新生兒缺氧缺血腦損傷大鼠模型的制備

龐 煒，曹帥帥，李樹(shù)祎，田雨光，顧為望

（1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515；2.廣州醫(yī)科大學(xué)口腔教研室，廣州 510182）

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新生兒缺氧缺血腦損傷大鼠模型的制備

龐 煒1，曹帥帥2，李樹(shù)祎2，田雨光1，顧為望1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515；2.廣州醫(yī)科大學(xué)口腔教研室，廣州 510182）

【摘要】目的 在高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)內(nèi)，模擬新生兒在高原環(huán)境下缺氧缺血腦損傷的過(guò)程，制備不同海拔高度下高原腦損傷大鼠模型。方法 10日齡的SD新生大鼠32只，隨機(jī)分為4組，即A組（對(duì)照組）和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：B組（2 000 m組）、C組（4 000 m組）、D組（6 000 m組）。對(duì)照組大鼠在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠置于高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)結(jié)合運(yùn)動(dòng)的方法制作新生兒高原腦缺氧缺血模型，運(yùn)動(dòng)方式為在艙內(nèi)游泳槽進(jìn)行60 min/d的游泳運(yùn)動(dòng)，且在高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)內(nèi)生活時(shí)間每天不得少于20 h。每組大鼠分別在第3、7、11、15天用Zea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分并且于第15天采集靜脈血，在掃描電鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。每組處死后取腦組織進(jìn)行HE染色和TTC染色。結(jié)果 （1）神經(jīng)病學(xué)評(píng)分：實(shí)驗(yàn)組B組、C組、D組行為學(xué)評(píng)分與對(duì)照組大鼠相比，行為學(xué)評(píng)分差異顯著（P＜0.05），D組與對(duì)照組相比差異非常顯著（P＜0.01）。（2）HE染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組大鼠相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠均有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度與海拔高度成正相關(guān)。（3）TTC染色表明：在高原環(huán)境下大鼠的大腦皮質(zhì)缺血明顯。（4）電鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)顯示：實(shí)驗(yàn)組B組呈帽狀結(jié)構(gòu)；C組呈不規(guī)則形；D組呈鋸齒狀。結(jié)論 本研究采用高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)結(jié)合運(yùn)動(dòng)模擬高原環(huán)境制作新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）的模型，該模型穩(wěn)定、可靠，比其他方法更符合缺血缺氧腦損傷的發(fā)病機(jī)理，與臨床貼近，可用于相關(guān)研究。

【關(guān)鍵詞】新生兒腦缺氧缺血性腦??；TTC染色；掃描電鏡；大鼠

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage.HIBD）是因腦組織部分或完全缺氧、腦血流量減少或暫停導(dǎo)致的腦損傷，最終可造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。其中一種高發(fā)病人群為新生兒，稱為新生兒缺氧缺血性腦病 （hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）［1-3］。是指圍產(chǎn)期窒息缺氧所引起的腦損傷，嚴(yán)重者可造成永久性神經(jīng)功能損害，是兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷的常見(jiàn)原因之一。重度HIE患兒即使存活下來(lái)，也常患有腦癱、智力障礙、癲癇等嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［4，5］。目前臨床上對(duì)于HIE的治療主要局限于護(hù)理及支持療法。長(zhǎng)期以來(lái)，研究和開(kāi)發(fā)有效的治療HIE藥物，是新生兒科醫(yī)學(xué)研究的重要任務(wù)。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞在胚胎和成年個(gè)體神經(jīng)系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)以及體外培養(yǎng)成功為缺氧缺血性腦病的細(xì)胞移植治療和基因治療，提供了新的方法［6，7］。在了解這些治療方案療效及其作用機(jī)制的研究中，HIE動(dòng)物模型起到了非常重要的作用。在高原地區(qū)，大氣氧分壓較低，由于高原低氧的影響，新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）在高原地區(qū)發(fā)病率比較高［8］。本實(shí)驗(yàn)采用高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)結(jié)合大鼠游泳運(yùn)動(dòng)的方法建立在高原地區(qū)新生兒缺氧缺血性腦病模型，觀察其行為學(xué)、腦組織病理變化、腦TTC染色和紅細(xì)胞，為HIE在高原地區(qū)的臨床研究做基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：10日齡的SPF級(jí)SD新生大鼠32只，體重為30～50 g，雄性，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK（粵）2011-0015】，使用許可證號(hào)：【SYXK（粵）2011-0074】，飼養(yǎng)條件為屏障環(huán)境，室溫（20～26）℃，光照控制12 h（7：00 a.m.～7：00 p.m.），自由采食飲水。

