灰綠青霉阿魏酸酯酶的分離純化和酶學性質(zhì)研究

徐大偉,高兆建*,張鐵柱,楊 杰,王東星,杜永凱

(1.徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇徐州 221000；2.江蘇天種牧業(yè)股份有限公司，江蘇徐州 221100；3.徐州鴻宇農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇睢寧 221100)

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灰綠青霉阿魏酸酯酶的分離純化和酶學性質(zhì)研究

徐大偉1,高兆建1*,張鐵柱2,楊 杰3,王東星1,杜永凱1

(1.徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇徐州 221000；2.江蘇天種牧業(yè)股份有限公司，江蘇徐州 221100；3.徐州鴻宇農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇睢寧 221100)

摘要[目的]研究青霉(Penicillium glaucum)XGY36胞外產(chǎn)阿魏酸酯酶的純化和酶學性質(zhì)。[方法]菌株胞外產(chǎn)酶發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-cellulose DE52離子交換柱層析、Sephadex-G75分子篩層析進行純化，得到純度較高的酶蛋白，并對其酶學性質(zhì)進行研究。[結(jié)果]從菌株發(fā)酵液中分離純化到電泳純的阿魏酸酯酶，純化倍數(shù)6.54，酶活性回收59.7%。阿魏酸酯酶經(jīng)SDS-PAGE獲得1個條帶，其表觀分子量為36.5 ku。催化底物阿魏酸乙酯的最適反應溫度為50 ℃，最適pH為5.0。阿魏酸酯酶在60 ℃以下和pH 3.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。金屬離子Zn2+、Mg2+、Ca2+對酶有明顯的激活作用，而Pb2+、Hg2+和Ag+對阿魏酸酯酶有強烈的抑制作用，Na+、K+、Mn2+、Cu2+和Fe2+對酶活的影響不大。[結(jié)論]青霉阿魏酸酯酶具有潛在的應用價值，適合應用于食品、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞灰綠青霉；阿魏酸酯酶；純化；酶學性質(zhì)

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase，F(xiàn)AE)[1]，屬于羧酸酯水解酶的一個亞類，是一種典型的肉桂酸酯酶。阿魏酸酯酶主要用于破壞阿魏酸與多糖相連的酯鍵[2]，釋放植物細胞壁中的阿魏酸[1]，使剩余的多糖主鏈易被降解，有效提高了含有大量木質(zhì)纖維素和阿魏酸的副產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[3]，在食品、飼料和造紙等工業(yè)中具有較好的應用前景[4]。目前，幾種微生物已被證實能分泌阿魏酸酯酶，主要包括黑曲霉(Aspergillusniger)[5-6]、鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)[7]、黃曲霉(Aspergillusflavus)[8]、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[9]、宇佐美曲霉(Aspergillususamii)[10]等。大多數(shù)的阿魏酸酯酶是從真菌中分離得到的。不同微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、理化性質(zhì)和催化功能上有所不同[11]。目前，關(guān)于高溫穩(wěn)定的阿魏酸酯酶的純化和性質(zhì)的研究則鮮見報道。筆者所在實驗室前期從土壤樣品中篩選到1株能夠產(chǎn)耐熱阿魏酸酯酶的青霉菌株XGY36。筆者對青霉發(fā)酵液中的阿魏酸酯酶進行分離與純化，對其部分酶學性質(zhì)進行了研究，旨在為阿魏酸酯酶在食品、飼料及造紙工業(yè)中的進一步應用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。菌株是從采集于徐州云龍山、托龍山和云龍湖公園等富含腐爛植物莖葉組織的土壤中篩選獲得的，經(jīng)鑒定確定為灰綠青霉(Penicilliumglaucum)，命名為菌株XGY36。

