補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達(dá)及血-腦脊液屏障通透性的影響研究

劉紹晨，吳曉光，楊 嵐，李義學(xué)，仇志富

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補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達(dá)及血-腦脊液屏障通透性的影響研究

劉紹晨，吳曉光，楊 嵐，李義學(xué)，仇志富

目的探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)及血-腦脊液屏障通透性的影響。方法2014年3月—2015年11月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將成年雄性SPF級(jí)SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組，各24只。其中模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組制備腦出血模型。造模后第2天起，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯，藥量分別為13.2、26.5、53.0 g·kg-1·d-1，連續(xù)給藥14 d，假手術(shù)組及模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)磷酸化肌醇磷脂3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)表達(dá)水平，免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)AQP4表達(dá)水平，干濕重法檢測(cè)腦組織含水量，甲酰胺法檢測(cè)血-腦脊液屏障通透性〔以依文思藍(lán)(EB)含量表示〕。結(jié)果假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組PI3K、AKT表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組PI3K表達(dá)水平高于模型組；補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AKT表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)。5組AQP4表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.79，P<0.001)；其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AQP4表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)。5組腦組織含水量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.21，P<0.001)；其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組腦組織含水量低于模型組(P<0.05)。5組腦組織EB含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.05，P<0.001)；其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組腦組織EB含量低于模型組(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠減輕腦出血誘發(fā)的腦水腫，其機(jī)制可能與其激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控AQP4極性表達(dá)，降低血-腦脊液屏障通透性有關(guān)。

腦出血；補(bǔ)陽(yáng)還五湯；腦水腫；水通道蛋白質(zhì)4；血腦屏障

劉紹晨，吳曉光，楊嵐，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達(dá)及血-腦脊液屏障通透性的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(21)：2557-2561.[www.chinagp.net]

LIU S C，WU X G，YANG L，et al.Effects of Buyanghuanwu decoction on aquaporin 4 expression and the permeability of the blood brain barrier in cerebral hemorrhage rats[J].Chinese General Practice，2016，19(21)：2557-2561.

腦出血占所有腦卒中的10%～15%，具有高發(fā)病率、高致殘率及高病死率，是最嚴(yán)重的一種腦卒中類型，目前尚無(wú)較好的方法提高腦出血患者的生存率或改善其生活質(zhì)量[1]。研究表明，腦出血后繼發(fā)性損傷在患者神經(jīng)功能惡化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而腦出血后腦水腫則是繼發(fā)性損傷中的重要環(huán)節(jié)之一[2]。水通道蛋白4(AQP4)是水通道蛋白家族(AQPs)在腦組織中含量最豐富、分布最廣泛、功能最重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)腦出血時(shí)腦組織中存在AQP4極性表達(dá)的缺失，促進(jìn)出血性腦水腫的發(fā)生[3]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是一種臨床上治療缺血性腦卒中的常用方藥，具有增強(qiáng)微血管抗損傷能力，減輕腦缺血誘發(fā)的腦組織水腫等作用[4]，但是其抑制腦水腫作用的具體機(jī)制仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織中磷酸化肌醇磷脂3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后能夠介導(dǎo)或者調(diào)控與凋亡、水腫密切相關(guān)的蛋白或基因等發(fā)生相應(yīng)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用，而其發(fā)揮顯著效應(yīng)的前提是藥物能夠降低血-腦脊液屏障通透性[3]。本研究采用Rosenberg法建立大鼠腦出血模型，檢測(cè)PI3K、AKT、AQP4表達(dá)水平的變化，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠腦組織水腫及血-腦脊液屏障通透性的影響及其作用機(jī)制。

