigested gene pool 12 h. The digestion products and Eco RⅠ，HpaⅡ/MspⅠadapter overnight connection for pre-amplification.The opti-mized system for the pre-amplification reaction 10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.5μL，Mg2+（25 mmol/L）2.0μL，template 2.0μL，E0amplification primer（10 pmol/μL）1.5μL，H0amplification primer（10 pmol/μL）1.5μL，LA Taq（5 U/μL）0.25μL，ddH2O 12.75μL.Pre-amplification products were diluted 10-fold for the selective amp lification.Selective amp lification system optim ized for 10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0μL，Mg2+（25 mmol/L）4.0μL，template 3.0μL，EXamplification primer（10 pmol/μL）1.0μL，H/Mxamplification primer（10 pmol/μL）1.0μL，LA Taq（5 U/μL）0.30μL，ddH2O 11.2μL.

Castor；Inflorescence；MSAP

S563.03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0114-07

10.7668/hbnxb.2016.03.017

2016-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30760123；31160290；31460353）；國(guó)家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(xiàng)（201003057）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉胖С钟?jì)劃”（NJYT-14-A10）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)項(xiàng)目；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”計(jì)劃項(xiàng)目；市校合作項(xiàng)目（SXZD2012018；SXZD2012017；SXZD2012006）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目（BMYJ2011009）

趙 永（1990-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，在讀碩士，主要從事蓖麻分子育種研究。

黃鳳蘭（1973-），女，山東菏澤人，教授，博士，主要從事蓖麻分子育種研究。