兩種微創(chuàng)Beagle犬心肌梗死模型的比較

鄧祖躍，楊 何，劉 璐，陳永祥

（1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州浙江 310015；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州浙江 310012）

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兩種微創(chuàng)Beagle犬心肌梗死模型的比較

鄧祖躍1，楊 何2，劉 璐1，陳永祥2

（1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州浙江 310015；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州浙江 310012）

【摘要】目的 采用兩種方法建立beagle犬心肌梗死動物模型并比較其效果。方法 將30條Beagle犬隨機(jī)分成三組，每組10條。①假手術(shù)組，開胸后剪開心包腔，不結(jié)扎冠狀動脈。另外兩組在電視胸腔鏡輔助下用鈦夾夾閉犬左冠狀動脈前降支血管，②微創(chuàng)直視組，在胸骨左緣第3肋間開3.0 cm小切口，光源和操作器械均由此孔進(jìn)入胸腔。③胸腔鏡組，采用左側(cè)第3肋間鎖中線開孔1.0 cm，作為探測孔，電視胸腔鏡由此進(jìn)入胸腔，在第3肋間胸骨旁線及第4肋間鎖中線處各開0.5 cm小孔作為操作孔，手術(shù)器械由此進(jìn)入胸腔。造模后，測定心電圖和血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌鈣蛋白I（cTnI）含量變化，采用HE染色了解各組的心肌病變情況。記錄手術(shù)成功率、從皮膚切開開始到關(guān)胸所需要的時間和傷口愈合時間。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，兩組動物出現(xiàn)明顯的心肌梗塞改變（心電圖st段抬高，血清CK-MB和cTnI水平增加，心肌缺血壞死纖維化，心肌細(xì)胞減少）。兩種造模方法的犬存活率達(dá)90%，微創(chuàng)直視法所需時間明顯較少，胸腔鏡法切口愈合時間較短。結(jié)論 微創(chuàng)手術(shù)建立的心肌梗塞模型，動物創(chuàng)傷小， 死亡率低，是一種研究心肌梗塞病理生理機(jī)制的理想模型。

【關(guān)鍵詞】心肌梗塞；左冠狀動脈前降支；犬；電視胸腔鏡

近年來，微創(chuàng)手術(shù)作為一種成熟技術(shù)在腹部和胸部外科領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣，已有研究者將微創(chuàng)技術(shù)引入動物模型的制造，在心肌梗塞模型制備中，出現(xiàn)了電視胸腔鏡輔助下制作豬和犬的心肌梗死模型［1，2］。我們在分析了這些方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)的體會，比較了兩種微創(chuàng)Beagle犬心肌梗塞模型，為心肌梗塞研究的模型制造提供參考方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀（日本 Kohden公司）；全自動生化分析儀，日本日立公司產(chǎn)品；Aeon7200A呼吸麻醉機(jī)（上海寰熙醫(yī)療器械有限公司）。胸腔鏡一套，杭州桐廬醫(yī)療光學(xué)儀器有限公司。Amersham Imager 600多功能成像儀（美國 GE公司），RM2235切片機(jī)（德國徠卡（萊卡）公司），DM4000 B顯微鏡（德國徠卡（萊卡）公司）。

氯化硝基四氮唑藍(lán)染色液（N-BT，批號：201506）（南京建成生物工程研究所）；肌酸激酶MB同工酶（CK-MB，批號：171036/50003007））試劑盒（德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司）；肌鈣蛋白測定試劑盒（合肥博美生物科技責(zé)任有限公司，批號：201507）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

健康雄性純種比格犬30只，體重10～20 kg，購于福建振和實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，生產(chǎn)許可證：【SCXK（閩）2012-0002】，質(zhì)量合格證號：35002100000059。動物實(shí)驗(yàn)在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物部完成SYXK（浙）2012-0176。室溫20℃～25℃，相對濕度40%～70%。單籠飼養(yǎng)，給予自由進(jìn)食和飲水，平衡飲食1周后隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

1.3 動物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 分組：30只比格犬隨機(jī)分為3組，每組10只。（1）假手術(shù)組，胸骨左緣第3肋間開胸后剪開心包腔，不結(jié)扎冠狀動脈。（2）微創(chuàng)直視法組，在胸骨左緣第3肋間切口長約3.0 cm，電視胸腔鏡和操作器械均由此孔進(jìn)入胸腔，在直視下用鈦夾夾閉犬左冠狀動脈前降支血管。（3）胸腔鏡法組，采用左側(cè)第3肋間鎖中線開孔1.0 cm，電視胸腔鏡由此進(jìn)入胸腔，在第3肋間胸骨旁線及第4肋間鎖中線處各開0.5 cm小孔作為操作孔，操作器械分別由此進(jìn)入胸腔，在電視胸腔鏡輔助下用鈦夾夾閉犬左冠狀動脈前降支血管。