1.1.2 試劑與設(shè)備：高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng) LT/ ACR-2002（北京易盛泰和科技有限公司）；掃描電鏡Hitachi型號(hào) S-3400N（日本日立公司）；TTC染料（南京奧多福尼生物科技有限公司）

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：32只10日齡SD大鼠，編號(hào)后，隨機(jī)分成4組，即：對(duì)照組（A組）、2 000 m海拔高原組（B組）、4 000 m海拔高原組（C組）和6 000 m海拔高原組（D組），每組8只。對(duì)照組（A組）大鼠在屏障環(huán)境正常飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠在高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)生活和運(yùn)動(dòng)15 d（溫度：（26±2）℃；濕度：45%±5%RH；正常晝夜節(jié)律）運(yùn)動(dòng)方式為在艙內(nèi)游泳槽進(jìn)行60 min/d的游泳運(yùn)動(dòng)，大鼠不能以尾部支持底部得到休息，水溫為 30℃，水深為鼠尾長(zhǎng)1.5倍。實(shí)驗(yàn)組大鼠在高原低壓環(huán)境模擬倉(cāng)內(nèi)生活時(shí)間每天不得少于20 h（其余時(shí)間為換水、加飼料、清潔）［9-11］。

1.2.2 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分：依次在第3、7、11、15天取出對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠，進(jìn)行Zea Longa 5分制行為學(xué)評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2分，行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，走路不穩(wěn)，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失［12］。

1.2.3 HE染色：在第15天從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別取出4只新生鼠，以3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板上，剪開(kāi)胸腔，暴露出心臟，先用手術(shù)剪剪開(kāi)右心耳，再用1 mL注射器進(jìn)入左心室插進(jìn)主動(dòng)脈，先灌注生理鹽水150 mL左右，再灌注10%多聚甲醛400 mL左右，斷頭取出全腦。置于40 g/L多聚甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、冠狀切片，厚4 μm，制作常規(guī)病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。HE染色切片制作流程如下：（1）切片入二甲苯2次，每次20 min，以脫去石蠟；（2）入100%、95%、85%的酒精，每次10～15 min；（3）入蘇木精染液染色5min：（4）用自來(lái)水洗去多余的染液；（5）入鹽酸酒精約10 s分色，至細(xì)胞核著色較深，其它結(jié)構(gòu)無(wú)色時(shí)為宜；（6）自來(lái)水緩洗10 min，使蘇木精“藍(lán)化”，胞核呈藍(lán)色；（7）入1%伊紅染液染色約2 min；（8）用蒸餾水洗去多余的伊紅；（9）經(jīng)濃度遞增的酒精脫水；（10）入100%酒精脫水2次，每次約 l0 min；（11）入二甲苯透明2次，每次約15min；（12）擦去載玻片上多余的二甲苯，在切片上滴中性樹(shù)膠1 ～2滴，加蓋玻片封片，干燥環(huán)境保存，鏡下觀察、拍照［13］。

1.2.4 TTC染色：在第15天從A、B、C、D 4組中各取出剩余4只新生大鼠，采用頸椎脫臼發(fā)處死，小心快速取出全腦，置-20℃冰箱冷凍20 min，取出用刀片切片，第1刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與后葉尾極之間，切成五六片，每隔2 mm切一片。將切片置于1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）用錫箔紙蓋住后，放入37℃水浴鍋中避光染色10～30 min，不時(shí)翻動(dòng)腦片，使均勻接觸到染色液，染色后進(jìn)行拍照，觀察腦組織［14］：未缺血壞死區(qū)顏色呈淡紅色，已缺血壞死組織呈白色。

