巴馬豬NK細胞表型鑒定及豬CIK細胞誘導方法建立

祝明皓，陸濤峰2，牛銀杰2，趙麗麗2，陳洪巖2*

（1.東北農業(yè)大學，哈爾濱 150030；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001）

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專題研究

巴馬豬NK細胞表型鑒定及豬CIK細胞誘導方法建立

祝明皓1，2，陸濤峰2，牛銀杰2，趙麗麗2，陳洪巖2*

（1.東北農業(yè)大學，哈爾濱 150030；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001）

【摘要】目的 獲得巴馬豬外周血淋巴細胞中NK細胞的表型及比例的數(shù)據(jù)，建立一種高效率豬CIK（cytokine-induced killer）細胞體外誘導培養(yǎng)的方法。方法 分離巴馬小型豬外周血淋巴細胞，通過檢測CD2+/CD8+/ CD3-細胞以表征豬NK細胞的表型；通過優(yōu)化誘導培養(yǎng)條件，提高誘導淋巴細胞中CIK的比例，建立高效率CIK細胞體外誘導方法。結果 利用優(yōu)化的誘導培養(yǎng)條件，在誘導培養(yǎng)第5天時CD3-/CD2+/CD8+的NK細胞的比例可高達43.63%，較最初分離時NK細胞比例提升了5.59倍；細胞增殖活性實驗表明誘導培養(yǎng)第5天時可見明顯的3個熒光峰，表明誘導后細胞發(fā)生了3次分裂，理論上較最初分離增加了8倍；誘導細胞的qPCR表型分析表明該細胞群體在誘導培養(yǎng)第5天時相關的表面標志有明顯的上升也與流式分析結果一致。結論 建立了高效的豬CIK細胞體外誘導培養(yǎng)的方法。

【關鍵詞】巴馬小型豬；NK細胞；CIK細胞；表型鑒定

NK細胞，即自然殺傷細胞，是機體重要的免疫細胞，具有殺傷性強、殺傷效果高效、可直接殺死癌細胞等特點，NK細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞和寄生蟲等［1］。NK細胞現(xiàn)已被越來越多地應用于各種臨床研究之中，尤其是對人類及嚙齒類的研究較為透徹。但某些大型動物如豬、牛等，其細胞表征與嚙齒類相比差異很大［5］，目前臨床研究也相對較少，因此能建立一種能夠高效地分離豬NK細胞并使其能在體外穩(wěn)定增殖的方法便尤為方便重要。

通過細胞因子而誘導細胞培養(yǎng)的方法在近些年中已有大量報道，而目前人的CIK細胞已研發(fā)成功并投入到臨床應用。該細胞的培養(yǎng)方法是通過在無血清的懸浮細胞培養(yǎng)基中，分別在不同培養(yǎng)時期加入CD3、IFN-γ以及IL-2等細胞因子，以達到增強細胞殺傷性、促進細胞體外增殖的目的［2-5］。根據(jù)已有報道，通過該方法培養(yǎng)的殺傷細胞可在體外連續(xù)培養(yǎng)20 d左右，增殖約15代左右，是在短時間內大量獲得殺傷性細胞的有效方法。

本實驗旨在對豬NK細胞進行體外誘導培養(yǎng)并進一步對其條件進行優(yōu)化，以提高NK細胞比例。在細胞生長過程中，對CD2+/CD8+/CD3-表型的豬NK細胞的數(shù)量比例進行流式檢測［6］。細胞培養(yǎng)過程中每天對細胞留樣并提取RNA，并根據(jù)Talker 與Gerner的研究方法［7，8］，對各個時期豬CIK細胞的CD2、CD3、CD8α、SLA-DRA和PRF1這五種表面標志用熒光定量RT-PCR的方法進行表型鑒定［8］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Percoll細胞分離液購自于 Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購自于Gibco公司，KBM581培養(yǎng)液購自于Corning公司，雙抗由本研究所提供。人CD3單抗由博士德生物提供，IFN-γ與IL-2誘導素購自于雙鷺藥業(yè)。Anti-CD2（Apc）抗體，Anti-CD3 （FITC）抗體，Anti-CD8（PE-cy5）抗體均購自于Abcam公司。CFDA-SE熒光染料購自于 KeyGen公司，TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒由Transgen公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬外周血淋巴細胞分離及表型鑒定

從頸靜脈采集巴馬小型豬血液，加入到含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管中。采用Percoll（1.110 ng/ L）密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞［9，10］，收集淋巴細胞層，用PBS洗滌2次，加入適量細胞培養(yǎng)液重懸，利用流式抗體CD2、CD3、CD8對細胞進行標記，用流式細胞儀檢測各種表面標志的表達情況，實驗方法參照表型分析部分。。