本研究背景：

腦出血屬于中醫(yī)學(xué)“卒中”“薄厥”“中風(fēng)”范疇，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，是腦卒中中最為嚴(yán)重的一種。腦出血后繼發(fā)腦水腫是患者神經(jīng)功能惡化的重要影響因素。從機(jī)制上講，出血性疾病要慎用活血祛癖之藥，而腦出血雖為出血性疾病，但《血證論》云:“既是離經(jīng)之血，雖清血、鮮血亦是癖血”“總以祛癖為要”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，某些活血化癖藥具有加速和促進(jìn)血腫溶化和吸收，以解除腦受壓的作用。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是益氣活血的代表方，希望能為“活血化瘀藥”應(yīng)用腦出血治療，加速和促進(jìn)血腫溶化和吸收，解除腦受壓的程度提供新思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SPF級(jí)SD大鼠120只，體質(zhì)量230～250 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組，每組24只。大鼠在室溫26～28 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，自然光照。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑補(bǔ)陽(yáng)還五湯由生黃芪120.0 g、當(dāng)歸尾6.0 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龍3.0 g、桃仁3.0 g、紅花3.0 g組成，購(gòu)自承德大藥房，通過(guò)水煎醇沉法制備成濃度為5.3 g/ml的水煎醇沉物。兔抗大鼠PI3K、AKT多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司；兔抗大鼠AQP4單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3動(dòng)物模型制備及給藥2014年3月—2015年11月在承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所完成本實(shí)驗(yàn)，參照LIEW等[2]方法制備大鼠腦出血模型，SD大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，取俯臥位固定于鼠腦立體定位儀上，局部消毒后，切開大鼠皮膚，使其暴露顱骨，進(jìn)行鉆孔，在大鼠的前囪后方約1.4 mm，右旁開約3.2 mm處垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度約為5.6 mm，可在近內(nèi)囊的蒼白球內(nèi)進(jìn)行定位，定位之后用微量進(jìn)樣器緩慢注入0.5 μl膠原酶滅菌的0.9%氯化鈉溶液2.5 μl，注射時(shí)間約2 min，留針約5 min，退針約0.5 mm，再留針約5 min，慢慢拔出針頭，骨蠟封閉骨窗，皮膚縫合。造模成功的評(píng)價(jià)方法：對(duì)手術(shù)后清醒的造模SD大鼠，按照Z(yǔ)eal Longa 5級(jí)評(píng)分法判斷腦出血模型制備是否成功。0分：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀出現(xiàn)，一切活動(dòng)均正常；1分：SD大鼠在接受提尾懸空動(dòng)作時(shí)，腦出血對(duì)側(cè)前肢不自主的出現(xiàn)屈曲、抬高等動(dòng)作，并且伴隨著肩內(nèi)收、肘關(guān)節(jié)伸直等表現(xiàn)，此時(shí)為輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷癥狀；2分：SD大鼠在具有輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷癥狀表現(xiàn)的同時(shí)，又伴隨行走時(shí)向腦出血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，稱為中度局灶性神經(jīng)功能缺陷癥狀；3分：SD大鼠在行走時(shí)其身體會(huì)向腦出血對(duì)側(cè)傾倒，稱為重度局灶性神經(jīng)功能缺陷癥狀；4分：行走極度困難，甚至無(wú)意識(shí)。1～3分為腦出血模型造模成功大鼠。假手術(shù)組只在相應(yīng)位置鉆孔，插入注射器，留針10 min，不注射任何物質(zhì)。造模后第2天起，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯，藥量分別為13.2、26.5、53.0 g·kg-1·d-1，連續(xù)給藥14 d，假手術(shù)組及模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4PI3K、AKT表達(dá)水平檢測(cè)采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取6只大鼠注射3.5 mg/kg水合氯醛溶液麻醉，4%多聚甲醛溶液左心室插管灌注固定，取視交叉至大腦裂之間腦組織，常規(guī)石蠟包埋。Leica切片機(jī)連續(xù)5 μm冠狀切片。常規(guī)脫蠟、梯度乙醇浸水，枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，山羊血清封閉，腦切片上分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多克隆抗體，4 ℃靜置12 h，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。利用磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對(duì)照。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算400倍鏡下血腫灶周圍3個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5AQP4表達(dá)水平檢測(cè)采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取6只大鼠斷頭取血腫周圍腦組織，0.01 mol/L PBS洗凈血液，加入裂解液和10 μl苯甲基硫酰氟(PMSF)(10 g/L)，4 ℃勻漿，以10 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液，BCA法蛋白定量。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加AQP4一抗(1∶200)，4 ℃冰箱過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37 ℃溫箱孵育1 h，熒光發(fā)光液發(fā)光，X線膠片曝光顯影后，利用Quantity One軟件對(duì)X線膠片上AQP4表達(dá)的灰度值進(jìn)行分析。