1.3.2 動物模型的建立：參考相關(guān)文獻(xiàn)造模［2］，稱重比格犬后，在前肢皮下靜脈注射3%戊巴比妥鈉（給藥劑量1/mL·kg），麻醉后置于手術(shù)臺上，以左側(cè)臥位固定。在犬后肢建立靜脈給藥通路，連接肢導(dǎo)II導(dǎo)聯(lián)，監(jiān)測心電圖，將單腔氣管插管插入犬氣管，連接呼吸機(jī)，建立無創(chuàng)氣道通路。根據(jù)分組情況在相應(yīng)位置開孔，進(jìn)行手術(shù)操作。在左心耳搏動明顯處心剪開心包，找到冠脈前降支，在中上部分鉗夾一鈦夾，接著逐層縫合肌肉皮膚，據(jù)犬心電圖ST段抬高和結(jié)扎部位以下心肌變白判斷心肌梗死模型制作成功。手術(shù)完成后觀察30 min，無異常后，鼓肺，逐層縫合切口，關(guān)胸、吸痰，待動物蘇醒后拔除氣管，觀察30 min各項(xiàng)生命指標(biāo)無異常后常規(guī)檢測各項(xiàng)生理指標(biāo)及采集標(biāo)本，檢測完畢后送返動物觀察室。術(shù)后前3 d，每日肌注青霉素240萬U，以后常規(guī)飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)4周后處死取材。手術(shù)后3 h和處死前取血，制備血清，-20℃ 保存?zhèn)溆?；處死動物取心臟，取結(jié)扎部位以下的部分組織切片，用0.5%氯化硝基四氮唑藍(lán) （N-BT）染色液染色，取心肌梗死周邊部位心肌保存于10%甲醛溶液中，進(jìn)行病理組織學(xué)檢測。

1.3.3 監(jiān)測ECG：術(shù)后在4個時間點(diǎn)（結(jié)扎前、結(jié)扎后10 h、3 h、28 d）監(jiān)測 ECG，測量各點(diǎn)ST段值。ST段≥0.1 mV以上為ST段抬高，表明心肌有缺血，實(shí)驗(yàn)根據(jù)此指標(biāo)的變化可以動態(tài)了解心肌梗死發(fā)生的大致位置、程度以及恢復(fù)情況。

1.3.4 血液各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測：用全自動生化儀和試劑盒測定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB），肌鈣蛋白IcTnI）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況及手術(shù)存活情況

犬術(shù)后2～3 h蘇醒，6 h仍精神萎靡，半臥位，不能自主進(jìn)食，多數(shù)有呼吸急促、紫紺及嘔吐表現(xiàn)，12 h即能行走，能舔食流質(zhì)飲食，基本沒有異常表現(xiàn)。術(shù)后存活情況，假手術(shù)組10只均存活，微創(chuàng)直觀法組9條存活，1條死亡，死亡原因?yàn)樾g(shù)中室顫；胸腔鏡法組9條存活，1條因術(shù)后復(fù)蘇時氧氣不足而死亡，三組手術(shù)的犬術(shù)后存活率差異沒有顯著性（P＞0.05）：。

2.2 從皮膚切開開始到關(guān)胸所需要的時間及術(shù)后傷口愈合情況

假手術(shù)組、微創(chuàng)直視組和胸腔鏡法組三組手術(shù)時間分別為（40.7±3.5）min、（15.5±2.6）min、（30.8±4.2）min，微創(chuàng)直視組所需時間明顯較少（P＜0.01）。術(shù)后傷口愈合情況，假手術(shù)組（10.5± 2.5）d后愈合，微創(chuàng)直視組（5.3±1.4）d愈合，胸腔鏡法組（3.2±1.5）d愈合。兩種微創(chuàng)手術(shù)的恢復(fù)明顯比開胸手術(shù)快（P＜0.01），二者之間的差異不顯著。