1.2.5 掃描電鏡：在第15天取對(duì)照組和模擬組共32只大鼠，采靜脈血1～2滴直接滴5 mL新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液中，輕輕振蕩后靜置于4℃冰箱中半小時(shí)以上，取適量已固定好血樣于1.5 mL離心管，低速離心（1 500 r/min）去上清液，0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%、100%酒精（2次）脫水，每次都需低速離心（1 500 r/min），最后滴于預(yù)先覆有 Formvar膜的潔凈蓋玻片上，室溫自然干燥［15］。3 d后用雙面膠帶將干燥后的蓋玻片粘貼在樣品臺(tái)上，SUPER CT-2000離子濺射儀噴金，Hitachi S-3400N掃描電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分

對(duì)照組行為學(xué)均正常，在行為學(xué)評(píng)分中為0分，而實(shí)驗(yàn)組大鼠行為學(xué)異常，主要表現(xiàn)為一側(cè)肢體感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能障礙和平衡功能的異常。實(shí)驗(yàn)組大鼠評(píng)分隨海拔升高而升高，行為異常程度與海拔高度呈正相關(guān)。并且實(shí)驗(yàn)組大鼠在第3、7、11、15天行為學(xué)評(píng)分逐漸升高（表1），這一數(shù)據(jù)表明在高原環(huán)境下缺氧時(shí)間越長(zhǎng)腦損害越嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)表明對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組差異有顯著性意義（P＜0.05）海拔6000 m組與對(duì)照組比較差異非常顯著（P＜0.01）（圖1）。

圖1 不同海拔高度下新生大鼠神經(jīng)病學(xué)評(píng)分Fig.1 Neurological scores of the neonatal rats treated by different altitude hypoxia

2.2 腦組織病理學(xué)改變

對(duì)照組腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大小、外形正常，未出現(xiàn)腦水腫；在海拔2 000 m大腦皮質(zhì)輕度萎縮，神經(jīng)元細(xì)胞輕度水腫，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生；在海拔4 000 m大腦皮質(zhì)中度萎縮，神經(jīng)元細(xì)胞中度水腫，膠質(zhì)細(xì)胞中度增生；在海拔6 000 m室管膜細(xì)胞重度水腫（圖2）。

2.3 TTC染色結(jié)果

TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感復(fù)合物，它是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會(huì)產(chǎn)生變化呈蒼白［16］。對(duì)照組TTC染色結(jié)果為紅色，未出現(xiàn)缺血缺氧表現(xiàn)；海拔2 000 m出現(xiàn)輕度改變，大腦皮質(zhì)出現(xiàn)小片蒼白；海拔4 000 m大腦皮質(zhì)區(qū)可明顯看見(jiàn)蒼白區(qū)域；海拔6000 m接近一半出現(xiàn)蒼白區(qū)（圖3）。利用Image-Pro Plus做出海拔2 000 m組腦缺氧面積為26.6%，海拔4 000 m組腦缺氧面積為 34.3%，海拔 6 000 m組腦缺氧面積為56.6%，而對(duì)照組則為正常。

2.4 電鏡下紅細(xì)胞

在掃描電鏡下可以看見(jiàn)對(duì)照組紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀，在海拔2 000 m下電鏡表現(xiàn)為輕度改變呈帽狀結(jié)構(gòu)；在海拔4 000 m下表現(xiàn)為不規(guī)則形；在海拔6 000 m下表現(xiàn)為鋸齒狀，部分紅細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)空洞，崩解（圖4）。

3 討論

表1 不同海拔高度下新生大鼠神經(jīng)病學(xué)評(píng)分Tab.1 Neurological scores of the neonatal rats treated by different altitude hypoxia

A組為對(duì)照組；B組為2 000 m組，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生；C組為4 000 m組，膠質(zhì)細(xì)胞中度增生；D組為6 000 m組，室管膜細(xì)胞重度水腫圖2 不同海拔下新生大鼠腦病理HE染色切片（×400）Note.A is the control group.B is the 2 000 m group，showing mild hyperplasia of glial cells.C is the 4 000 m group，showing moderate hyperplasia of glial cells.D is the 6 000 m group，showing severe edema of ependymal cells.Fig.2 Histological changes of the neonatal rat brain tissues treated by different altitude hypoxia.HE staining.×400