1.2.2 細胞因子刺激及體外培養(yǎng)

在最初分離的外周血淋巴細胞按1000 U/mL的終濃度加入IFN-γ，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日按終濃度補加CD3 50 ng/mL和IL-2 1000 U/mL。每2～3 d觀察CIK細胞，并添加完全培養(yǎng)基和IL-2（終濃度1000 U/mL）［5，6］。培養(yǎng)過程中，對每天的細胞進行一次200 μL的樣本留取，用于表面標志的鑒定。為優(yōu)化培養(yǎng)條件，本實驗選擇了KBM581無血清培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基+5%FBS進行對比體外培養(yǎng)，以選取最合適的培養(yǎng)液。

1.2.3 細胞增殖活性檢測

將最初分離出的外周血淋巴細胞留取一部分，用CFDA-SE以1∶1000的比例對細胞進行染色。加入熒光指示劑后37℃孵育30 min即可完成染色［7］。之后用PBS將細胞懸浮清洗兩次，離心條件同之前步驟，最后按照1.2.2方法進行誘導培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)的細胞分別在1、3、5、7、9 d取適量細胞樣品，通過流式細胞儀檢測細胞增殖狀況。本實驗同時對用1640和KBM581培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞進行染色，分別在相同時間點對其增殖狀況進行檢測，以便更直接準確地判斷細胞誘導增殖的最適培養(yǎng)體系。

1.2.4 細胞表型分析

（1）流式細胞儀檢測CD2+/CD8+/CD3-細胞比例

在豬外周血淋巴細胞誘導培養(yǎng)過程中，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天對細胞取樣，按照比例1∶100加入流式抗體CD2、CD3、CD8對細胞進行標記，每次標記過程中都進行四組染色標記，分別為三種標簽的單獨標記及三種標簽的共同標記，標記方法如下：首先吸取適量細胞培養(yǎng)液，600 g離心15 min，棄上清后用適量PBS懸浮清洗細胞，再次600 g離心15 min，之后用5%BSA懸浮細胞，室溫封閉1 h，按上述條件離心，加入適量PBS懸浮細胞，并根據(jù)需求加入不同抗體對細胞進行熒光標記，37℃孵育1 h后，離心，并用PBS清洗兩次，最后再用適量PBS重懸細胞，過300目細胞篩后將樣品轉移至流式管中，通過流式細胞儀檢測表型為CD2+/CD8+/CD3-的NK細胞比例變化情況。

（2）熒光定量RT-PCR檢測細胞表型

首先以Talker等人研究報道為參考，在NCBI查獲要檢測的CD2、CD3、CD8α、SLA-DRA和PRF1五種基因CDS序列，并合成引物，再以韓建強等［11］為參考，合成GAPDH單拷貝基因引物［8］，待合成出可擴增出單一基因片段的全部引物后，以之前取得的1～9 d細胞樣品提取的RNA為模板，根據(jù)所購買的試劑盒說明書分別用上述引物進行細胞表型的qRT-PCR檢測。每個基因表達量原始數(shù)據(jù)，經處理后得到相對表達量2-ΔΔCt，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

CD2、CD3、CD8對細胞進行標記，利用流式細胞儀檢測各種表面標志的表達情況，結果如圖1所致。結果表明，新鮮分離的外周血淋巴細胞中，淋巴細胞約占總細胞含量的26.4%，淋巴細胞中CD2+細胞的比例約為 41.54%、CD3+細胞的比例約為26.89%、CD8+細胞的比例約為 34.83%，CD2+/ CD8+/CD3-細胞的比例約為 7.82%。CD2+/ CD8+/CD3-細胞被認為是豬NK細胞的典型表型，因此，本研究中測得的巴馬豬NK細胞約占總淋巴細胞的7.82%。

2.1 巴馬豬NK細胞的表型分析

分離巴馬豬外周血淋巴細胞，利用流式抗體

圖1 巴馬豬外周血淋巴細胞表型分析Fig.1 Phenotype identification of PBMCs in the Bama miniature pigs

2.2 巴馬豬CIK細胞體外誘導培養(yǎng)方法的建立

2.2.1 培養(yǎng)體系優(yōu)化

將分離得到的淋巴細胞進行誘導，采用不同的培養(yǎng)體系，“1640培養(yǎng)液+5%FBS”和“KBM581無血清培養(yǎng)液”，分別對細胞進行培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)，并對細胞的生長狀況進行記錄，繪制生長曲線。結果表明，兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)得到的細胞在前期培養(yǎng)過程中（1～6 d）在形態(tài)上差異不顯著（如圖2），但在體外培養(yǎng)的后期（7 d以后）KBM581培養(yǎng)的細胞的凋亡速度和細胞碎片數(shù)量明顯較1640培養(yǎng)多。

