廣西金秀野生茶遺傳多樣性及分子指紋圖譜研究

陳瑩玉，袁思思，吳春蘭，賴幸菲，趙文芳，朱 燕，楊家干，黃亞輝，2

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廣西金秀野生茶遺傳多樣性及分子指紋圖譜研究

陳瑩玉1，袁思思1，吳春蘭1，賴幸菲1，趙文芳1，朱 燕1，楊家干1，黃亞輝1，2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州510642；2.華南園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用廣東省普通高校重點實驗室，廣東 廣州510642）

摘 要：為了解廣西金秀縣野生茶資源的遺傳進化軌跡以及品種特性，采用RAPD分子標記分析了該縣4 地8個野生茶品種與云南、廣東、湖南和福建等周邊省份的15個茶樹品種的親緣關(guān)系，在相似系數(shù)0.76處可將23份材料分成四大類群。采用SSR分子標記，選取條帶易于辨認、穩(wěn)定性好、多態(tài)性較高的5對引物組合（順序依次為SSR1110、SSR685、SSR478、SSR496、SSR228）構(gòu)建了廣西金秀縣4地22份野生茶資源的分子指紋圖譜，從而可簡單有效地判別具體品種（系）。

關(guān)鍵詞：野生茶；RAPD；SSR；親緣關(guān)系；指紋圖譜

野生茶樹是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）茶組（Sect.Thea）植物野生種類的統(tǒng)稱［1-3］。我國野生茶樹種類繁多，類型豐富，分布廣泛［4］。據(jù)統(tǒng)計，廣西野生茶資源覆蓋面積約200 hm2［5］，主要分布在具有良好自然生態(tài)條件的山區(qū)，年產(chǎn)量約50 t。金秀瑤族自治縣位于廣西壯族自治區(qū)中部偏東的大瑤山主體山脈上，根據(jù)黃亞輝等［6-7］近年實地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，金秀縣境內(nèi)蘊藏著豐富的野生茶樹資源，且轄區(qū)野生茶樹資源為茶組茶種C. Sinensis （L.） O. Kuntze［8］。

我國野生茶樹資源表型豐富，具有顯著的基因遺傳多樣性［9］。目前，茶樹種質(zhì)資源遺傳育種工作已取得了系列重要成果，其中DNA分子標記技術(shù)穩(wěn)定性良好、可識別性高、迅速簡便，明顯優(yōu)于其他傳統(tǒng)形態(tài)標記技術(shù)，適用于品種鑒定［10-11］，已廣泛應用于茶樹育種工作中，使茶樹種質(zhì)資源得到了科學有效的評價和創(chuàng)新利用。RAPD、SCAR和ISSR等分子標記是茶樹DNA基因水平遺傳多樣性研究的有效手段。Liu等［12］采用 ISSR分子標記技術(shù)對8個種群134份云南茶樹資源進行親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)種群間遺傳差異小。Fang等［13］利用ISSR 分子標記技術(shù)研究了185棵無性系茶樹單株的基因多樣性和親緣關(guān)系，并通過聚類分析將其分為三大類。陳亮等［14］利用RAPD標記技術(shù)對15份茶樹資源進行遺傳多樣性研究，從分子DNA水平證明了我國是茶樹的原產(chǎn)地和發(fā)源地。Yang等［15］利用AFLP快速分離得到來自大理茶的15個微衛(wèi)星標記，并對其進行鑒定。

本研究采用RAPD分子標記構(gòu)建了廣西金秀4地8個野生茶品種與其周邊省份（包括云南、廣東、湖南和福建）的15個茶樹品種的親緣關(guān)系圖譜，并通過遺傳距離以及形態(tài)特征綜合分析了金秀野生茶資源的遺傳多樣性特征和原始特性，運用SSR分子標記技術(shù)構(gòu)建22個品種（系）的分子指紋圖譜，有利于這些茶樹資源的登記保護、品種資源的創(chuàng)新利用，為野生茶資源的科學開發(fā)提供重要理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

RAPD試驗材料取自廣西金秀野生茶資源各單株以及華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院茶樹資源圃茶樹品種的新梢芽葉，共23份研究材料。其中，華南農(nóng)業(yè)大學茶樹資源圃茶樹品種包括廣東、福建、云南、湖南4個省份的代表性茶樹品種各3～4個；廣西金秀野生茶資源品種為隨機選取的金秀白牛、六巷、共和、東溫等地野生茶樹資源品種各2個。SSR分子標記構(gòu)建遺傳圖譜的材料取自廣西金秀4地的22個單株。采摘各品種新梢芽葉，置于-80℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及質(zhì)量檢測 參考陳亮等［16］的方法，并加以改進。