1.1.2培養(yǎng)基。①斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。②種子培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L、豆餅粉30 g/L、KH2PO45 g/L、CaCl20.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.5，121 ℃下蒸氣滅菌15 min。③搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g/L、豆餅粉30 g/L、麥麩15 g/L (粒徑<0.05 mm)、葡萄糖10 g/L、酵母粉8 g/L、NH4NO33 g/L、Na2HPO4·7H2O20.5 g/L、CaCl22 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCl 1 g/L，pH 6.2，121 ℃下滅菌20 min。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑。DEAE-Cellulose DE52、Sephadex G-75，均為Amersham pharmacia公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)低分子量Marker,購自TaKaRa公司；阿魏酸乙酯等其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2.2儀器。KTA Explorer 100/Explorer 10型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)為美國GE公司產(chǎn)品；Hoefer 2-D Electrophoresis電泳系統(tǒng)為美國HOEFER公司產(chǎn)品；SIGMA3K30型臺式冷凍離心機德國Sigma公司產(chǎn)品；Agilent1100 series高效液相色譜儀為美國Agilent公司產(chǎn)品；CascadaTMAN型超純水系統(tǒng)為美國PALL公司產(chǎn)品；Labscale TFF小型切向流超濾系統(tǒng)為美國Millipore公司產(chǎn)品；UV-2450紫外可見光分光光度計為日本島津公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1阿魏酸酯酶粗酶液的制備。種子液培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)72 h后將培養(yǎng)好的菌液按10%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，搖瓶容量500 mL，裝量120 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間96 h。發(fā)酵結(jié)束后。發(fā)酵培養(yǎng)物在4 ℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液。

1.3.2酶的分離與純化。將發(fā)酵液于6 000 r/min，離心20 min，收集上清液，添加硫酸銨至75%飽和度，4 ℃靜置過夜，于8 000 r/min離心20 min，棄去上清，將沉淀溶解于0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 6.5)中，繼續(xù)對其徹底透析。透析脫鹽后的粗酶液用 10 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.5后，上樣于DEAE-Cellulose DE52 陰離子交換柱(2.5 cm× 20 cm)層析，上樣后繼續(xù)用10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗脫未吸附的蛋白，再用含有0～1.0 mol/L的NaCl的Tris-HCl 緩沖液進行線性梯度洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，每管收集3 mL。測定收集管中溶液的酶活力。將有活性的部分合并，超濾濃縮后，樣品上樣于20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH7.5)平衡的Sephadex G-75 (1.6 cm × 90 cm)分子篩凝膠柱并洗脫，控制流速為0.5 mL/min。洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集(3 mL/管)，分別測定各收集管的酶活力，將有活性的部分合并，用于檢測酶純度及研究其酶學性質(zhì)。

1.3.3酶活性檢測。參照陳錦等[12]的方法測定阿魏酸酯酶活力。取0.1 mL經(jīng)適當稀釋的酶液，加入500 μL pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液配制的阿魏酸乙酯溶液，在50 ℃水浴保溫15 min后加入500 μL 10%冰乙酸(V/V)終止酶促反應。先在酶溶液中加入1 mL冰乙酸溶液，再加入底物溶液，將其作為空白對照。采用HPLC法測定其阿魏酸含量。在50 ℃、pH 5.0條件下，每分鐘水解阿魏酸乙酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量定義為1個酶活力單位。高效液相色譜條件如下：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為1%醋酸水溶液/甲醇(72∶28)，柱溫40 ℃，檢測波長320 nm，進樣量10 μL，流速1 mL/min。按上述色譜條件，每個樣品連續(xù)測定3次，取峰面積平均值，計算阿魏酸含量。

1.3.4蛋白濃度測定。蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍G-250染色法(Bradford法)，用牛血清白蛋白制作標準曲線，對蛋白濃度進行定量。

1.3.5SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。參照Laemmli[13]的方法進行SDS-PAGE，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%。將樣品和標準蛋白[兔磷酸化酶B (97 400 u)、牛血清白蛋白(66 200 u)、兔肌動蛋白(45 000 u)、牛碳酸酐酶(31 000 u)、胰蛋白酶抑制劑(21 500 u)、雞蛋清溶菌酶(14 400 u)]進行SDS-PAGE，然后以相對遷移率對分子量繪圖，計算出該蛋白酶的分子量。

