人IL-37b基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

姚靜，程江2*，裴雪楓3，王靜宇4，袁明4*

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆石河子 832000；3.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；4.中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094）

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人IL-37b基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

姚靜1，程江2*，裴雪楓3，王靜宇4，袁明4*

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆石河子 832000；3.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；4.中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094）

【摘要】目的 構(gòu)建pEGFP-N1/IL-37b真核表達(dá)載體，并檢測其在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法 從人PBMCs中提取總RNA，利用RT-qPCR技術(shù)擴(kuò)增出IL-37b基因編碼區(qū)序列，克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1/IL-37b轉(zhuǎn)染到THP-1細(xì)胞中，通過RT-qPCR和Western blot檢測IL-37的表達(dá)。結(jié)果 雙酶切及基因測序結(jié)果顯示IL-37b基因正確插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1中；RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，IL-37表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論 成功構(gòu)建了新型抗炎因子IL-37真核表達(dá)載體pEGFP-N1/IL-37b，為進(jìn)一步研究IL-37功能及與相關(guān)疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素-37；基因克隆；真核表達(dá)載體；THP-1細(xì)胞

IL-37作為IL-1家族11個(gè)成員之一，最初是由Kumar等［1］于2000年利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的，并命名為IL-1H4。后由Dunn等［2］于2001年命名為IL-1F7。2010年，Nold等［3］正式將IL-1F7更名為IL-37。IL-37基因位于人類第二號染色體上，共有五種不同的剪切亞型，即IL-37a～e，其中 IL-37b是五種亞型中分子量最大的一個(gè)［4，5］。IL-37具有廣泛的炎癥抑制作用，可抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞等細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生［3，6］，另外在感染性休克、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、肝損傷、肝癌等疾病中發(fā)揮重要作用［3，7-10］。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程相關(guān)技術(shù)，從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中成功克隆出IL-37b全長編碼區(qū)序列，并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，且成功在THP-1細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)，為進(jìn)一步研究IL-37的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液標(biāo)本

5 mL人外周血由本實(shí)驗(yàn)室課題組成員提供。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞

pEGFP-N1質(zhì)粒、THP-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；轉(zhuǎn)化態(tài)E.coli DH5α購自康為世紀(jì)。

1.1.3 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液、LPS購自Sigma；Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收及DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自康為世紀(jì)；限制性內(nèi)切酶BamHI及EcoRI、T4 DNA連接酶購自NEB；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Green熒光定量試劑盒購自TaKaRa；TRIzol試劑購自Invitrogen；IL-37單克隆抗體購自 Abcam（ab57187）；GAPDH單克隆抗體購自CST（D16H11）；胎牛血清、RPMI1640及 Opti-MEM培養(yǎng)基購自 Gibco；EntransterTM-D4000轉(zhuǎn)染試劑購自Engreen。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

分離健康人新鮮外周血單個(gè)核細(xì)胞于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入1 μg/mL刺激濃度的LPS，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。用TRIzol法對所收集的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR合成cDNA。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中IL-37b（NM_014439.3）的序列分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增CDs全長（660 bp）的上下游引物，上游：5′-TCGAATTCTTGAAAATGTCCTTTGTGGGG G-3′，下游：5′-AAGGATCCATATCGCTGACCTCACTGGGGCT-3′（下劃線分別為EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)）。以合成的cDNA為模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下［11］：94℃預(yù)變性2 min、94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化。

1.2.3 真核表達(dá)載體pEGFP-N1/IL-37b的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別對回收的PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1空載體進(jìn)行37℃雙酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化后，在T4 DNA連接酶作用下16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，次日隨機(jī)挑取8個(gè)平板上單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選陽性單克隆菌落擴(kuò)增提取質(zhì)粒，進(jìn)一步對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及測序鑒定。

1.2.4 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇THP-1細(xì)胞于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日換液，之后每隔3～4 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至70%左右時(shí)，按照EntransterTM-D4000轉(zhuǎn)染說明書操作，培養(yǎng)72 h后，給予1 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，離心收集細(xì)胞。

1.2.5 重組質(zhì)粒在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)及檢測

分別提取THP-1細(xì)胞總RNA和總蛋白，采用RT-qPCR和Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后THP-1細(xì)胞中IL-37 mRNA和蛋白水平的變化。相關(guān)引物序列見表1。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 IL-37b基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

IL-37b基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見兩條略小于700 bp且大小相近的一明一暗條帶（見圖1），大小與預(yù)期相符。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primer pairs for the real-time PCR

注：M：Marker；1：PCR產(chǎn)物。圖1 IL-37b基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Note.M：Marker；1：PCR products.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of IL-37b PCR products.