1.2.2 ISSR引物篩選及合成 從100條RAPD引物中優(yōu)化篩選獲取 17個對 5種茶樹單株均可擴增出譜帶且重復性好的引物。 具體ISSR引物序列參考文獻［17-20］，由鼎國生物有限公司（廣州）合成。

1.2.3 PCR擴增及結(jié)果檢測 PCR擴增參照文獻［21］的擴增程序和反應體系，通過凝膠電泳檢測擴增效果，染色參照Charters等［22］的方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用人工讀帶的方法，對無帶或難分辨的記作“0”，清晰且可重現(xiàn)性好的條帶記作“1”，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)庫。計算多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC），公式如下：

PIC=1-ΣPi2［23］

式中，Pi代表第i條多態(tài)性條帶和第i個等位位點的出現(xiàn)頻率。當PIC＞0.5時，表明擴增位點具有高度多態(tài)性；當PIC在0.25～0.5時，為中度多態(tài)性；PIC＜0.25時，為低度多態(tài)性。

根據(jù)Jacard系數(shù)計算種質(zhì)資源間相似系數(shù)，使用SAHN鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）對供試材料采用非加權(quán)平均法（UPGMA unweighted pair group method using arithmetic averages） 進行遺傳相似性聚類，并繪制樹狀聚類圖［23］。在Excel軟件下比對指紋圖譜代碼，以最少的引物組合構(gòu)建分子指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD標記技術(shù)研究廣西金秀野生茶的親緣關(guān)系

2.1.1 RAPD擴增產(chǎn)物及多態(tài)性分析 根據(jù)常用于茶樹的100條RAPD引物，選出多態(tài)性好、條帶清晰、重現(xiàn)性好的引物共17條，對供試的23份研究材料進行PCR擴增。結(jié)果（表1）表明，利用17條引物共擴增出172條條帶，其中多態(tài)性條帶136條，多態(tài)性達77.85%。每條引物擴增的帶數(shù)在6～15條。其中，引物C11多態(tài)性最高、為93.33%，引物D13多態(tài)性最低、僅為62.50%。引物的多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.82，表現(xiàn)出擴增位點的高度多態(tài)性。

2.1.2 品種遺傳相似系數(shù)及遺傳多樣性分析 由表2 可知，供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS變化范圍為0.628～0.884，平均值為0.755。其中長葉白毫與佛香三號的GS最大、達到0.884，說明它們的遺傳親緣關(guān)系最近。相對而言，東溫三號與黃金桂和政和大白的GS值最小，分別為0.63、0.63，說明它們存在較大的遺傳距離。此外，東溫三號與金秀其他地區(qū)的品種遺傳距離均較遠，GS介于0.64～0.70之間。六巷地區(qū)的茶樹品種與金秀其他地區(qū)的遺傳距離較遠、GS介于0.66～0.76之間，而六巷二號和六巷九號之間的遺傳距離也較遠、GS為0.78，但六巷與共和、白牛的遺傳距離相對東溫較近?？梢姡瑥V西金秀野生茶表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

表1 RAPD引物擴增產(chǎn)物多態(tài)性信息

表2 品種相似系數(shù)

2.1.3不同地域茶樹品種間的親緣關(guān)系 根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA法對23個供試品種（系）進行聚類分析，構(gòu)建了不同品種（系）間的聚類圖（圖1）。在相似系數(shù)為0.76處可以把23份材料分為4大類群：東溫三號首先單獨成為一個類群，六巷二號和六巷九號聚為一個類群；白牛、共和品種和東溫二號聚為一個類群；云南、廣東、福建、湖南的品種聚為一個類群。聚類分析結(jié)果表明，來源于同一地區(qū)的茶樹品種往往形成單獨的聚類群，遺傳背景相似的品種也往往表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，廣西金秀縣的茶樹品種表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性和地域獨特性。

圖1 茶樹品種親緣關(guān)系聚類結(jié)果

2.2 SSR標記技術(shù)構(gòu)建廣西金秀野生茶的指紋圖譜

2.2.1 SSR引物的篩選 對合成的15對SSR引物進行系統(tǒng)優(yōu)化篩選，共獲得9對具有清晰條帶且多態(tài)性較好的引物（表3），將其作為備用引物用以構(gòu)建分子指紋圖譜。9對引物一共檢測到36個等位位點，其中存在33個多態(tài)性位點。通過檢測可知，平均每對引物的等位位點數(shù)為4個（多態(tài)性位點數(shù)3.67個），多態(tài)性位點最多有7個、最少只有1個。在所有PIC數(shù)值中，最小的是SSR1110、為0.35，最大的是SSR18、高達0.85，平均值為0.58，其中有8個不小于0.50。結(jié)果表明上述引物整體具有較高多態(tài)性。