2.3 心電圖變化

三組動物在術(shù)前ECG基本一致，ST段變化在正常范圍，術(shù)后，假手術(shù)組沒有阻斷LAD，ECG在各時間沒有明顯變化，而微創(chuàng)造模組均阻斷了LAD，心肌缺血，結(jié)扎術(shù)后各時問段查心電圖，以II導(dǎo)聯(lián)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行對照，可以看到早期典型的梗死心電圖改變（圖1）。結(jié)扎后10 min心電圖可見ST段抬高，部分導(dǎo)聯(lián)達(dá)0.5 mV；21.5倍，19，8倍，3 h ST段明顯回落，T波高尖與主波方 向一致8倍，8，5倍；術(shù)后28 d下降更明顯，偶有T波倒置4.7倍和5.1倍。但ST段均比假手術(shù)組高（P＜0.01），說明缺血仍然存在，（P＜0.01）（表1）。

圖1 犬手術(shù)前后心電圖變化情況Fig.1 ECG changes before and after operation in the dogs

表1 犬心電圖ST段抬高的情況Tab.1 ECG ST segment elevation levels in the dogs（-±s，n=10）

表1 犬心電圖ST段抬高的情況Tab.1 ECG ST segment elevation levels in the dogs（-±s，n=10）

注：與假手術(shù)比較，**P＜0.01。Note.**P＜0.01，compared with the sham group.

組別Groups ST（mV）術(shù)前Before operation　0 h　3 h　28 d假手術(shù)組Sham-operated group　0.025±0.006　0.029±0.008　0.031±0.009　0.027±0.006微創(chuàng)直視法組Minimally invasive surgery under direct vision group　0.026±0.008　0.558±0.032**　0.247±0.023**　0.126±0.013**胸腔鏡法組Thoracoscopic group　0.024±0.007　0.573±0.029**　0.265±0.025**　0.138±0.015**

表2 血清CK-MB和cTnI的變化（±s，n=10）Tab.2 Changes of the serum CK-MB and cTnI levels（±s，n=10）

表2 血清CK-MB和cTnI的變化（±s，n=10）Tab.2 Changes of the serum CK-MB and cTnI levels（±s，n=10）

注：與假手術(shù)比較，**P＜0.01。Note.**P＜0.01，compared with the sham group.

cTnI（nmol/mL）3 h　28 d　3 h　28 d假手術(shù)組Sham-operated group　254.76±23.63　136.37±27.52　0.04±0.01　0.05±0.02微創(chuàng)直視法組Minimally invasive Surgery under direct vision group　918.53±81.36**　145.68±21.32　5.26±2.54**　0.03±0.01胸腔鏡法組Thoracoscopic group　956.88±78.83**　139.42±31.56　5.05±3.12**　0.04±0.02組別Groups CK-MB（U//mL）

注：A是假手術(shù)組；B是微創(chuàng)直視組；C是胸腔鏡組。圖2 心臟N-BT染色病理結(jié)果Note.A：Sham operated group；B：Minimally invasive surgery under direct vision group；C：Thoracoscopic group.Fig.2 Pathological changes of the myocardium in the dogs.N-BT staining

注：A是假手術(shù)組；B是微創(chuàng)直視組；C是胸腔鏡組（標(biāo)尺=100 μm）。圖3 心臟HE染色的病理改變Note.A：Sham operated group；B：Minimally invasive surgery under direct vision group；C：Thoracoscopic group（Bar=100 μm）.Fig.3 Pathological changes of the heart in the dogs.HE staining.

注：A是假手術(shù)組；B是微創(chuàng)直視組；C是胸腔鏡組；標(biāo)尺=10 μm。圖4 心臟HE染色的病理改變Note.A：Sham group；B：Minimally invasive surgery under direct vision group；C：Thoracoscopic group；Bar=10 μm.Fig.4 Pathological changes of the myocardium.HE staining

2.4 比格犬血清CK-MB和cTnI的變化

假手術(shù)組在術(shù)后6 h，CK-MB值比術(shù)后21 d高近1倍，說明手術(shù)對CK-MB有影響，而cTnI沒有變化。與假手術(shù)組相比，心肌梗死組血清 CK-MB和cTnI含量在術(shù)后6 h均顯著增加，分別為3.6和3.8倍和131.5和126.2倍，（P＜0.01），術(shù)后21 d，三組結(jié)果基本一致（表2）。

2.5 大體形態(tài)和組織病理結(jié)果

由圖2可以觀察到心臟的大體病理表現(xiàn)：對照組肉眼下，觀察心臟大體情況和N-BT染色結(jié)果，假手術(shù)組心臟表面光滑，各區(qū)域顏色一致，沒有發(fā)現(xiàn)心肌梗塞病變；而兩種手術(shù)組在夾閉血管周圍有點(diǎn)狀出血灶，梗死區(qū)心臟顏色變白，表面有白色纖維增生，N-BT染色相應(yīng)區(qū)域染色變淡，有明顯的纖維化區(qū)域，提示發(fā)生了較大面積的心肌梗死（P＜0.01）（圖2）。