A組為對(duì)照組；B組為2 000 m組，大腦皮質(zhì)出現(xiàn)小片蒼白；C組為4 000 m組，大腦皮質(zhì)蒼白區(qū)明顯；D組為6 000 m組，大腦皮質(zhì)近一半出現(xiàn)蒼白圖3 不同海拔下新生大鼠腦切片TTC染色Note.A is the control group.B is the 2 000 m group，showing small pale areas of cerebral cortex.C is the 4 000 m group，showing more distinct pale area of cerebral cortex.D is the 6 000 m group，showing nearly half of the cerebral cortex became pale.Fig.3 Gross appearance of the brains of neonatal rats，treated by different altitude hypoxia.TTC staining

A組為對(duì)照組；B組為2 000 m組呈帽狀結(jié)構(gòu)；C組為4 000 m組呈不規(guī)則形；D組為6 000 m組呈鋸齒狀圖4 不同海拔下新生大鼠電鏡下紅細(xì)胞（×10 000）Note.A is the control group.B is the 2 000 m group，showing cap-like shape.C is the 4 000 m group，showing irregular shape.D is the 6 000 m group showing zigzag shape.Fig.4 Scanning electron microscopic appearance of erythrocytes of the neonatal rats treated by different altitude hypoxia.×10 000

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是指圍產(chǎn)期窒息缺氧所引起的腦損傷，嚴(yán)重者可造成永久性神經(jīng)功能損害，是兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷的常見(jiàn)原因之一。重度HIE患兒即使存活下來(lái)，也常患有腦癱、智力障礙、癲癇等嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥在臨床多見(jiàn)，死亡率高。而在高原地區(qū)，大氣氧分壓較低，由于高原低氧的影響，新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）在高原地區(qū)發(fā)病率比平原地區(qū)更高。所以建立高原環(huán)境下的缺氧缺血?jiǎng)游锬Ｐ褪橇私釮IE在高原環(huán)境下的發(fā)病機(jī)制，評(píng)估各治療方法療效的重要研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在模型制備上不同于近年來(lái)常見(jiàn)的缺氧缺血模型制作方法：比如孕鼠腹腔感染、大腦中動(dòng)脈阻塞、結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈等，孕鼠腹腔感染的致死率比較高；大腦中動(dòng)脈阻塞的方法制作模型雖然更貼近新生兒缺氧缺血臨床病因，但是線栓法結(jié)扎大腦中動(dòng)脈操作復(fù)雜有難度，不易成功；結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈的方法雖然比大腦中動(dòng)脈阻塞操作簡(jiǎn)單，但是手術(shù)后溫度要保證在36℃～37℃，不然術(shù)后動(dòng)物死亡率高。［17］上述三種造模方法會(huì)造成損傷，難以量化。本實(shí)驗(yàn)采取的是模擬高原情況下缺氧缺血合并運(yùn)動(dòng)的模型制作方法，因?yàn)檫@種方法容易操作，可以量化，并且結(jié)合游泳運(yùn)動(dòng)的方法，模擬人在高原環(huán)境中運(yùn)動(dòng)下的腦缺氧缺血，更加接近高原環(huán)境臨床疾病的發(fā)生的條件，故選取此方法。

行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠評(píng)分為明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠評(píng)分隨海拔升高而升高，行為異常程度與海拔高度呈正相關(guān)，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)組大鼠在第3、7、11、15 d行為學(xué)評(píng)分可以看出高原環(huán)境下缺氧時(shí)間越長(zhǎng)腦損害越嚴(yán)重。病理結(jié)果表明，隨著海拔高度從2 000 m、4 000 m到6 000 m上升，腦組織的病理變化逐漸加重，在海拔2 000 m、4 000 m以膠質(zhì)細(xì)胞增生為主，而在6 000 m以室管膜細(xì)胞重度水腫為明顯改變。TTC染色結(jié)果表明在模擬高原環(huán)境下新生大鼠在不同海拔高度顯示出不同程度的缺血表現(xiàn)，并且隨著海拔高度的增高，腦缺血逐漸加重，主要以大腦皮質(zhì)的缺血為主。掃描電鏡的結(jié)果表明對(duì)照組紅細(xì)胞的形態(tài)為正常雙凹圓盤狀，實(shí)驗(yàn)組在不同海拔高度下缺氧時(shí)紅細(xì)胞的形態(tài)有不同程度的改變。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均可說(shuō)明由于在高原環(huán)境的缺氧可導(dǎo)致新生大鼠的腦缺氧缺血的形成［18］，則造模成功。