2.2.2 茶樹SSR帶型識別及賦值 為了強化分子指紋圖譜的準確性和一致性，簡化茶樹SSR帶型的識別方法，縮短各品種（系）分子指紋圖譜字符串長度，根據(jù)野生茶樹SSR標記帶型的具體特點，將每對SSR引物中位點的“0”、“1”編號轉(zhuǎn)換為基因型代碼，其轉(zhuǎn)換規(guī)則為：從第1個品種（系）開始，第1個品種（系）基因型記為1，如果第2個與第1個帶型相同記為1，有差異則記為2，依次類推。圖2中的22個品種（系）的基因型編碼依次為：1、2、1、3、1、4、1、5、4、0、4、4、4、5、6、1、7、1、8、5、4、7。

圖2 引物685在22個單株中的擴增結(jié)果

2.2.3 野生茶樹品種分子指紋圖譜建立 使用上述9對引物對茶樹單株DNA進行擴增，得到不同系列帶型編碼，以對應的引物順序作為依據(jù)，串聯(lián)各帶型編碼，即可形成一組數(shù)據(jù)代碼，以此作為該茶樹單株的分子指紋圖譜編碼。本研究通過比較選取的5對引物組合（SSR1110、SSR685、SSR478、SSR496、SSR228）構(gòu)建了22個野生茶樹單株的分子指紋圖譜，使用5位數(shù)的數(shù)字編碼代表每個茶樹單株分子指紋圖譜（表4）。例如，12號野生茶樹單株的分子指紋圖譜編碼為24613，表示在該引物組合順序下第1個引物的基因型編碼為2、第2個為4、第3個為6，將其串聯(lián)起來就可以代表該野生茶樹品種的指紋圖譜代碼。

表3 SSR引物擴增產(chǎn)物多態(tài)性信息

表4 金秀22個單株的DNA分子指紋圖譜號碼

3 結(jié)論與討論

本研究采用RAPD分子標記構(gòu)建了廣西金秀白牛、六巷、共和、東溫4地8個野生茶品種與云南、廣東、湖南和福建的15個茶樹品種的親緣關(guān)系圖譜，并通過遺傳距離和形態(tài)特征綜合分析了金秀野生茶資源的遺傳多樣性和原始特性，結(jié)果表明廣西金秀野生茶資源具有豐富的多樣性，且具有原始特性，其中六巷、東溫以及白牛野生茶資源性狀較原始，共和最為進化。

本研究通過SSR分子標記構(gòu)建了廣西金秀縣4地極具代表性的22份野生茶資源的DNA指紋圖譜，使每個單株得到唯一的指紋身份證，從而可簡單有效地判別各種單株。這將有助于茶樹資源的登記保護、品種資源的創(chuàng)新利用，為金秀野生茶資源的科學開發(fā)提供重要理論基礎(chǔ)。

根據(jù)RAPD分子標記研究結(jié)果分析，廣西金秀野生茶資源類型豐富，有地域獨特性，但無法從所研究的茶樹資源與周邊省份的茶樹品種之間的親緣關(guān)系判斷其進化軌跡和進化程度，還需進一步研究探討。在研究中還發(fā)現(xiàn)東溫地區(qū)的資源獨特性異常突出，其茶樹資源地處原始森林中，單株零散分布，其資源特性和綜合應用價值有待深入探究。

參考文獻：

［1］ 唐一春，楊盛美，季鵬章，等. 云南野生茶樹資源的多樣性、利用價值及其保護研究［J］. 西南農(nóng)業(yè)學報，2009，22（2）：518-521.

［2］ 陳亮. 茶組植物系統(tǒng)分類學研究現(xiàn)狀［J］. 茶葉，1996，22（2）：16-19.

［3］ 張宏達. 茶葉植物資源的訂正［J］. 中山大學學報（自然科學版），1984（1）：1-12.

［4］ 王平盛，虞富蓮. 中國野生大茶樹的地理分布、多樣性及其利用價值［J］. 茶葉科學，2002，22（2）：105-108.

［5］ 劉玉芳，林朝賜，秦春玲，等. 淺談廣西野生茶資源的利用與保護［J］. 廣西農(nóng)學報，2011，26（4）：100-101.

［6］ 黃亞輝，盧政通，吳春蘭，等. 金秀茶樹資源考察初報［J］. 中國茶葉，2012（12）：7-8.

［7］ 黃亞輝，盧政通. 廣西金秀野生茶樹的形態(tài)學特征研究［J］. 福建茶葉，2014（2）：14-18.

［8］ 閔天祿. 山茶屬茶組植物的訂正［J］. 云南植物研究，1992，14（2）：115-132.

［9］ 王平盛，許玫. 云南茶種質(zhì)資源主要性狀鑒定和評價利用［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學學報，1998，13（4）：387-391.

