他克莫司對大鼠肝臟組織蛋白磷酸酶2A和P-AKT表達的影響

牛玉堅，王德恩，楊柳，陳新國，王宏宇，徐春*

（1.武警總醫(yī)院器官移植科，北京 100039；2.武警總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100039）

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他克莫司對大鼠肝臟組織蛋白磷酸酶2A和P-AKT表達的影響

牛玉堅1，王德恩2，楊柳2，陳新國1，王宏宇2，徐春2*

（1.武警總醫(yī)院器官移植科，北京 100039；2.武警總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100039）

【摘要】目的 通過觀察他克莫司對大鼠血糖、胰島素水平、肝臟組織蛋白磷酸酶2A和磷酸化AKT表達的影響，進一步探究他克莫司導致血糖升高的機制。方法 將60只雄性SD大鼠（89.83±4.44）g隨機均分為2組，他克莫司組（n=40），每日空腹（禁食水8 h）灌胃給藥，劑量為4 mg/（kg·d）；對照組（n=20），每日空腹灌胃給予等量生理鹽水，每月測量大鼠體重、空腹血糖。5個月后處死大鼠，心臟穿刺取血，取胰腺組織和肝臟組織，測大鼠血清胰島素水平，行胰腺組織病理組織學觀察，并對肝臟行組織處理和免疫組織化學技術(shù)檢測肝細胞質(zhì)中蛋白磷酸酶2A和磷酸化AKT的表達。結(jié)果 用藥2個月后，他克莫司組大鼠的血糖水平明顯高于對照組（P＜0.05），他克莫司組大鼠的胰島素分泌指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)均明顯低于對照組（P＜0.05）；胰島素抵抗指數(shù)明顯增高（P＜0.05）。他克莫司組大鼠與對照組相比，其肝細胞質(zhì)內(nèi)PP2A表達明顯增加，磷酸化的AKT表達明顯減少。結(jié)論

他克莫司導致胰島細胞壞死，胰島細胞數(shù)量減少，胰島素的分泌降低、胰島素敏感性下降、胰島素抵抗增加，從而導致大鼠血糖升高。他克莫司增加大鼠肝臟組織PP2A的表達，減少肝臟組織磷酸化的AKT的表達，可能通過PI3K/ AKT信號轉(zhuǎn)導途徑參與胰島細胞凋亡和胰島素抵抗，引起血糖的升高。

【關(guān)鍵詞】移植后糖尿??；大鼠；他克莫司；磷酸化-AKT；蛋白磷酸酶2A

隨著科學技術(shù)以及醫(yī)療水平的不斷改進，合理選擇器官移植術(shù)后免疫抑制的治療方案是手術(shù)成功的重要環(huán)節(jié)，其中鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitors，CNI）的代表藥物為環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）和他克莫司（Tacrolimus），它們明顯減少排斥反應(yīng)的發(fā)生率，提高患者的存活率。隨著器官移植術(shù)后患者生存期延長和生活質(zhì)量的提高，與免疫抑制藥物相關(guān)的并發(fā)癥，尤其是移植后糖尿?。╬osttransplantation diabetes mellitus，PTDM）的發(fā)生越來越多地引起了人們的重視。大量臨床研究表明鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可導致移植后糖尿病的發(fā)生［1］，他克莫司比環(huán)抱素更容易導致PTDM［2］。他克莫司引起糖代謝異常的機制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司引起糖代謝異常的機制主要包括胰島素分泌減少和胰島素抵抗［3］，他克莫司通過誘導人類胰島β細胞凋亡［4］。大量研究證實，胰島細胞凋亡和胰島素抵抗與PI3K/AKT信號傳導通路密切相關(guān)，AKT處于PI3K/AKT信號傳導通路的中心位置。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是一種絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白磷酸酶，使蛋白質(zhì)Ser/Thr殘基脫磷酸化，PP2A使磷酸化Akt脫磷酸化而失去活性，因此是胰島素信號通路的負調(diào)節(jié)因子，PP2A的異常激活/高表達或異常低活性/低表達都將嚴重干擾胰島素信號通路。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶又稱蛋白磷酸酶2B（PP2B），是另一種類型的Ser/Thr磷酸酶，與PP2A同屬于磷酸化蛋白磷酸酶，它是一類Ca2+、鈣調(diào)素激活的蛋白磷酸酶。PP2B同樣也對p-Akt脫磷酸化，PP2B的脫磷酸化作用可以使p-Akt耗竭而影響它的核轉(zhuǎn)位，因此，PP2B與 PP2A共同影響著 Akt磷酸化水平［5］。由此推測：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑（PP2B抑制劑）他克莫司干擾了PP2A進而影響胰島素信號通路包括P-AKT脫磷酸化，導致糖代謝的異常。本研究試圖以PP2A為橋梁，探討鈣調(diào)神經(jīng)抑制劑他克莫司導致血糖升高的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠60只，體重（89.83±4.44）g。來源于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心【SCXK（軍）2014-003】，組織取材于武警總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心進行。

