小麥谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及原核表達(dá)

張 蕾，于永昂，2，楊天佑

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

小麥谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及原核表達(dá)

張 蕾1，于永昂1，2，楊天佑1

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

為了進(jìn)一步研究小麥谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因（TaGST）的功能，采用RT-PCR方法分離了小麥谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因（TaGST）的ORF全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：小麥TaGST基因的ORF全長(zhǎng)690 bp，編碼229個(gè)氨基酸；TaGST蛋白分子質(zhì)量為25.81 kDa，p I為5.29。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因編碼蛋白與水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高，與已知植物GST家族成員的氨基酸序列聚類分析將TaGST聚為Phi類GST。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32-TaGST，對(duì)TaGST基因進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果表明，其所表達(dá)蛋白與預(yù)期蛋白大小一致。為進(jìn)一步研究該基因的特性和功能奠定了理論基礎(chǔ)。

小麥；谷胱甘肽過(guò)S-轉(zhuǎn)移酶；基因克??；原核表達(dá)

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase，GSTs）是普遍存在于動(dòng)植物中的一種多基因編碼的多功能蛋白酶，在清除生物和非生物脅迫產(chǎn)生的氧化損傷中起著重要的作用［1-2］，其一般是由同源或異源二聚體蛋白組成的2個(gè)亞基來(lái)催化還原型谷胱甘肽與親電的化合物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，降低其親電活性，最終達(dá)到脫毒作用［3-4］。目前，已經(jīng)在擬南芥、水稻、楊樹(shù)、玉米和大豆等植物中發(fā)現(xiàn)了多種GST蛋白，其中在擬南芥、水稻和楊樹(shù)中就分別發(fā)現(xiàn)了53，59，81個(gè)GST蛋白［5-7］。根據(jù)蛋白的相似性，將GST主要分為7類：Phi（F）、Tau（U）、Theta（T）、Zeta（Z）、Lambda（L）、DHAR（Dehydroascorbate reductase）和TCHQD（Tetrachlorohydroquinone dehalopgenase），其中，Phi、Tau、Lambda和DHAR類是植物所特有的［8-10］。

GSTs在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量有差異，并且其表達(dá)能夠受多種環(huán)境因子的誘導(dǎo)，如低

溫［11］、脫水［12］、傷害［13］和病原菌的侵染［14］等，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝和脅迫耐受中起著重要作用。許多研究表明，GST在植物抗性中起著重要的作用［15-18］。煙草中過(guò)量表達(dá)煙草GST基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽和抗低溫能力［15］，而將棉花GST基因轉(zhuǎn)入煙草增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫能力［16］。在水稻中過(guò)量表達(dá)鹽地堿蓬GST基因可以提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗低溫能力［17］，而在擬南芥中過(guò)量表達(dá)鹽地堿蓬GST基因可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱能力［18］。小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，但由于干旱、低溫和鹽堿等非生物脅迫嚴(yán)重影響了小麥產(chǎn)量?？寺⌒←溈鼓婊騎aGST對(duì)于進(jìn)一步利用該基因提高小麥抗逆性具有重要意義。為此，從小麥葉片中克隆了TaGST基因全長(zhǎng)序列，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。同時(shí)，構(gòu)建了pET32-TaGST原核表達(dá)載體，在宿主菌E.coli BL21（DE3）中成功進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，為小麥TaGST蛋白的進(jìn)一步分離純化以及結(jié)構(gòu)和功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為新麥26，將小麥種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，三葉期時(shí)，取新鮮幼嫩葉片用液氮速凍待用；原核表達(dá)載體pET-32a購(gòu)自德國(guó)Novagen公司；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞為河南科技學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Hin dⅢ、T4DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TaGST基因的克隆 采用TRIzol-A+（Tiangen，北京）試劑提取樣品總RNA，按說(shuō)明書(shū)使用Prim Script RT Reagent Kit（TaTaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)小麥TaGST（GenBank登錄號(hào)：X56012）基因序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物GST-F1：5′-ATGTCTCCGGTGAAGGTG-3′，GST-R1：5′-CTAGTACTGCGCACCTAG-3′。以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，回收與目標(biāo)片段大小一致的條帶，將其連接到pGM-T載體（Tiangen，北京），轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色菌斑搖菌，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，將鑒定正確的陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 小麥TaGST序列的生物信息學(xué)分析 通過(guò)Protparam分析其編碼蛋白的理化性質(zhì)；將TaGST基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov）上用BLASTX進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)；用DNAMAN 6.0進(jìn)行多重序列比對(duì)；用TMHMM預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；用SingnalP4.1軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 TaGST基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)原核表達(dá)載體pET-32a和TaGST基因序列設(shè)計(jì)帶有Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切位點(diǎn)的特異性引物用于TaGST基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建，引物序列如下：GST-F2：5′-CGGGATCCATGTCTCCGGTGAAGGTG-3′（下劃線為Bam HⅠ酶切位點(diǎn)），GST-R2：5′-CCCAAGCTTGTACTGCGCACCTAGCTT-3′（下劃線為Hin dⅢ酶切位點(diǎn)）。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接到pGM-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序鑒定，以獲得重組質(zhì)粒pGM-TaGST。將測(cè)序鑒定正確的pGM-TaGST質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET-32a分別用Bam HⅠ和Hin dⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接后熱擊轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB（Amp+）固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，以獲得原核表達(dá)載體pET32-TaGST。