在模型制作中，由于在高原環(huán)境下海拔2 000 m的高原居民多見(jiàn)，所以2 000 m做為實(shí)驗(yàn)組的最低海拔組，在此海拔高度上做出的模型更貼近實(shí)際情況。為了讓實(shí)驗(yàn)有比較與對(duì)比，更符合高原環(huán)境，實(shí)驗(yàn)組還加入了4 000 m組和6 000 m組。而海拔6 000 m以上幾乎無(wú)人居住，為模型分組的最高極限值，所以以海拔6 000 m組為實(shí)驗(yàn)組的海拔最高組，未選入8 000 m組。標(biāo)準(zhǔn)大氣壓為：1.013×105Pa，等于760 mmHg且每升高12 m，大氣壓約下降133 Pa。由于在不同海拔高度的高原地區(qū)，大氣壓在低于平原地區(qū)的情況下新生兒的健康就成為一個(gè)迫切的問(wèn)題。目前應(yīng)該對(duì)高原地區(qū)有神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)的新生兒進(jìn)行頭顱超聲或者頭顱CT的檢查，確診后及時(shí)治療，而非當(dāng)?shù)鼐用竦脑袐D最好在平原地區(qū)待產(chǎn)，以確保新生兒的健康。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了比較理想的高原新生兒缺氧缺血腦損傷模型。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 才仁卓瑪.高原地區(qū)新生兒缺血缺氧性腦病的病歷分析［J］.中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2014，（5）：2776.

［2］ 吳世政.高原神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究新進(jìn)展 ［J］.中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào)，2014，29（17）：19.

［3］ 韓玉昆.新生兒缺血缺氧性腦病診斷依據(jù)和臨床表現(xiàn)［J］.中華兒科雜志，l997，35（2）：99-100.

［4］ Vannucci RC.Hypoxic-ischemic encephalopathy［M］.Am J Perinatol.2000，17（3）：113-120.

［5］ 周叢樂(lè)，姜毅，馮琪，等.圍產(chǎn)期缺氧性腦損傷患兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的早期預(yù)測(cè)探討 ［J］.中華兒科雜志，2000，38：302-305.

［6］ 余勤，王艷，連俊蘭，等.大鼠骨髓問(wèn)質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)缺氧/缺血性腦損傷的研究 ［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2009，16（1）：34-37.

［7］ 余勤，李佩佩，周麗萍，等.黃芪聯(lián)合鞘內(nèi)移植問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠缺氧缺血性腦損傷修復(fù)作用的研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（7）：1455-1458.

［8］ 劉彩霞.舒愛(ài)蘭.神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合高壓氧治療高原地區(qū)新生兒缺血缺氧性腦病的療效觀察 ［J］.中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2011，8（7）：74-75.

［9］ 楊濤，黃慶愿.低壓艙內(nèi)大鼠游泳運(yùn)動(dòng)模型的建立 ［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（1）：1-4.

［10］ Kramer K，Dijkstra H，Bast A，et al.Control of physical exercise of rats in a swimming basin［J］.Physiol Behav，1993，53（2）：27l-276.

［11］ 劉曄，劉桂華，陳瓏.模擬海拔2000 m和3000 m高原訓(xùn)練的不同時(shí)程對(duì)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（2）：191-193.

［12］ Carter RJ，Morton J，Dunnett SB.Motor coordination and balance in rodents［M］.Curr Protoc Neurosci，2001，Chapter 8：Unit 8.12.