1.2 分組

將大鼠按隨機數(shù)字表法均分為兩組（他克莫司組和對照組），苦味酸染色標記。他克莫司組（40只），每日空腹（禁食、水8 h）灌胃給藥，劑量為4 mg/（kg·d）；對照組（20只），每日空腹灌胃給予等量生理鹽水，兩組大鼠均在用藥1 h后再行喂食。實驗過程中他克莫司組因灌胃損傷致死5只。

1.3 試劑

他克莫司膠囊、4%多聚甲醛、二甲苯、檸檬酸修復(fù)液、石蠟、蛋白甘油、蘇木素、伊紅、苦味酸、10%的水合氯醛、生理鹽水、蒸餾水、乙醇、免疫組化檢測盒、抗P-AKT抗體、抗PP2A抗體。血清胰島素放免檢測試劑盒。

1.4 數(shù)據(jù)測定

每月測量大鼠體重，斷尾取血，用快速干化學法測定空腹血糖。

每月末將他克莫司組在空腹狀態(tài)下處死隨機處死5只大鼠，心臟穿刺取血2 mL，并置于常溫凝固，以3000 r/min速度離心15 min后取血清，用化學發(fā)光法測定他克莫司血藥濃度。

用藥5個月后，全部大鼠在空腹狀態(tài)下處死，心臟穿刺取血2 mL，并置于常溫凝固，以3000 r/min速度離心15 min后取血清，采用放射免疫分析法測定血清胰島素（INS）水平，用化學發(fā)光法測定他克莫司血藥濃度。

1.5 胰腺組織的病理學檢查

1.5.1 制備石蠟切片

（1）將切塊的胰腺組織浸漬于4%多聚甲醛固定液中固定；（2）流水沖洗固定好的胰腺組織；（3）梯度乙醇脫水；（4）二甲苯透明胰腺組織；（5）浸蠟；（6）包埋；（7）切片。

1.5.2 染色

（1）貼片與烤片；（2）二甲苯透明劑切片脫蠟；（3）梯度乙醇水化；（4）染色；（5）梯度乙醇切片脫水；（6）透明和封片。

1.6 肝臟組織PP2A和P-AKT的表達

1.6.1 制備肝臟組織石蠟切片

過程同胰腺組織。

1.6.2 免疫組織化學檢測PP2A和P-AKT的表達

（1）貼片與烤片；（2）二甲苯透明劑切片脫蠟；（3）梯度乙醇水化；（4）蒸餾水洗5 min；（5）抗原修復(fù)；（6）蒸餾水洗5 min；（7）PBS洗3次，每次各5 min；（8）3%H2O2PBS溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min；（9）PBS洗3次，每次各5 min；（10）將一抗滴加，并置于37°C下孵育60 min。在實驗對照組中用PBS代替一抗，重復(fù)以上步驟；（11）PBS洗3次，每次各5 min；（12）將山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體滴加，并置于37°C下孵育40 min；（13）PBS洗3次，每次各5 min；（14）DAB顯色液顯色3 min，顯微鏡下控制反應(yīng)，并用自來水沖洗終止反應(yīng)；（15）Harris蘇木素液復(fù)染細胞核1 min；（16）切片脫水；（17）透明和封片；（18）鏡下觀察結(jié)果。