注：A.1640培養(yǎng)體系培養(yǎng)3 d；B.KBM581培養(yǎng)體系培養(yǎng)3 d。圖2 巴馬豬CIK細胞形態(tài)（×200）Note.A.Cells cultured in 1640 medium for 3 days. B.Cells cultured in KBM581 medium for 3 days.Fig.2 Morphology of cytokine-induced killer cells in the Bama miniature pigs（×200）

2.2.2 巴馬豬CIK細胞增殖

選擇同一批分離的外周血淋巴細胞，分別用“1640培養(yǎng)液+5%FBS”和“KBM581無血清培養(yǎng)液”進行培養(yǎng)，按照1.2.2的方法誘導產生的CIK細胞和按照1.2.3的方法用CDFA-SE標記細胞，分別在培養(yǎng)的第1、3、5天進行細胞取樣，并通過流式細胞儀檢測細胞增殖情況（如圖3所示）。實驗結果表明，兩種培養(yǎng)體系得到結果基本一致，在誘導培養(yǎng)第5天時均可見明顯的3個熒光峰，表明誘導后細胞發(fā)生了3次分裂，理論上較最初分離增加了8倍。

2.3 細胞表型分析

2.3.1 流式細胞儀檢測CD2+/CD8+/CD3-細胞比例變化

分離巴馬豬外周血淋巴細胞，選擇1640培養(yǎng)體系進行CIK細胞誘導培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天對細胞取樣，用CD2、CD3、CD8對細胞進行標記，利用流式細胞術分析豬CIK細胞在培養(yǎng)過程中的比例變化，結果如圖4所示。實驗結果表明，新鮮分離的淋巴細胞中具有NK細胞表型的細胞占7.81%，誘導培養(yǎng)第3天開始，CIK細胞比例明顯上升，到第5天達到頂峰，其占總細胞43.63%，較最初分離時相比細胞比例提升了5.59倍，繼續(xù)之后細胞比例趨于平穩(wěn)，在第7天之后NK細胞比例略有下降。

注：A～C分別為1640培養(yǎng)體系分別培養(yǎng)1、3、5 d用流式測得的細胞增殖結果；D～F分別為KBM581培養(yǎng)體系分別培養(yǎng)1、3、5 d用流式測得的細胞增殖結果。圖3 巴馬豬CIK細胞增殖活性分析Note.A-C：CIK cells cultured in 1640 medium for 1，3 and 5 days；D-F：CIK cells cultured in KBM581 medium for 1，3 and 5 days.Fig.3 Analysis of the proliferation activity of CIK cells in the Bama miniature pigs

注：A～E分別為CIK誘導培養(yǎng)過程中不同時間（1、3、5、7、9 d）具有NK細胞表型（CD2+/CD8+/CD3-）的細胞比例變化情況；F圖為CD2+/CD8+/CD3-細胞數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果。圖4 巴馬豬CIK細胞培養(yǎng)過程比例變化分析Note.A-E，Cultured in 1640 medium for 1，3，5，7 and 9 days；F：Statistical results of the CD2+/CD8+/CD3-cells.Fig.4 Changes of the ratio of CD2+/CD8+/CD3-cells of the Bama miniature pigs during the culture process

2.3.2 qRT-PCR檢測CIK細胞表型

分離巴馬豬外周血淋巴細胞，選擇1640培養(yǎng)體系進行CIK細胞誘導培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天對細胞取樣，進行熒光定量RT-PCR反應，檢測豬NK細胞表面標志CD2、CD3、CD8α、SLA-DRA 和PRF1五個基因的表達變化情況，統(tǒng)計各個基因與內參的 Ct值，對數(shù)據(jù)進行均一化處理，計算2-ΔΔCt，繪制曲線，所檢測的數(shù)據(jù)在1～9 d變化結果如圖5所示。結果表明，在細胞培養(yǎng)初期，由于誘導因子的加入，各NK細胞相關表型基因的表達量開始上升，在5 d達到頂峰，在6 d之后呈下降趨勢，說明在第5天細胞群體有明顯增殖，各種表面marker表達都在此時增強，此結果與流式結果一致，表明在體外使用細胞因子誘導巴馬豬外周血淋巴細胞能夠使具有NK細胞表型的細胞類群的比例明顯提高。

圖5 qRT-PCR檢測CIK細胞表型Fig.5 Phenotype analysis of the surface markers ofporcine NK cells detected by qRT-PCR