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌細(xì)胞包膜完整、排列規(guī)則、細(xì)胞間隙均勻，肌纖維完整、走向一致。兩種手術(shù)組均可見前降支血管旁心肌細(xì)胞排列紊亂、纖維濁腫斷裂、空泡變性，心肌纖維變性壞死、縱紋及橫紋消失，細(xì)胞核數(shù)量明顯減少（圖3，4）。

3 討論

犬的心臟解剖特點(diǎn)決定了其適合用于制作心臟疾病模型，但由于成本的原因，很多研究常常采用雜種犬［3］，但雜種犬的來源和遺傳背景復(fù)雜，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差大，有時會影響結(jié)果判斷。而Beagle犬由于品種固定，遺傳穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，被國際公認(rèn)為是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動物［4］。因此，我們擬用Beagle犬作為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行心肌梗塞研究。

經(jīng)典的心肌梗塞模型主要開胸結(jié)扎冠脈左前降支，隨著外科領(lǐng)域的發(fā)展，傳統(tǒng)的大切口手術(shù)模式正逐步減少，新興的微創(chuàng)手術(shù)應(yīng)用越來越廣泛［5］?，F(xiàn)代電視胸腔鏡就是這樣一門全新的微創(chuàng)胸外科技術(shù)，借助高精度光學(xué)和影像技術(shù)以及精良的外科工具只需在胸壁打1～3個小孔或附加1個2～3 cm的小切口，與常規(guī)開胸手術(shù)相比，手術(shù)創(chuàng)傷小，失血少，疼痛輕，不破壞胸壁的完整性，對心肺功能尤其是肺功能損害小，減少了術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。江佩蓉等［6］比較了解常規(guī)開胸手術(shù)和胸腔鏡術(shù)行肺葉切除術(shù)患者影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胸腔鏡組術(shù)后肺功能的影響小于常規(guī)組，認(rèn)為主要原因是胸腔鏡手術(shù)減少了開胸手術(shù)引起的胸壁創(chuàng)傷、降低了心肺功能損傷、從而保護(hù)了肺功能。

本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了這些技術(shù)和設(shè)備建立了兩種微創(chuàng)心肌梗塞模型，用鈦夾夾閉左前降支制作了急性心肌梗死模型，結(jié)果均獲得滿意的效果：心電圖ST明顯抬高，心肌梗塞血清標(biāo)志物CM-KM和cIN增加，兩種手術(shù)組心臟梗塞區(qū)出現(xiàn)心肌壞死，纖維變性、細(xì)胞減少。兩種手術(shù)的成功率均很高，達(dá)到90%以上。在術(shù)后傷口愈合方面，我們發(fā)現(xiàn)了明顯差異，假手術(shù)組10 d后愈合，微創(chuàng)直視組5 d愈合，胸腔鏡法組3 d愈合。這些結(jié)果說明了這兩種技術(shù)造模都是成功的，但在創(chuàng)傷對模型的影響方面，微創(chuàng)能盡快恢復(fù)，而傳統(tǒng)手術(shù)（假手術(shù)組）創(chuàng)口恢復(fù)明顯晚很多，動物的自身活動明顯受限，這對實(shí)驗(yàn)的后期影響較大。我們比較這兩種微創(chuàng)手術(shù)，沒有看到二者在手術(shù)效果上有明顯差異，但在手術(shù)操作時間中發(fā)現(xiàn)了一些差異。微創(chuàng)直視法，所有的設(shè)備在同一孔進(jìn)行，操作過程的手術(shù)器械比較容易定位，雖然空間局促，但鈦夾鉗操作能夠順利完成，這個手術(shù)操作時間比較短，操作技術(shù)容易掌握，在熟練的情況下，可以不需要連接呼吸機(jī)，就可以完成手術(shù)，只是開口相對較大，傷口愈合慢一些，這個手術(shù)和傳統(tǒng)的開胸不同，它需要專業(yè)的冷光源照明胸腔內(nèi)環(huán)境，外部直射光是不能完成這個任務(wù)的，另外手術(shù)器械需要專門微創(chuàng)手術(shù)器械，才能達(dá)到在小的手術(shù)視野完成手術(shù)。胸腔鏡法，胸腔鏡和手術(shù)器械分別由不同的孔進(jìn)入胸腔，每個孔開的比較小，一般不超過1 cm，所以術(shù)后愈合很快，甚至有些孔不需縫合，但這個手術(shù)的技術(shù)要求比較高，對專用手術(shù)器械操作要求熟練，另外，電視圖像與胸腔操作同步性需要較長的適應(yīng)期，所有的這些造成手術(shù)時間比較長，因此，氣管插管又是比較關(guān)鍵的技術(shù)，必須保證在呼吸機(jī)通氣的情況下才能維持手術(shù)過程，而肺泡的舒張影響手術(shù)視野，那么只有進(jìn)行右側(cè)單肺通氣，這要求更高的氣管插管技術(shù)，但這個手術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是除了創(chuàng)傷小，由于手術(shù)器械騰拉空間大，還有可進(jìn)行長時間的精細(xì)手術(shù)。