［13］ 王年丑.余香梅.蘇木精-伊紅染色法的改進(jìn)［J］.山西醫(yī)藥雜志，2001，30（2）：106-107.

［14］ 張振強(qiáng)，宋軍營(yíng)，賈亞泉，等.腦缺血合并高脂血癥模型大鼠腦組織的病理改變［J］.中國(guó)組織工程研究，2013，17（33）：5981-5987.

［15］ 樊小軍，陳明霞，劉衍晟，等.紅細(xì)胞掃描電鏡樣品的快速制作法［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，2005，24（4）：438.

［16］ 王燕，胡慧媛，趙美瞇，等.TTC染色評(píng)價(jià)豚鼠離體心臟缺血/再灌注損傷梗死面積的適宜觀察時(shí)間及計(jì)算方法 ［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（2）：160-164.

［17］ 馬杰，楊敏，楊建華，等.新生小鼠腦缺氧缺血性腦病模型的制作［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2007，23（9）：713-715.

［18］ 段濤，陳超.新生兒缺血缺氧性腦?。↖I）［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85（18）：1292-1294.

〔修回日期〕2016-02-22

調(diào)查與觀察

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）06-0061-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.012

［基金項(xiàng)目］高新區(qū)發(fā)展引導(dǎo)專項(xiàng)（2012B011000004）；廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目（2012B060300003）；高新區(qū)發(fā)展引導(dǎo)專項(xiàng)（2010A011200003）；廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目（2013B030300040）；廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目（2013B060300001）；廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目（2010B060500001）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2011DFA33290）。

［作者簡(jiǎn)介］龐煒（1989-），女，碩士，南方醫(yī)科大學(xué)，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究。E-mail：1583281060@qq.com。

［通訊作者］田雨光（1987-），男，博士，南方醫(yī)科大學(xué)，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究。郵箱471977663@qq.com；顧為望（1956-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師，南方醫(yī)科大學(xué)，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)的研究。E-mail：guww100@163.com。environment.Zea Longa 5 point scale standard was used to determine the behavioral scores at the 3 th 7 th 11 th 15 th days，and samples were collected on the 15thday to observe red blood cell morphology using HE and 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）staining and ultrastructure by scanning electron microscopy.Result （1）The neurological scores of the test groups A，B，C were significantly different from that of the control group（P＜0.05），and the scores of test group D and control group were very significantly different（P＜0.01）.（2）The histopathological examination using HE staining showed inflammatory cell infiltration in all rats of the test groups，and the extent of inflammatory cell infiltration was positively correlated with the increase of altitude.（3）The histopathology with TTC staining revealed prominent ischemia in the cerebral cortex of rats in the plateau hypoxic environment.（4）Scanning electron microscopy showed that the rat erythrocytes were cap-like in the group B，irregular in the group C，and zigzag shape in the group D.Conclusions In this study，a rat model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy（HIE）is successfully established by hypoxic cabin combined with sport activity.This model is stable，reliable，more closely mimicking the pathogenesis and clinical manifestation of neonatal HIE than models prepared with other methods，therefore，may be used in related research.

Preparation of a rat model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy

PANG Wei1，CAO Shuai-shuai2，LI Shu-yi2，TIAN Yu-guang1，GU Wei-wang1
（1.Experimental Animal Center，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Department of Stomatology，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China）

【Abstract】Objective To simulate the process of hypoxic-ischemic brain injury at high altitude in a simulated cabin with plateau low pressure environment，and to prepare a rat model of cerebral injuries at different high altitudes. Method Thirty-two 0-day-old neonatal SD rats were divided into four groups，namely group A（control group）and three test groups：group B（2000 m group），group C（4000 m group），and group D（6000 m group）.The rats of control group were reared in a barrier environment.The rats of test groups were placed in a simulated cabin with plateau low pressure environment，and to prepare neonatal cerebral ischemia-hypoxia model by sport activities.The sport movements were carried out in the cabin in a swimming groove 60 min/d，and not less than 20 hours a day at high altitude low pressure

【Key words】Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy，Hypoxic-ischemic encephalophathy，HIE；2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC；Histopathology；Scanning electron microscopy；Rats