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒單克隆菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，8號菌落在略小于750 bp處有一明亮的特異性條帶（見圖2），對其進(jìn)行增菌提取質(zhì)粒，進(jìn)一步雙酶切（EcoRI/BamHI），產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，可見約4700 bp的載體片段和660 bp左右的目的基因片段（見圖3），大小與預(yù)期相符。DNA測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1/ IL-37b中含有IL-37b的全長序列（660 bp），Blast同源性分析顯示，與 GenBank中登錄的 IL-37b （NM_014439.3）序列相比，發(fā)現(xiàn)有兩處堿基存在差異，即G/T和A/G（見圖4），經(jīng)查證是單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

2.3 IL-37b在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒pEGFP-N1/IL-37b轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示（見圖5），IL-37b表達(dá)較對照組明顯升高（P＜0.01），且給予LPS刺激后，差異有顯著性（P＜0.001）。Western blot檢測結(jié)果顯示（見圖6），在50×103左右處可見特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符；對條帶進(jìn)行光密度量化分析結(jié)果顯示，IL-37表達(dá)轉(zhuǎn)染組較對照組明顯升高（P＜0.01）。

注：M：Marker；a～b：陰性克隆菌落PCR產(chǎn)物；1～8：陽性克隆菌落PCR產(chǎn)物。圖2 菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳Note.M：Marker；a～b：Negative control；1～8：Positive colony PCR products.Fig.2 PCR agarose gel electrophoresis of the bacterial colonies

注：M：Marker；1：陰性對照；2：pEGFP-N1/IL-37b雙酶切產(chǎn)物。圖3 pEGFP-N1/IL-37b雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Note.M：Marker；1：Negative control；2：Restriction enzyme digestion products of pEGFP-N1/IL-37b.Fig.3 Agarose gel electrophoresis of restriction enzyme digestion products of pEGFP-N1/IL-37b.

3 討論

IL-1超家族共有11個(gè)成員，絕大多數(shù)是促炎性細(xì)胞因子，其中7個(gè)為激動(dòng)劑（IL-1α、1L-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ），2個(gè)為天然的受體拮抗劑（IL-1Ra、IL-36Ra）。IL-37作為第7個(gè)成員，是一種天然的免疫抑制物，IL-37作為一種天然的免疫抑制物，可由TLRs配體以及一些促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IFN-γ等）刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）、樹突狀細(xì)胞（DCs）誘導(dǎo)產(chǎn)生，能夠抑制多種炎癥因子的表達(dá)。IL-37基因共有6個(gè)外顯子，通過不同的剪切，形成5個(gè)剪切亞型（IL-37a-e），但是不同的剪切亞型具有組織特異性，如IL-37a、b、c主要表達(dá)于淋巴結(jié)、胸腺、骨髓、肺、睪丸、胎盤、子宮、皮膚、結(jié)腸、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞和受刺激的B細(xì)胞中，而IL-37d、e只表達(dá)與骨髓和睪丸中；大腦中僅表達(dá)IL-37a，腎臟中僅表達(dá)IL-37b，心臟中僅表達(dá)IL-37c［4］。值得一提的是，IL-37是目前鼠科同系物中唯一沒有發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員［12］。

圖4 DNA序列比對分析部分結(jié)果Fig.4 Analysis of DNA sequence alignment.

注：轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。圖5 THP-1細(xì)胞中IL-37b基因mRNA水平的表達(dá)Note.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 for IL-37b expression vs. mock-transfected.Fig.5 IL-37b mRNA expression level in the THP-1 cells

注：轉(zhuǎn)染組與空轉(zhuǎn)組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。圖6 THP-1細(xì)胞中IL-37蛋白水平的表達(dá)Note.Electrophoresis（left）and quantification（right）representation of Western blot.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 for IL-37b expression vs.mock-transfected.Fig.6 IL-37 protein expression levels in the THP-1 cells

IL-37b是五種亞型中分子量最大的一個(gè)，包含除3號外顯子以外的其他5個(gè)外顯子［4，5］，且1號外顯子可編碼caspase-1酶切位點(diǎn)，IL-37b前體經(jīng)caspase-1切割活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)在caspase-1催化活性缺失后，IL-37b的入核能力喪失，同時(shí)其炎癥抑制作用下降［13］。然而，入核參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控并不是IL-37發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用的唯一方式。研究者發(fā)現(xiàn)重組IL-37能夠有效抑制脂多糖（LPS）引起的IL-6和IL-1α的產(chǎn)生，以及胞內(nèi)蛋白激酶JNK、MAPK（p38）、ERK的磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)抑制炎癥信號的傳導(dǎo)，由此證明分泌到胞外的IL-37也具有抑制炎癥的作用［14］。此外IL-37還可通過與 IL-18Rα結(jié)合，進(jìn)一步募集 IL-1R8，形成一個(gè)三聚體裝配在細(xì)胞表面，抑制LPS與其受體TLR4的結(jié)合，從而抑制炎癥反應(yīng)［15］。在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-37可抑制樹突狀細(xì)胞的成熟，使其維持在半成熟狀態(tài)，從而不能有效地發(fā)揮其在免疫應(yīng)答中捕獲、處理和呈遞抗原的作用，抑制免疫系統(tǒng)識別并且靶標(biāo)新抗原的能力［6］。