總之，我們用兩種微創(chuàng)手術(shù)成功制作了心肌梗塞模型，為心肌梗塞的研究提供了兩種參考方法，兩種方法各有其優(yōu)點(diǎn)，但均是對動物機(jī)體影響較小的方法，甚至均可多次進(jìn)行胸腔手術(shù)。至于用哪一種模型造模更好，主要根據(jù)各實(shí)驗(yàn)的要求和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備情況，選擇合適的方法。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 童繼春，翟光地，黃曉燕，等.電視胸腔鏡輔助下建立豬心肌梗死模型［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，20（6）：485-487.

［2］ 李連達(dá)，周曉輝，吳理茂.應(yīng)用電視輔助胸腔鏡制作慢性微創(chuàng)心肌梗死模型的研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)，2008，26（3）：453-457.

［3］ 劉潔，曲極冰，曲紹春.復(fù)方紅景天對犬實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞的保護(hù)作用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，1997，3（5）：29-32.

［4］ 陳心培，張瑜，梁卓，等.比格犬與雜種犬右心室快速起搏至房顫模型比較［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35（6）：605-607.

［5］ 王永光.微創(chuàng)、微創(chuàng)外科與微創(chuàng)醫(yī)學(xué)［J］.中國醫(yī)刊，2004，39（1）：53-54.

［6］ 江佩蓉，張寧，吳旭輝.電視胸腔鏡與傳統(tǒng)開胸手術(shù)患者肺功能對比 ［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，14（5）：583 -584.

〔修回日期〕2016-03-04

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0048-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.010

［基金項(xiàng)目］浙江省省級公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（編號：Y206355）。

［作者簡介］鄧祖躍（1973-），男，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。E-mail：dzy7317@sina.com。

［通訊作者］陳永祥（1975-），男，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。E-mail：cyx75001@163.com。in the two model groups（ECG S-T segment elevation，increased serum CK-MB and cTnI levels，myocardial ischemia and fibrosis，and reduced amount of cardiomyocytes）.The survival rate was 90%in both of the two model groups.The operating time was shorter in the minimally invasive surgery under direct vision group，and the wound healing time was shorter in the thoracoscopic group.Conclusions The myocardial infarction models generated by minimally invasive surgery have less trauma and low mortality in the dogs.This model is suitable for investigation of pathophysiological mechanism associated with myocardial infarction.

Comparison of two types of myocardial infarction models in Beagle dogs

DENG Zu-yue1，YANG He2，LIU Lu1，CHEN Yong-Xiang2
（1.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310015，China；2.Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 320007，China）

【Abstract】Objective The purpose of this study was to compare two types of myocardial infarction（MI）models in Beagle dogs.Methods 30 dogs were divided randomly into three groups（n=10）.① The sham-operated group underwent pericardiotomy but without coronary artery ligation.The other two model groups were made under video-assisted thoracoscopy（VATS），where the left anterior descending coronary artery was closed by titanium clips：②The direct vision group：the minimally invasive closure of the artery was performed under direct vision.In this group，the thoracoscopic operation was performed through a 3.0 cm small incision opened at the margin of the left third rib.③ The thoracoscopic group：the video-assisted thoracoscope was inserted into the chest through a 1.0 cm exploratory hole in the midline of the third rib，and the surgical instruments were inserted through two 0.5 cm operating holes at the para-sternum line of the third rib and midclavicular line of the fourth rib.Electrocardiogram（ECG）was recorded and the levels of serum creatine kinase-MB（CK-MB）and troponin I（cTnI）were measured after modeling.The heart tissue samples were examined by histology using HE staining.The success rate of model establishment，durations from skin incision to chest closing and the wound healing were recorded.Results Compared with the sham-operated group，changes of myocardial infarction were observed

【Keywords】Myocardialinfarction；Leftanteriordescendingcoronaryartery；Beagledogs；Videoassisted thoracoscopy