［10］ 高運來，朱榮勝，劉春燕，等. 黑龍江部分大豆品種分子ID的構(gòu)建［J］. 作物學報，2009，35（2）：211-218.

［11］ 繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波，等. 應用ISSR 對25 個小菊品種進行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（11）：3735-3740.

［12］ Liu B Y，Li Y Y. Assessment of genetic diversity and

relationship of tea germplasm in Yunnan as revealed by ISSR Markers［J］. Acta Agronomica Sinica，2010，36 （3）：391-400.

［13］ Fang W，Cheng H. Genetic diversity and relationship of clonal tea（Camellia sinensis） cultivars in China as revealed by SSR markers［J］. Plant Systematics and Evolution，2012，298（2）：469-483.

［14］ 陳亮，山口聰，王平盛，等. 利用RAPD進行茶組植物遺傳多樣性和分子系統(tǒng)學分析［J］. 茶葉科學，2002，22（1）：19-24.

［15］ Yang J B，Yang J. Isolation and characterization of 15 microsatellite markers from wild tea plant（Camellia taliensis）using FIASCO method［J］. Conservation Genetics，2009，10（5）：1621-1623.

［16］ 陳亮，虞富蓮，童啟慶. 關(guān)于茶組植物分類與演化的討論［J］. 茶葉科學，2002，20（2）：89-94.

［17］ Zhao L P，Liu Z，Chen L，et al. Generation and characterization of polymorphic expressed sequence tag-derived polymorphic microsatellites from tea plant （Camellia sinensis）and cross-species amplification in its closely related species and varieties［J］. Conservation Genetics，2008（9）：1327-1331.

［18］ Kaundun S S，Matsumoto S. Heterologous nuclear and chloroplast microsatellite amplification and variation in tea，Camellia sinensis［J］. Genome，2002，45（11）：1041-1048.

［19］ Yang J B，Yang J，Li H T，et al. Isolation and characterization of 15 microsatellite markers from wild tea plant（Camellia taliensis）using FIASCO method ［J］. Conservation Genetic，2009（9）：412-414.

［20］ 金基強，崔海瑞，龔曉春，等. 用EST-SSR標記對茶樹種質(zhì)資源的研究［J］. 遺傳，2007，29（1）：103-108.

［21］ 王會，梁月榮，陸建良. 低咖啡因茶樹品系的RAPD分析及特異片段的克?。跩］. 茶葉，2008，34（1）：29-33.

［22］ Charters Y M，Wilkinson M J. The use of selfpollinated progenies as‘in-groups’for the genetic characterization of cocoa germplasm［J］. Theoretical and Applied Genetics，2000，100：160-166.

［23］ Botstein D，White R L，Skolnick M，et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］. American Journal of Human Genetics，1980，32：314-331.

（責任編輯 崔建勛）

中圖分類號：S571.1；S502.4

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）03-0060-06

收稿日期：2015-09-11

基金項目：廣東省科技計劃項目（2013B020201 003，2015B020202007）；福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心（培育）專項（2013-51）；

作者簡介：陳瑩玉（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：609996608@qq.com

通訊作者：黃亞輝（1969-），男，博士，教授，E-mail：13501513191@163.com

Molecular fingerprint and diversity analysis of wild tea trees in Jinxiu county，Guangxi province

CHEN Ying-yu1，YUAN Si-si1，WU Chun-lan1，LAI Xin-fei1，ZHAO Wen-fang1，ZHU Yan1，YANG Jia-gan1，HUANG Ya-hui1，2
（1. College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Key Laboratory of Innovation and Utilization for Germplasm Researches in Horticultural Crops in Southern China of Guangdong Higher Education Institutes，Guangzhou 510642，China）

Abstract：In order to track the genetic evolution path and understand the characteristics of varieties of wild tea germplasms in Jinxiu county，Guangxi province，we adopted the RAPD molecular markers to analyze the genetic relationship between eight kinds of wild tea plants from four places in Jinxiu and 15 varieties of tea plants from four provinces，including Yunnan，Guangdong，Hunan and Fujian around Guangxi. The results showed that all the materials could be divided into four groups in the similarity coefficient of 0.76. We also used the SSR molecular marker to construct the genetic fingerprint of 22 varieties of wild tea germplasms in Jinxiu county of Guangxi province. In SSR molecular marker，5 primer pairs（SSR1110，SSR685，SSR478 SSR496 SSR228）bands with easily identification，good stability and high polymorphism，were choosen to construct the molecular linkage map of 22 plants. Each plant had its own unique fingerprint identification card，which could effectively distinguish one from another.

Key words：wild tea plant；RAPD；SSR；genetic relationship；molecular fingerprint