1.3.6阿魏酸酯酶性質(zhì)研究。

1.3.6.1酶反應的最適溫度和熱穩(wěn)定性。在0.02 mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(pH 5.0)中，不同溫度(30～80 ℃)下進行酶促反應，確定酶反應的最適溫度。熱穩(wěn)定性測定是將酶分別置于不同溫度(40～80 ℃)下保溫4 h，每隔1 h檢測1次酶活，以未經(jīng)過熱保溫的酶液為空白對照(100%)，檢測酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.2酶反應的最適pH和酸堿穩(wěn)定性。阿魏酸酯酶在不同pH(3.0～8.0)下進行酶促反應，測定其最適pH。測定pH穩(wěn)定性是將酶液加入到20 mmol/L的不同pH緩沖液中，再在40 ℃下保溫1 h，測定剩余阿魏酸酯酶的活性。所用緩沖液為pH 3.0～6.0，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 6.0～7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和pH 8.0～8.5的Tris-HCl緩沖液。

1.3.6.3金屬離子對酶活性的影響。取經(jīng)適當稀釋的酶液，向其中分別加入用蒸餾水配制的金屬鹽溶液(Na+、K+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+)，使金屬離子終濃度達到5 mmol/L，40 ℃下保溫1 h后，按照標準方法測定殘余酶活。以上均以不添加金屬離子的酶液為空白對照(100%)。

2結(jié)果與分析

2.1離子交換柱層析純化將經(jīng)過硫酸銨鹽析、透析脫鹽后初步純化的蛋白樣品過DEAE-Cellulose DE52柱進一步分離純化。條件優(yōu)化后，當pH為7.5時，采用陰離子交換層析柱對目標蛋白實現(xiàn)了較好分離。從圖1可以看出，樣品經(jīng)過陰離子交換層析，隨著洗脫NaCl濃度的逐漸增加，洗脫出多個蛋白峰。經(jīng)酶活測定發(fā)現(xiàn)，酶活主要集中在55～70號收集管，但與對照蛋白洗脫峰相比，酶活集中區(qū)域與蛋白洗脫峰不完全重合，說明酶活收集管中還有雜蛋白。合并有活性的收集管，采用小型切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮進一步純化。

圖1　DEAE-Cellulose DE52陰離子交換層析洗脫曲線Fig.1　Chromatography of protein by DEAE-Cellulose DE52

2.2分子篩凝膠過濾層析采用分子篩層析方法對合并的活性收集管蛋白進一步純化。選擇Sephadex G-75色譜柱，經(jīng)條件優(yōu)化后得到較為理想的分離效果。從圖2可以看出，經(jīng)分離得到3個完全獨立的洗脫峰，經(jīng)蛋白濃度測定，洗脫后蛋白集中在峰1和峰3，峰2為非蛋白峰。對峰1和峰3進行酶活測定，結(jié)果表明峰3(42～48號管)表現(xiàn)出強的阿魏酸酯酶活性，活性峰同蛋白峰完全對應。

從表1可以看出，經(jīng)過硫酸銨沉淀、超濾、離子交換柱層析、分子篩凝膠過濾層析，酶的比活力從最初的11.22 mU/mg提高到466.42 mU/mg，純化了41.57倍，活性回收率為32.18%。將純化的酶凍干脫水后在-4 ℃下保存下，儲存6個月活性無明顯變化。

圖2　Sephadex G-75凝膠柱洗脫曲線Fig.2　Chromatography of protein by Sephadex G-75

2.3阿魏酸酯酶純度和分子量測定采用SDS-PAGE分別測定硫酸銨鹽析、DEAE-Cellulose DE52陰離子交換層析、Sephadex G-75分子篩凝膠層析法純化后的粗酶純度和分子量。從圖3可以看出，僅經(jīng)過硫酸銨鹽析和透析純化的粗酶液含有大量的蛋白條帶，經(jīng)DEAE-Cellulose DE52分離后去除了大量雜蛋白，獲得約8條組分帶，進一步經(jīng)Sephadex G-75色譜柱分離后的酶液僅有1條蛋白條帶，說明發(fā)酵液經(jīng)過以上一系列純化后已獲得純度較高的阿魏酸酯酶。經(jīng)計算，阿魏酸酯酶的分子質(zhì)量約為36.5 ku。該酶的分子質(zhì)量偏小，這可能與不同菌株所產(chǎn)的阿魏酸酯酶在分子結(jié)構(gòu)和組成方面存在差異有關(guān)。