1.6.3 陽性標記的形態(tài)特征和判斷

免疫組化結(jié)果分析①將每一視野下陽性細胞按照百分比（%）分5成級。0分為：無陽性細胞為。1分為：陽性細胞≤10%。2分為：11% ～50%。3分為：51%～75%。4分為：＞75%。②將每個細胞的著色強度分為4級。0分為無色。1分為淡黃色。2分為棕黃色。3分為棕褐色。③標本的陽性細胞百分比積分乘以顏色的強度積分＞3分可確定為陽性。

1.7 統(tǒng)計學處理

利用空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）和空腹胰島素（fasting plasma insulin，F(xiàn)INS），穩(wěn)態(tài)模型法計算胰島素分泌指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin secretion，HOMA-β）值、胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）和胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）。ln為自然對數(shù)，胰島素單位為mU/L（1 mU/L=25 ng/mL），血糖單位為mmol/L。HOMA-β=20×FINS/（FBG-3.5）；ISI=ln（1/FBG×FINS）；HOMA-IR：FBG× FINS/22.5。數(shù)據(jù)均采用均值±標準差（±s）表示，使用 SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整合分析。（1）兩組大鼠的體重、血糖以及胰島素分泌指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)的比較采用獨立樣本T檢驗，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有顯著性；（2）兩組大鼠P-AKT表達強度結(jié)果比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重的比較

他克莫司組與對照組大鼠的體重均呈持續(xù)增長，在第1、2月時，兩組大鼠體重差異無顯著性（P ＞0.05），第3、4、5個月時，他克莫司組大鼠的體重明顯低于對照組，且兩者的差異有顯著性（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組大鼠血糖水平的比較

大鼠于空腹狀態(tài)行尾靜脈穿刺取血測定血糖水平。在用藥后第3個月末，他克莫司組大鼠血糖水平＞7.0 mmol/L，成功誘導出糖尿病。

表1 用藥期間每月末兩組大鼠體重的比較/gTab.1 Comparison of body weights between the two groups

他克莫司組大鼠血糖水平呈現(xiàn)明顯上升趨勢。在用藥第1、2個月，他克莫司組與對照組兩組的空腹血糖水平無顯著差異（P＞0.05）；第3、4、5月時，他克莫司組大鼠的空腹血糖水平明顯高于對照組，且差異有顯著性（P＜0.05）（見表2）。

表2 用藥期間每月末兩組大鼠血糖的比較（單位：mmol/L）Tab.2 Comparison of blood glucose levels between the two groups

2.3 大鼠他克莫司血藥濃度的測定

每月測定他克莫司組大鼠他克莫司的血藥濃度，濃度值維持在（8.59±0.59）ng/mL。

2.4 兩組大鼠胰島素分泌指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)的比較

用藥5個月后，于空腹狀態(tài)下處死全部大鼠，采用放射免疫分析法測定INS水平，結(jié)合空腹血糖分別計算兩組大鼠的胰島素分泌指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)。利用SPSS軟件分析示：他克莫司組大鼠的胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)均明顯低于對照組，且差有顯著性（P＜0.01），胰島素分泌指數(shù)也低于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）（見表3）。

表3 兩組大鼠胰島素敏感指數(shù)、分泌指數(shù)和抵抗指數(shù)的比較Tab.3 Comparison of HOMA-IR，HOMA-β and ISI of the two groups

2.5 大鼠胰腺病理學改變

用40倍光學顯微鏡觀察兩組大鼠胰腺病理切片：對照組大鼠胰腺導管清楚可見，腺泡細胞羅列整齊，細胞基底可見明顯的等大的細胞核，核仁清晰，胰島細胞染色較淺，染色均勻（見圖1）；他克莫司組大鼠胰腺導管不清，腺泡細胞羅列整齊，胰島細胞數(shù)量顯著減少，細胞胞質(zhì)內(nèi)存在多數(shù)不等的空泡，細胞核染色欠勻稱，部分細胞胞核消失，可見壞死細胞（見圖2）。

