微生物源性抗氧化劑對小鼠睡眠及抗氧化性能的影響

余思佳，徐建雄

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240）

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微生物源性抗氧化劑對小鼠睡眠及抗氧化性能的影響

余思佳1，2，徐建雄1，2

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240）

【摘要】目的 探究不同劑量微生物源性抗氧化劑對小鼠睡眠及其抗氧化性能的影響。方法 60只雄性昆明小鼠隨機分為4組，低、中、高劑量組分別灌喂0.5 g/kg體重、1.0 g/kg體重和1.5 g/kg體重微生物源性抗氧化劑，對照組使用生理鹽水進行灌胃，試驗期30 d。在末次灌胃后，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉，通過翻正反射實驗觀察小鼠睡眠狀況，并在結(jié)束后，檢測小鼠血清抗氧化性能。結(jié)果 與低、高劑量組相比，中劑量組的微生物源性抗氧化劑可以顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時間（P＜0.05）。與對照組，低，高劑量組相比，中劑量組極顯著提高GSH-Px活力（P＜0.01）、顯著提高SOD活力（P＜0.05）。與對照組相比，中劑量組MDA和8-ISO-PGF2α含量有顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論 提示微生物源性抗氧化劑有促進小鼠的睡眠、提高機體抗氧化能力的作用，且在1.0g/kg體重劑量下效果最顯著。

【關(guān)鍵詞】微生物源性抗氧化劑；翻正反射；抗氧化性能；睡眠小鼠

伴隨著社會的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，失眠已成為困擾人們正常生活的重要問題之一。失眠是指無法入睡或無法保持睡眠狀態(tài)，導(dǎo)致睡眠不足，又稱入睡和維持睡眠障礙。失眠往往會給患者帶來極大的痛苦和心理負擔(dān)。目前治療失眠的藥物主要是化學(xué)合成類鎮(zhèn)靜催眠藥，但長期使用會產(chǎn)生依賴和毒副作用，因此研發(fā)安全高效的保健品成為新的方向。睡眠與覺醒是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要活動的結(jié)果，由于腦組織具有高密度膜不飽和脂肪酸、較高的脂肪代謝率、低含量抗氧化劑以及依賴完整神經(jīng)元突觸傳遞等特性，易受活性氧攻擊導(dǎo)致?lián)p傷，引起細胞膜脂質(zhì)過氧化及通透性增加；神經(jīng)元發(fā)生細胞毒性水腫；線粒體遭到破壞，功能喪失等［1］?？寡趸瘎┠軌蚋蓴_自由基連鎖反應(yīng)的引發(fā)以及擴散，從而抑制脂質(zhì)過氧化。而微生物源性抗氧化劑則是由一些具有抗氧化作用的菌體本身以及有抗氧化能力的微生物發(fā)酵產(chǎn)物組成。本試驗通過灌喂小鼠不同劑量微生物源性抗氧化劑，探究其對小鼠抗氧化能力及睡眠的影響，為研究促進睡眠的新型保健食品提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物源性抗氧化劑：由上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司提供，該產(chǎn)品是刺梨、沙棘等果實，經(jīng)枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、酪酸桿菌、啤酒酵母等有益微生物經(jīng)固、液復(fù)合發(fā)酵后，再經(jīng)提取、濃縮、滅活性、凍干等加工工藝制成。含有VC、VE、異黃酮、SOD、谷胱甘肽、皂苷、?；撬岷投喾N微量元素的金屬衍生物。

1.1.2 實驗動物：60只清潔級雄性昆明小鼠，體重15～18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（滬2007-0005）。

1.1.3 實驗試劑：血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、8-異前列腺素F2α（8-ISO-PGF2α）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。戊巴比妥鈉：購于默克化工技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理：小鼠隨機分為4組，每組15只，分別為對照組、低（L-MA）、中（M-MA）、高劑量組（H-MA）。各組小鼠均飼喂基礎(chǔ)日糧（購自上海斯萊克實驗動物有限公司），實驗組分別灌喂0.5 g/kg體重、1.0 g/kg體重、1.5 g/kg體重微生物源性抗氧化劑，對照組灌喂等體積的生理鹽水，灌胃容量為0.2 mL/10 g體重，每天灌胃1次。實驗小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院動物室內(nèi)，自由進食與飲水，保持動物房溫度為（22～25）℃，相對濕度為50%～60%，光照明暗各12 h。