表1　灰綠青霉XGY36阿魏酸酯酶的分離與純化

注：1.低分子量標準蛋白；2.經(jīng)硫酸銨鹽析后的粗酶液；3.經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-Cellulose DE52陰離子交換層析后的粗酶液；4.經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-Cellulose DE52陰離子交換層析、Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析后的酶液?！ote：1.Low molecular weight standard protein; 2.The crude enzyme liquid after a mmonium sulfate precipitation; 3.The crude enzyme liquid after a mmonium sulfate precipitation,DEAE-Cellulose DE52 anion exchange chromatography; 4.The crude enzyme liquid after a mmonium sulfate precipitation,DEAE-Cellulose DE52 anion exchange chromatography,Sephadex G-75 molecular sieve gel filtration.圖3　阿魏酸酯酶純化過程的SDS-PAGE圖譜Fig.3　SDS-PAGE results of proteins during the purification of ferulic acid esterase

2.4阿魏酸酯酶的酶學性質(zhì)研究

2.4.1最佳反應溫度。從圖4可以看出，在30～50 ℃范圍內(nèi)，阿魏酸含量隨著反應溫度的升高而增加，說明隨著溫度的升高，阿魏酸酯酶酶活力增加，降解阿魏酸乙酯產(chǎn)生的阿魏酸含量也增加。當反應溫度為50 ℃時，阿魏酸含量達到最大值。此后，溫度進一步升高，由于阿魏酸酯酶分子開始變性失活，所以阿魏酸含量降低，隨著溫度的升高而下降。因此，確定該酶降解反應的最佳溫度為50 ℃。

圖4　阿魏酸酯酶的最適反應溫度Fig.4　The optimal temperature of ferulic acid esterase

圖5　溫度對阿魏酸酯酶穩(wěn)定性的影響Fig.5　Effects of temperature on stability of ferulic acid esterase

2.4.2不同溫度對阿魏酸酯酶穩(wěn)定性的影響。從圖5可以看出，40 ℃下保溫4 h后酶活力幾乎沒有變化；50 ℃下保溫2 h后剩余酶活在90%以上；60和70 ℃下保溫2 h后剩余酶活約為80%；在70和80 ℃下保溫2 h相對酶活仍保持70%以上；80 ℃下保溫3 h，酶活保持50%以上。該試驗結(jié)果表明該阿魏酸酯酶在60 ℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性。2.4.3pH對阿魏酸酯酶活性的影響。

2.4.3.1最佳反應pH。從圖6可以看出，當反應液的pH為3.0～5.0時，阿魏酸含量隨著pH的升高而逐漸增加。當pH為5.0，阿魏酸含量達到最大值。當反應液的pH超過5.0時，阿魏酸酯酶的活力逐漸降低；當pH超過6.5時，阿魏酸酯酶酶活力大幅降低。這也說明堿性條件不利于催化降解反應。阿魏酸酯酶催化阿魏酸乙酯制備阿魏酸的最適反應pH為5.0。

2.4.3.2阿魏酸酯酶的酸堿穩(wěn)定性。將純化后的酶液用不同pH的緩沖液配制，于室溫下處理4 h，測定其剩余酶活力。從圖6可以看出，在pH 3.0～3.5范圍內(nèi)酶活呈上升趨勢，當pH為3.5～6.5，酶活性幾乎沒有變化；當pH超過6.5時，酶活力呈逐漸下降趨勢。整體來看，在pH3.5～6.5范圍內(nèi)酶活力比較穩(wěn)定，保溫4 h后阿魏酸酯酶的剩余活力仍在90%以上，表明該酶在酸性環(huán)境下有較強的耐受力。

圖6　阿魏酸酯酶的最適反應pH及其pH穩(wěn)定性Fig.6　Optimal pH and pH stability of ferulic acid esterase

2.4.3.3常見金屬離子對阿魏酸酯酶活性的影響。在阿魏酸酯酶中加入各種金屬離子并保持離子濃度為5 mmol/L，同時以不添加金屬離子的酶液為對照，測定阿魏酸酯酶活性。由表2可知，Zn2+、Mg2+、Ca2+對阿魏酸酯酶具有一定的激活作用，Pb2+、Hg2+和Ag+對阿魏酸酯酶有強烈的抑制作用，其他一些金屬離子(如Na+、K+、Mn2+、Cu2+、Fe2+等)對阿魏酸酯酶活性沒有顯著影響，說明阿魏酸酯酶與大部分金屬離子都有良好的配伍性能。