1.6腦組織含水量檢測(cè)采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取6只大鼠斷頭、取出血側(cè)腦組織于分析天平稱濕重，再置于100 ℃真空干燥箱烘干24 h，再稱干重。腦組織含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.7血-腦脊液屏障通透性檢測(cè)每組剩余6只大鼠乙醚麻醉，由尾靜脈注入4 ml/kg 2%伊文思藍(lán)(EB)溶液。參照文獻(xiàn)[5]的方法計(jì)算腦組織EB含量。EB含量升高，表明血-腦脊液屏障通透性增強(qiáng)。

2　結(jié)果

2.1各組PI3K、AKT表達(dá)水平比較PI3K和AKT陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色顆粒樣物質(zhì)，均位于細(xì)胞的胞質(zhì)(見(jiàn)圖1、2，本文圖1、2彩圖詳見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組PI3K、AKT表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組PI3K表達(dá)水平高于假手術(shù)組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組PI3K表達(dá)水平高于模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組PI3K表達(dá)水平高于補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AKT表達(dá)水平高于假手術(shù)組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AKT表達(dá)水平均分別高于模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2各組AQP4表達(dá)水平比較假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AQP4表達(dá)水平分別為(0.12±0.01)%、(0.22±0.01)%、(0.27±0.02)%、(0.27±0.02)%、(0.28±0.02)%。5組AQP4表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.79，P<0.001)；其中模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AQP4表達(dá)水平高于假手術(shù)組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組AQP4表達(dá)水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Table 1Comparison of the expression of PI3K and AKT among five groups

組別只數(shù)PI3KAKT假手術(shù)組65.8±0.95.5±1.1模型組68.8±1.4a8.3±1.9補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組611.2±1.4ab9.9±2.4a補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組612.6±1.8ab13.2±2.6abc補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組15.8±2.1abcd15.8±2.7abcF值31.3021.10P值<0.001<0.001

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組比較，cP<0.05；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組比較，dP<0.05；PI3K=磷酸化肌醇磷脂3激酶，AKT=蛋白激酶B

圖1　各組PI3K表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果(SABC法，×400)

圖2　各組AKT表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果(SABC法，×400)

2.3各組腦組織含水量比較假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組大鼠腦組織含水量分別為(60.0±2.6)%、(78.9±5.4)%、(73.7±4.5)%、(72.7±4.5)%、(69.9±3.7)%。5組腦組織含水量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.21，P<0.001)；其中模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組腦組織含水量高于假手術(shù)組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組腦組織含水量低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組腦組織EB含量比較假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組大鼠腦組織EB含量分別為(1.4±1.0)、(17.0±3.1)、(14.2±1.9)、(12.2±1.6)、(11.7±1.2) μg/g。5組腦組織EB含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.05，P<0.001)；其中模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組腦組織EB含量高于假手術(shù)組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組腦組織EB含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

PI3K/AKT是一種促細(xì)胞存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腦缺血的病理過(guò)程，與神經(jīng)元的存活密切相關(guān)[6]。腦出血后，機(jī)體可以釋放出一些能夠?qū)⒕哂欣野彼峒っ富钚缘氖荏w激活的物質(zhì)，如神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、整合素等，受體磷酸化后會(huì)特異性結(jié)合PI3K的調(diào)節(jié)亞基，從而將PI3K激活；同時(shí)兼?zhèn)渲惣っ富钚耘c蛋白激酶活性的PI3K激活后可以使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，生成第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[7]。PI3K與其下游效應(yīng)分子AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKT由抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，進(jìn)而通過(guò)直接將其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者間接改變編碼凋亡相關(guān)蛋白的基因表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用[6，8]?？傊?，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后，能夠作用于Bcl-2、BAX、Caspase-3、核因子(NF)-κB等下游凋亡靶蛋白，通過(guò)激活或抑制其表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯組PI3K、AKT表達(dá)水平高于模型組，與蔡俊等[9]在補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠的影響研究中所得結(jié)果一致，提示腦出血中補(bǔ)陽(yáng)還五湯發(fā)揮抑制腦水腫的腦保護(hù)效果與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活密不可分。

AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞足突形成的膠質(zhì)界膜和血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞表面以及滲透壓感受區(qū)有豐富的特異性表達(dá)，是膠質(zhì)細(xì)胞與血管之間水的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[3]，在維持大腦水平衡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。也就是說(shuō)，AQP4只有極性表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上時(shí)，才能夠正確發(fā)揮其調(diào)控水轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[10]。腦出血時(shí)腦組織中存在AQP4極性表達(dá)缺失，促進(jìn)出血性腦水腫的發(fā)生[3]。而AQP4的水通透性可以被多種蛋白可逆磷酸化調(diào)控[11]。以往研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)AQP3的表達(dá)，而AQP3與AQP4同屬于AQPs亞族，兩者結(jié)構(gòu)有許多相似之處，且兩者均在腦組織內(nèi)高度表達(dá)[12-13]，由此推測(cè)，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)而在腦出血所致的腦水腫中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組大鼠AQP4表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，腦組織含水量降低，血-腦脊液屏障通透性降低，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活實(shí)現(xiàn)了對(duì)AQP4表達(dá)的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)減輕腦水腫，降低血-腦脊液屏障通透性，保護(hù)腦組織的作用。

因此，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血具有較好的治療作用，其機(jī)制可能與其激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并通過(guò)該通路調(diào)控腦組織密切相關(guān)蛋白AQP4，使其發(fā)生極性表達(dá)，進(jìn)而降低血-腦脊液屏障通透性，從而實(shí)現(xiàn)減輕腦組織水腫，保護(hù)神經(jīng)功能的作用。

作者貢獻(xiàn)：劉紹晨、吳曉光、李義學(xué)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；劉紹晨、楊嵐、李義學(xué)、仇志富進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；吳曉光進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Effects of Buyanghuanwu Decoction on Aquaporin 4 Expression and the Permeability of the Blood Brain Barrier in Cerebral Hemorrhage Rats

LIUShao-chen，WUXiao-guang，YANGLan，etal.

DepartmentofPathology，ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China

ObjectiveTo explore the effects of Buyanghuanwu decoction on aquaporin 4(AQP4)expression and the permeability of the blood brain barrier in cerebral hemorrhage rats.MethodsFrom March 2014 to November 2015，SPF level adult male SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups，24 in each group.Model group and Buyanghuanwu decoction groups prepared models of cerebral hemorrhage.Since two days after modeling，Buyanghuanwu decoction low，medium，and high dose groups were given Buyanghuanwu decoction by gastric perfusion，the dose was 13.2 g·kg-1·d-1，26.5 g·kg-1·d-1and 53.0 g·kg-1·d-1respectively，continuously for 14 days，and sham operation group and model group were given the equal volume of the corresponding 0.9% sodium chloride solution.The expression of phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)and protein kinase B(AKT)was detected by immunohistochemistry.The expression of AQP4 was detected by immunofluorescence labeling method.Content of water in brain was detected by wet and dry weight method，and formamide method was used to detect the blood-brain barrier permeability.ResultsSham operation group，model group，Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were significantly different in the expression of PI3K and AKT(P<0.05)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were higher than model group in the expression of PI3K；Buyanghuanwu decoction medium and high dose groups were higher than model group in the expression of AKT(P<0.05).The 5 groups were significantly different in the expression of AQP4(F=95.79，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were higher than model group in the expression of AQP4(P<0.05).The 5 groups were significantly different in brain water content(F=16.21，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction high dose group was lower than model group in brain water content(P<0.05).The 5 groups were significantly different in the EB content of cerebral tissue(F=60.05，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were lower than model group in EB content of cerebral tissue(P<0.05).ConclusionBuyanghuanwu decoction can alleviate encephaledema induced by cerebral hemorrhage，and its mechanism may be related with the activation of PI3K/AKT singal，the regulation of the extreme expression of AQP4，and the reduction of blood-brain barrier permeability.

Cerebral hemorrhage；Buyanghuanwu decoction；Brain edema；Aquaporin 4；Blood-brain barrier

河北省高等學(xué)校重點(diǎn)學(xué)科病理學(xué)與病理生理學(xué)資助項(xiàng)目(2013)；河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室資助項(xiàng)目(2014)；承德醫(yī)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)資助項(xiàng)目(201607)

067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(劉紹晨)；承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室(吳曉光，楊嵐，仇志富)；承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(李義學(xué))

吳曉光，067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室；E-mail：ewxg@qq.com

R 743.34 R 742

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.21.013

2016-01-20；

2016-05-19)