1.2.2 測定指標和方法：

1.2.2.1 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗：在末次灌胃15 min后，試驗動物按57 mg/kg體重劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為0.1 mg/10 g體重，以小鼠翻正反射消失1 min以上作為入睡判斷標準，翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間，記錄入睡動物數(shù)及睡眠時間。

1.2.2.2 抗氧化指標測定：（1）樣品采集制備：翻正反射試驗結(jié)束后，小鼠摘眼球采血，3 800 r/min離心10 min，制備血清。（2）測定指標與方法：按照南京建成檢測試劑盒說明書對血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、8-異前列腺素F2（8-ISO-PGF2α）這四個指標進行檢測。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)處理與分析采用 SPSS 17.0的單因素方差分析，并用 LSD法進行多重比較，分別以P＜0.05、P＜0.01為差異顯著與極顯著判斷標準。結(jié)果以平均值果以標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間

從表1可以看出，在實驗條件下，對照組的入睡動物數(shù)少，試驗組入睡動物數(shù)皆高于空白對照組，其中低劑量組和中劑量組入睡動物數(shù)分別是是對照組的2和1.8倍。四組動物的睡眠潛伏期差異無顯著性。中劑量組與低劑量組和高劑量組對比，小鼠的睡眠時間均高于后兩者且呈現(xiàn)差異顯著性（P ＜0.05）。中劑量組睡眠時間高于空白對照組（P＞0.05），無統(tǒng)計學(xué)意義。表明中劑量微生物源性抗氧化劑對延長戊巴比妥鈉小鼠的睡眠時間有促進作用。

表1 受試物對戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間的影響Tab.1 The effect of microbe-derived antioxidant on duration of sleep induced by pentobarbital sodium

表2 小鼠血清抗氧化能力Tab.2 The antioxidant ability of the mouse serum

2.2 血清抗氧化能力

從表2可以看出，中劑量組的GSH-px活力與其他各組相比有極顯著的提高（P＜0.01），低劑量組和高劑量組與對照組相比略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。對于SOD含量，各劑量組與對照組相比，都有極顯著提高（P＜0.01），其中，中劑量組的SOD含量最高，且與低劑量組、高劑量組都有顯著差異（P＜0.05）。高劑量組較低劑量組SOD含量有提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對于MDA含量，各劑量組與對照組相比，皆有不同程度的降低。對照組與低劑量組差異極顯著（P＜0.01），與中劑量組差異顯著（P＜0.05），與高劑量組差異無顯著性（P＞0.05）。對于8-ISO-PGF2α，各劑量組與對照組相比，皆有不同程度的降低。對照組與低劑量組和中劑量組差異顯著（P＜0.05），但與高劑量組差異無顯著性（P＞0.05）。

3 討論

3.1 不同劑量的微生物源性抗氧化劑對小鼠睡眠的影響

研究表明，失眠與氧化應(yīng)激存在著一定的關(guān)系［1，2］。因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)富含不飽和脂肪酸，容易受到氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化的干擾，而睡眠與覺醒又是主要通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行調(diào)控。所以，睡眠時間的長短及質(zhì)量在很大程度上受到氧化應(yīng)激的影響。

Ikeda M等［3］（2005）在給小鼠第三心室以100 μL/10 h的流速注射叔丁基過氧化氫（TBHP，一種強氧化劑）的實驗中表明，0.1 μmol/L的TBHP能夠顯著延長非快速眼動睡眠的時間（NREM）和快速眼動睡眠時間（REM），而REM的延長能夠顯著增加整個睡眠時間。但繼續(xù)增加劑量（1 μmol/L），睡眠時間并沒有增加。高劑量（10 μmol/L）TBHP反而減少了NREM，顯示出了顯著的睡眠抑制效應(yīng)。產(chǎn)生的原因可能是因為高濃度的TBHP所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激效應(yīng)使中視前區(qū)區(qū)域神經(jīng)（睡眠及體溫的控制中心）受到損傷。而注射低濃度TBHP時，并不能觀察到注射區(qū)附近的氧化損傷，這一結(jié)論與本實驗的結(jié)果有一定的一致性。實驗數(shù)據(jù)表明，在氧化應(yīng)激程度最低時，小鼠睡眠時間最長。從表2可以看出，各實驗組的MDA以及8-ISO-PGF2α與對照組相比，皆有顯著下降，說明在飼養(yǎng)過程中，小鼠受到了氧化損傷，而灌胃的微生物源性抗氧化劑在一定程度上緩解了氧化損傷的作用。同時，在中劑量組時，GSH-px和SOD活力顯著高于其他劑量組。說明在此劑量下微生物源性抗氧化劑的抗氧化效果最好，受到的氧化應(yīng)激損傷最低。而從表1中可以看出，中劑量組小鼠的睡眠時間也顯著高于低、高劑量組小鼠的睡眠時間。