3 討論

本研究首先測定了新鮮分離的豬外周血淋巴細胞中NK細胞（CD2+/CD8+/CD3-）的比例，通過流式細胞儀檢測的結果顯示，當巴馬豬外周血淋巴細胞剛被分離出時，NK細胞約占總淋巴細胞的7.82%，本結果可以為豬NK細胞研究提供參考。

接下來，本研究比較了兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)效果，結果顯示“1640培養(yǎng)液+5%FBS”和“KBM581無血清培養(yǎng)液”兩種培養(yǎng)體系在培養(yǎng)7 d內，在增殖活性和細胞表型上差異不顯著，但是在7 d之后，“1640培養(yǎng)液+5%FBS”的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細胞狀況要明顯好于“KBM581無血清培養(yǎng)液”體系的細胞，通過鏡下觀察細胞數(shù)量以及細胞形態(tài)均一程度便可較明顯的體現(xiàn)出來。兩種培養(yǎng)體系的主要差異在于培養(yǎng)體系中是否含有血清，因此，可以根據(jù)實驗目的而選擇不同的培養(yǎng)體系來達到實驗效果。更重要的是本研究探索了一種無血清培養(yǎng)體系，對于利用該細胞進行實驗過程中，實驗條件的精細化控制具有探索性意義。

最后，通過對所分離培養(yǎng)的NK細胞每天進行的檢測結果發(fā)現(xiàn)，利用我們建立的細胞誘導培養(yǎng)的方法可以使豬外周血淋巴細胞中具有NK細胞表型的細胞數(shù)量在第5天時達到巔峰，占總淋巴細胞的43.63%，較最初分離時NK細胞比例提升了5.59倍，而淋巴細胞總體數(shù)量也增長近8倍，因此，可利用此方法為體外細胞免疫試驗提供足夠量的NK細胞表型的細胞。NK細胞是固有免疫應答中一類十分重要的淋巴細胞，可通過選擇性識別、殺傷低表達MHCI類分子的腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞的生長和轉移，有效地清除腫瘤進而在機體抗腫瘤免疫和炎癥反應中發(fā)揮關鍵性作用。靜止NK細胞具有一定的殺傷活性，若NK細胞的有效活化，可顯著增強其對腫瘤細胞的殺傷作用。本研究嘗試了一種體外顯著提高豬NK細胞的誘導培養(yǎng)方法，可以為抗腫瘤免疫及其機制研究提供足夠量的效應細胞，也可以為病原微生物引起的體外細胞免疫和免疫逃逸研究提供良好的研究思路。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0288-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.014

Corresponding author：CHEN Hong-yan，E-mail：chenhongyan@caas.cn.

［基金項目］哈爾濱市科技平臺建設項目（編號：2014QA3BN002）。

［作者簡介］祝明皓（1990-），男，碩士研究生。研究方向：動物學。E-mail：15804635767@139.com

［通訊作者］陳洪巖（1963-），男，研究員。研究方向：實驗動物學。E-mail：chenhongyan@caas.cn.

［收稿日期］2016-02-23

Isolation，phenotype identification and activation of natural killer（NK）cells in Bama miniature pigs

ZHU Ming-hao1，2，LU Tao-feng2，NIU Yin-jie2，ZHAO Li-li2，CHEN Hong-yan2*
（1.Northeast Agricultural University，Harbin，150001，China；2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Harbin 150001，China）

【Abstract】Objective To describe the phenotype of NK cells in Bama miniature pigs，and establish an efficient activation and culture method for porcine cytokine-induced killer（CIK）cells in vitro.Methods The porcine peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were isolated by Percoll gradient centrifugation，and the phenotype of NK cells was tested by detecting the CD2+/CD8+/CD3-cell compartment.To establish an efficient activation and culture method for porcine CIK cells，we optimized the culture conditions to improve the CIK activation efficiency.Results Using the optimized induction culture conditions，the ratio of CIK（CD2+/CD8+/CD3-）cells was up to 43.63%at the fifth day，approximately 5.59 times increased compared with the initially separated PBMCs.Cell proliferation experiments showed that three obvious fluorescence peaks were observed on the fifth day.The results indicated that the induced CIK cells underwent three times cell division，in theory，about increased 8-fold compared with the initial separation of PBMCs.Furthermore，the qRT-PCR result of the surface markers of porcine NK cells also showed a similar variation tendency as the flow cytometry results.Conclusions Our findings demonstrate the successful establishment of an efficient activation and culture method for porcine CIK cells in vitro.

【Key words】Bama miniature pig；Natural killer cells；Cytokine-induced killer cells；Phenotype identification