1.2.4 TaGST基因的原核表達(dá) 將原核表達(dá)載體pET32-TaGST轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至10 m L LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)12 h。然后按照1∶100（V/V）轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 h至OD600達(dá)到0.6～0.8，取1 mL重組質(zhì)粒菌液加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)1，2，3，4 h。誘導(dǎo)表達(dá)完成后，取1 m L菌液，12 000 r/min離心10 min收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色至條帶清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaGPX基因的克隆

根據(jù)NCBI中小麥GST基因的序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到1條大約700 bp的條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果顯示該序列長(zhǎng)690 bp，與預(yù)期片段大小一致，編碼229個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG（圖2）。

2.2 小麥TaGST序列的生物信息學(xué)分析

利用Protparam分析TaGST的理化性質(zhì)，推測(cè)TaGST蛋白的分子式為C1188H1816N296O326S11，分子質(zhì)量為25.81 kDa，理論等電點(diǎn)（p I）為5.29。TaGST蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為46.10（高于域值40），屬于不穩(wěn)定蛋白?？偟膸ж?fù)電荷的殘基（Asp+Glu）為28，總的帶正電荷的殘基（Arg+Lys）為21。TMHMM和SignalP 4.1在線分析結(jié)果表明，該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。TaGST蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其保守結(jié)構(gòu)域分為N端（位于3-78氨基酸殘基）和C端（位于95-216氨基酸殘基）兩部分（圖3）。

圖1 TaGST基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR am p lification of TaGST gene

圖3 TaGST保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved dom ain analysis of TaGST

利用DNAMAN 6.0軟件，將克隆的TaGST基因編碼的氨基酸序列與GenBank中其他植物的GST氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白與已知的水稻（BAB39939）、大麥（AAL733940）、玉米（AAA33469）、擬南芥（CAB83126）的Phi類GST具有較高的同源性，氨基酸相似性分別達(dá)到61.57%，61.14%，49.78%，43.67%（圖4）。進(jìn)一步利用Mega 5.0軟件對(duì)小麥TaGST蛋白與水稻、擬南芥的Phi、Theta、Zeta、Lambda、Tau類GST蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，本研究所克隆的TaGST基因編碼的蛋白和水稻、擬南芥的Phi類GST的親緣 關(guān)系最近（圖5）。

圖4 TaGST基因編碼的氨基酸序列與其他作物GST氨基酸序列的比對(duì)Fig.4 M u ltip le alignm ent of the deduced am ino acid sequences of TaGST and GST p roteins from other p lants

圖5 五類GSTs進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 A phy logenetic tree constructed based on the am ino acid sequences of five classes of GSTs

2.3 TaGST基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

通過(guò)Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pGMTaGST和pET-32a空載體，回收目的基因片段和線性載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET32-TaGST，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，TaGST基因成功連接到pET-32a載體上（圖6）。重組質(zhì)粒再次測(cè)序，結(jié)果表明，插入片段與克隆序列完全一致。由此表明pET32a-TaGST原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖6 小麥TaGST基因重組質(zhì)粒pET32a-TaGST的雙酶切鑒定Fig.6 Identification of the recom binan t vector pET32a-TaGST by Bam HⅠand H in dⅢdouble digestion

2.4 TaGST基因重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

由圖7可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32a-TaGST重組質(zhì)粒在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)，分子質(zhì)量約45 kDa，與預(yù)期的目標(biāo)融合蛋白大小一致，目的蛋白約25.81 kDa，標(biāo)簽蛋白20.4 kDa，且隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的增加融合蛋白表達(dá)量增多。