2.6 大鼠肝臟PP2A和P-AKT表達水平

他克莫司組大鼠肝臟標本中PP2A C陽性率為80%，對照組PP2A C陽性率為10%，χ2=17.0707 （P＜0.005），兩組差異有顯著性（圖3，4）。他克莫司組P-AKT的陽性率為10%，對照組為100%，χ2=32.727，P＜0.001，差異有顯著性（圖5，6）。

3 討論

本研究將他克莫司組的大鼠血液藥物濃度控制在6～10 μg/L之間，這是目前臨床維持免疫抑制作用最有效藥物濃度，我們觀察到他克莫司組大鼠空腹血糖水平上升，HOMA-IR上升，ISI下降，提示長期服用他克莫司可以引起血糖升高，胰島素分泌不足和胰島素抵抗同時存在于他克莫司引起的糖尿病模型中。這與我們以往的研究結(jié)果相同［6，7］。關(guān)于他克莫司引起胰島素分泌不足的機制已有很多研究，一致的觀點是：他克莫司對胰島β細胞具有直接損害，使胰島β細胞發(fā)生凋亡、胞質(zhì)空泡形成和壞死。他克莫司在轉(zhuǎn)錄水平抑制胰島素的合成，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制胰島素釋放。他克莫司導致胰島素抵抗的機制尚不清楚。導致機體發(fā)IR的原因有：肥胖、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、微量元素缺乏、丙型肝炎等。高脂飲食喂養(yǎng)的胰島素抵抗大鼠，其內(nèi)臟脂肪細胞的PP2A的表達明顯增加，PAKT和IRS-1明顯的減少［8］。眾多的研究發(fā)現(xiàn)在上述引起胰島素抵抗的情況下，均有 PP2A的參與［9-12］。本研究提示他克莫司引起肝臟組織中PP2A C表達水平的增加，說明PP2A在PP2B抑制劑（鈣調(diào)磷酸酶抑制劑）導致的糖代謝紊亂的過程中起一定的作用。

圖1 對照組大鼠胰腺的組織學形態(tài)（HE染色）Fig.1 Histology of the pancreas of a control rat.HE staining

圖2 他克莫斯組大鼠胰腺的病理學改變（HE染色）Fig.2 Pathological changes of the pancreas in a tacrolimus-treated rat（HE staining）

圖3 對照組大鼠肝臟組織PP2A的表達（SP免疫組化染色）Fig.3 Expression of PP2A in a control rat liver tissue.

圖4 對照組大鼠肝臟組織PP2A的表達（SP免疫組化染色）Fig.4 Expression of PP2A in a control rat liver tissue. Immunohistochemical SP staining.

圖5 對照組大鼠肝臟組織P-AKT的表達（SP免疫組化染色）Fig.5 Expression of P-AKT in a control rat liver tissue. Immunohistochemical SP staining.

圖6 他克莫斯組大鼠肝臟組織P-AKT的表達（SP免疫組化染色）Fig.6 Expression of P-AKT in a tacrolimus-treated rat liver tissue.Immunohistochemical SP staining.

PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路是脂肪、肝臟、骨骼肌等胰島素靶組織維持正常糖代謝的重要調(diào)節(jié)通路，絲/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）與IR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］，且在胰島β細胞的生存和復(fù)制過程中至關(guān)重要［14］。研究證實，AKT通過多種方式來發(fā)揮調(diào)控血糖的作用。（1）與胰島β細胞凋亡的關(guān)系。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路作為胰島素的主要下游分子通路，它具有抗凋亡和促凋亡的雙重調(diào)節(jié)作用，其中以抗細胞凋亡作用為主［15］。（2）與胰島素抵抗的關(guān)系。在IR狀態(tài)時，胰島素刺激對PI3K/AKT信號傳導通路的作用明顯下調(diào)［16］。Joanne等研究敲除AKT2基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)其肝臟和骨骼肌等胰島素靶器官對胰島素的反應(yīng)較正常小鼠存在不同程度的減弱，提示了AKT2是正常糖代謝平衡所必需的基因［17］。（3）與胰島素分泌的關(guān)系。對剔除胰島素受體的大鼠給予葡萄糖刺激，發(fā)現(xiàn)大鼠無法做出有效應(yīng)答，隨著大鼠的年齡增長，胰島體積、β細胞數(shù)量和胰島素分泌水平同時降低。由此可見，AKT在調(diào)節(jié)血糖水平的過程中至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)他克莫司組大鼠肝臟組織磷酸化AKT表達明顯受到抑制。試驗推斷，他克莫司可能是通過促進PP2A的表達，使AKT去磷酸化失活，從而阻斷胰島素信號通路（PI3K/AKT信號傳導通路），導致高血糖的發(fā)生。

他克莫司導致胰島細胞壞死、空泡樣變，減少胰島素的分泌、降低胰島素敏感性、增加胰島素抵抗，導致大鼠血糖升高。他克莫司導致大鼠肝臟PP2A的表達，使AKT去磷酸化而失活，阻斷PI3K/AKT信號的轉(zhuǎn)導，導致胰島細胞凋亡和胰島素抵抗的發(fā)生。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0262-06

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.009

［基金項目］武警總醫(yī)院科研項目（編號：WZ20130104）。

［作者簡介］牛玉堅（1966-），男，主任醫(yī)師，專業(yè)：器官移植。Email：niuyujian@aliyun.com

［通訊作者］徐春（1967-），女，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，專業(yè)：內(nèi)分泌代謝疾病。Email：wjxuchun@sina.comicantly higher than that in the control group P＜0.05）.ISI was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Immunohistochemical examination showed that the expression of PP2A in hepatocytes in the tacrolimus group was increased compared with the control group，while expression of P-AKT in hepatocytes of the tacrolimus group was decreased than that in the control group.Conclusions Tacrolimus can induce necrosis of islet cells，decrease of the amount of islet cells and insulin secretion，decease of sensitivity to insulin，and increase the resistance to insulin，therefore，leading to increase the blood glucose level in rats.The expression of PP2A in hepatocytes in the tacrolimus group is increased，while the expression of P-AKT is decreased.Interfering of insulin signal transduction pathways may be involved in the hyperglycemic effects of tacrolimus.

Corresponding author：XU Chun，Email：wjxuchun@sina.com

［收稿日期］2016-01-06

Effects of tacrolimus on the expression of protein phosphatase 2A and P-AKT in rat hepatocytes

NIU Yu-jian1，WANG De-en2，YANG Liu2，CHEN Xin-guo1，WANG Hong-yu2，XU Chun2*
（1.Department of Organ Transplantation，2.Department of Endocrinology，the General Hospital of the Armed Police Forces，Beijing 100039，China）

【Abstract】Objective To observe the effects of tacrolimus on blood glucose，insulin，expressions of protein phosphatase 2A and P-AKT in rats in order to explore the mechanism of hyperglycemic action of tacrolimus.Methods Sixty male SD rats（body weight 89.83±4.44 g）were randomly divided into tacrolimus group（n=40）and control group（n =20）.The rats in the tacrolimus group were administrated with tacrolimus 4 mg/kg daily.The rats in the control group were given the same amount of normal drinking water daily.The rat body weight，fasting blood glucose concentration and blood concentration of tacrolimus were measured monthly.All rats were killed at 5 months after the tacrolimus administration.The serum insulin levels were detected by radioimmunoassay method.The expressions of PP2A and P-AKT in liver tissues were assessed by immunohistochemistry.Results After two months of administration，the blood glucose levels in the tacrolimus group were significantly higher than those in the control group.The HOMA-IR in tacrolimus group was signif-

【Key words】Post-transplantation diabetes mellitus；Rat；Tacrolimus；P-AKT；Phosphatase 2A