表2各種金屬離子對阿魏酸酯酶活性的影響

Table 2Effect of various metal ions on the ferulic acid esterase activity

試劑Reagent濃度Concentrationmmol/L相對酶活Relativeenzymeactivity∥%--100.0±3.1Na+5102.0±1.5K+5100.0±2.6Mg2+5128.0±6.4Ca2+5135.0±2.4Mn2+578.0±3.8Fe2+591.0±2.9Cu2+580.0±3.6Zn2+5114.0±4.8Hg2+534.0±1.6Pb2+527.0±4.4Ag+544.0±1.5

3結(jié)論

該研究建立了從灰綠青霉(Penicilliumglaucum)發(fā)酵液中獲取阿魏酸酯酶的純化方法。該試驗結(jié)果表明，發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨沉淀預處理、陰離子交換層析以及分子篩層析純化等，最終獲得了純度較高的阿魏酸酯酶。該酶分子量36.5 ku，最終純化41.57倍。該研究提純的GOD的最適pH為5.0，酶在pH3.0～7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，其pH穩(wěn)定范圍較寬，主要在酸性環(huán)境下，由此可見該阿魏酸酯酶特別適合在飼料中使用，在動物胃的酸性環(huán)境下一直保持高活性，可以有效將富纖維飼料充分降解。此外，酶的最適溫度為50 ℃，在80 ℃下保溫2 h仍保存有70%以上的酶活力，說明此酶的熱穩(wěn)定性很好，可高溫應用。在飼料、食品等工業(yè)上應用阿魏酸酯酶時，其熱穩(wěn)定性相當重要，特別是在食品滅菌消毒以及飼料的高溫造粒中該酶可以保持高穩(wěn)定性。因此，阿魏酸酯酶在工業(yè)中有潛在的應用價值。

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基金項目大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(201311998053Y)；徐州市科技計劃項目(XF13C011，XF13C027)。

作者簡介徐大偉(1989- )，男，江蘇連云港人，本科生，專業(yè)：生物工程。*通訊作者，副教授，博士，從事食品生物技術(shù)。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號Q 81

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-024-04

Study on Separation,Purification and Enzymatic Properties of Ferulic Acid Esterase fromPenicilliumglaucum

XU Da-wei1,GAO Zhao-jian1*,ZHANG Tie-zhu2et al

(1.College of Food (Biological) Engineering,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou,Jiangsu 221000; 2.Jiangsu Tianzhong Pasture Farming Co.Ltd.,Xuzhou,Jiangsu 221000)

Abstract[Objective] The aim was to study purification and enzymatic properties of feruloyl esterase in the culture solution of Penicillium glaucum XGY36.[Method] The feruloyl esterase was obtained in the culture solution of Penicillium glaucum XGY36 and was purified to be homogeneous by the steps of ammonium sulfate precipitation,DEAE-cellulose DE52 chromatographies,and Sephadex G-75 chromatography.The enzyme protein with high purity was obtained,enzymatic properties were studied.[Result] Purification of about 6.54 fold was achieved with an overall yield of 59.7%.The molecular weight of purified feruloyl esterase was estimated to be about 36.5 ku by SDS-PAGE.The optimum temperature and pH of the enzyme activity were 50 ℃ and 5.0,respectively in catalytic reaction of ethyl ferulate.The enzyme activity was stable under 60 ℃,and with pH range of 3.0-7.0.The activity of feruloyl esterase was highly enhanced by Zn2+,Mg2+and Ca2+,whereas it was strongly inhibited by the metal ions Pb2+,Hg2+and Ag+,while Na+,K+,Mn2+,Cu2+and Fe2+had no strong effect on feruloyl esterase activity.[Conclusion] Feruloyl esterase has potential applied value and fit to apply in the fields of food,medicine and biology etc..

Key wordsPenicillium glaucum; Ferulic acid esterase; Purification; Enzymatic properties