一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，IL-37在疾病的進(jìn)展中，起到保護(hù)作用，如在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的感染性休克、葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、刀豆素A （ConA）誘導(dǎo)的肝炎、煙曲霉菌誘導(dǎo)的肺部真菌感染中，發(fā)現(xiàn)IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠的全身炎癥反應(yīng)、局部器官組織的損傷程度較野生對照小鼠減輕、炎癥因子的產(chǎn)生減少［3，8，9，16］。另外一些來源于臨床樣本的研究結(jié)果分析顯示［17］，不同的炎癥性疾病及自身免疫性疾病中，IL-37的表達(dá)有不同程度的上調(diào)或下調(diào)。

基于IL-37潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)室從LPS刺激的PBMCs中成功克隆出大IL-37b全長序列，通過瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在略小于700 bp處有上下兩條大小相近的一明一暗條帶，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，PBMCs中可表達(dá)IL-37b和IL-37c兩種剪切亞型，因此我們考慮明亮且分子量稍大的條帶為IL-37b，而另一條灰暗且分子量略小的為IL-37c。對IL-37b進(jìn)行膠回收及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將IL-37b編碼區(qū)全長序列克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-N1，該載體含有SV40和CMV啟動(dòng)子及綠色熒光蛋白GFP，具有穩(wěn)定表達(dá)、利于檢測基因轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)酶切及測序鑒定，發(fā)現(xiàn)與GenBank中登錄的IL-37b（NM _014439.3）序列有兩處堿基存在差異，即 GGA/ GTA（甘氨酸/纈氨酸）和ACC/GCC（蘇氨酸/丙氨酸），經(jīng)查證均為該基因的兩處單核苷酸多態(tài)性（SNP：rs3811046和rs3811047）。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，檢測到無論是否給與LPS刺激，IL-37表達(dá)均顯著升高，成功地實(shí)現(xiàn)了其在THP-1細(xì)胞中的過表達(dá)，為后續(xù)研究IL-37與其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子相互作用的分子機(jī)制及與相關(guān)疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0268-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.010

Corresponding author：YUAN Ming，E-mail：yuanming7711@aliyun.com；CHENG Jiang，E-mail：chengjiang1980 @sina.com

［基金項(xiàng)目］國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2014CB744404）。

［作者簡介］姚靜（1988-），女，碩士，研究方向：臨床分子生物學(xué)診斷，E-mail：yaojing_hnzz@163.com。

［通訊作者］袁明（1977-），男，副研究員，博士，研究方向：空間生物學(xué)，E-mail：yuanming7711@aliyun.com；程江（1963-），男，教授，碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)室管理及分子生物學(xué)，E-mail：chengjiang1980@sina.com。

［收稿日期］2016-01-06

Construction and expression of eukaryotic expression vector of human IL-37b gene

YAO Jing1，CHENG Jiang2*，PEI Xue-feng3，WANG Jing-yu4，YUAN Ming4*
（1.Medical College of Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Shihezi Medical University，Shihezi 832000；3.Liaoning Medical College，Jinzhou 121001；4.Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application，China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094）

【Abstract】Objective To construct the eukaryotic expression vector pEGFP-N1/IL-37b and analyze the expression of IL-37 gene in THP-1 cells.Methods Total RNA was extracted from human peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）and the coding region of IL-37b gene was amplified by RT-qPCR.Then，the gene was cloned into pEGFP-N1 eukaryotic expression vector.After transfected the recombinant plasmid into THP-1 cells，the expression of IL-37 was detected by RT-qPCR and Western blot.Results Double restriction enzyme digestion and gene sequencing showed that IL-37b gene was correctly inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1.RT-qPCR and Western blot showed that the IL-37 expression level was increased significantly（P＜0.01）after transfection in THP-1 cells.Conclusions We successfully constructed a novel anti-inflammatory cytokine IL-37 eukaryotic expression vector pEGFP-N1/IL-37b，which lays a foundation for further study on IL-37 functions and its association with related diseases.

【Key words】Interlukin-37；Gene cloning；Eukaryotic expression vector；THP-1 cells