3 結(jié)論與討論

植物在不利的非生物逆境脅迫條件下如高溫、低溫、干旱、鹽漬等，會(huì)造成細(xì)胞代謝過(guò)程異常，積累大量的活性氧（ROS），影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育。在正常情況下，植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，而當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，大量積累的ROS能夠?qū)χ参矬w內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸等生物大分子產(chǎn)生傷害［19-21］。GST利用還原型谷胱甘肽的還原作用來(lái)清除逆境脅迫下細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS，同時(shí)也能夠?qū)κ艿窖趸瘬p傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，從而維持植物體內(nèi)的正常代謝過(guò)程。在瞿麥（Dianthus superbus L.）中過(guò)量表達(dá)煙草GST基因能夠增加轉(zhuǎn)基因瞿麥在干旱和不同光照條件下的光合作用［22］。火把梨的GST基因能夠參與維持火把梨果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的氧化還原平衡和應(yīng)答逆境脅迫［23］。在模擬酸雨脅迫下，青花菜GST基因的表達(dá)量在脅迫初期顯著增加，隨著時(shí)間延長(zhǎng)開(kāi)始下降，表明GST基因參與了青花菜抗酸雨的應(yīng)答反應(yīng)［24］。這一系列研究表明，植物GSTs對(duì)抵抗逆境脅迫具有重要作用。

圖7 pET32a-TaGST融合蛋白的表達(dá)分析Fig.7 Analysis of pET32a-TaGST p rotein exp ression in by SDS-PAGE

本試驗(yàn)根據(jù)NCBI中小麥TaGST基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR方法從小麥葉片中成功克隆得到具有完整ORF的TaGST基因序列；生物信息學(xué)分析表明，該基因所推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的水稻、大麥、玉米和擬南芥的GST蛋白序列具有較高的相似性；保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，所克隆的TaGST蛋白序列含有GST_N和GST_C，屬于Phi類，同時(shí)聚類分析也將本試驗(yàn)中的TaGST歸于Phi類GST。

原核表達(dá)技術(shù)常用于一些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究。目前，在原核表達(dá)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)宿主菌是大腸桿菌，其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便以及對(duì)外源目的蛋白表達(dá)量高等多種優(yōu)點(diǎn)［25-26］。本試驗(yàn)采用目前應(yīng)用最廣泛的pET系列原核表達(dá)載體進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)分析，成功構(gòu)建了TaGST基因的原核表達(dá)載體pET32a-TaGST，并進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，成功誘導(dǎo)出1條分子質(zhì)量約為45 kDa的蛋白條帶，與預(yù)測(cè)分子質(zhì)量大小一致，為進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)以及進(jìn)行生物學(xué)功能分析提供了基礎(chǔ)資料。

綜上所述，本試驗(yàn)從小麥葉片中成功地克隆了TaGST基因，利用原核表達(dá)技術(shù)成功誘導(dǎo)表達(dá)TaGST蛋白，為進(jìn)一步研究TaGST蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化提高植物的抗逆性提供試驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of TaGST from Triticum aestivum L.

ZHANG Lei1，YU Yongang1，2，YANG Tianyou1
（1.School of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding of Henan Province，Xinxiang 453003，China；2.College of Agronomy，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）

To investigate the function of TaGST gene，RT-PCR was used to obtain TaGST gene open reading frame sequence from wheat and analyzed by bioinformatics method.The sequence analysis results showed that the ORF of TaGST gene had a length of 690 bp coding for 229 amino acid，and the relative molecular weight of TaGST protein was 25.81 kDa and its theoretical isoelectric pointwas 5.29.Homology analysis showed that the amino acid sequence of TaGST was highly homologous with Oryza sativa，and phylogenetic analysis of the relationship of the newly identified TaGST with some known plant GSTs grouped the TaGST into the class of PhiGSTs.The prokaryotic expression of TaGST gene was done after construction of its prokaryotic expression vector pET32-TaGST，and the SDS-PAGE results displayed that the expressed protein was consistentwith the anticipated size.The resultswere expected to lay a foundation for further studies on the properities and function of this gene.

Wheat；Glutathione-S-transferase；Gene clone；Porkaryotic expression

Q78；S512.03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0038-06

10.7668/hbnxb.2016.03.006

2015-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1305047）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（12A180011）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目（2014GGJS-100）

張 蕾（1987-），女，河南新鄉(xiāng)人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。