根據(jù)本實驗室之前的研究［4，5］，微生物源性抗氧化劑具有顯著的抗氧化能力，其中含有886 mg/ 100 g含量的GSH。GSH是一種重要的抗氧化劑。而氧化型谷胱甘肽（GSSG）可由GSH轉(zhuǎn)化形成，是一種重要的睡眠促進物質(zhì)，在谷氨酸受體的突觸水平上能夠抑制神經(jīng)傳遞的興奮性。在 10～100 nmol/L范圍注射氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽的實驗中發(fā)現(xiàn)，GSSH及GSH對睡眠時間的作用呈現(xiàn)鐘形趨勢。在25 nmol（GSSG）和50 nmol（GSH）時分別呈現(xiàn)最顯著的提高［6］。這一結(jié)論也與本實驗中，在受到氧化應(yīng)激損傷程度最小的中劑量組時睡眠時間顯著高于低、高劑量組小鼠的睡眠時間這一鐘形曲線相吻合。

3.2 不同劑量的微生物源性抗氧化劑對小鼠抗氧化性能的影響

從表2中可以看出，灌注中劑量微生物源性抗氧化劑，小鼠的GSH-px和SOD活力顯著高于其他劑量組，且低、中、高劑量組的MDA和8-ISO-PGF2α的濃度皆低于對照組。綜上數(shù)據(jù)表明，微生物源性抗氧化劑有一定抗氧化功效，但抗氧化效能并非隨著抗氧化劑劑量的增加而增加，在1.0 g/kg體重/d劑量下效果最好。說明超高劑量的抗氧化會導(dǎo)致過氧化作用，實踐中盲目使用抗氧化劑不僅不能有效發(fā)揮機體抗氧化作用，反而可能使氧化應(yīng)激更加嚴重［7］。本實驗數(shù)據(jù)在一定程度上也驗證了這一點。雖然ROS可攻擊不飽和脂肪酸，促使其發(fā)生氧化或過氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，并降解成為丙二醛；可引發(fā)細胞內(nèi)蛋白氧化，線粒體損傷，誘發(fā)DNA結(jié)構(gòu)破壞，促使端粒變短，激活細胞凋亡信號，最終影響細胞壽命［8］。但在正常生理條件下生成的微量的ROS對維持細胞的正常功能（包括信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控）具有十分重要的意義［7］。在高等動物的神經(jīng)細胞內(nèi)，正常生理功能的維持需要較高水平的ROS，且神經(jīng)細胞對ROS濃度的變化能夠作出較為敏感的反應(yīng)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，ROS可增強體內(nèi)胰島素信號的敏感性［9］，這表明，ROS可能作為細胞內(nèi)生命代謝的介導(dǎo)物，并作為一種信號分子從細胞外環(huán)境到細胞進行傳遞［7］。

綜上，正常生理條件下低劑量的ROS處于平衡狀態(tài)，并對維持細胞穩(wěn)態(tài)和生理功能起著十分重要的作用。當(dāng)在生理條件下添加抗氧化劑過度清除ROS，而導(dǎo)致氧化還原失衡，也可誘發(fā)細胞信號紊亂，觸發(fā)機體中自我代償性的促氧化系統(tǒng)的啟動［7］。由上可知，大劑量補充抗氧化劑對機體是有害的，非氧化應(yīng)激條件下抗氧化劑的大量補充也存在著促氧化的潛在可能。因而，確定適宜的劑量對抗氧化劑的抗氧化效應(yīng)的發(fā)揮極為關(guān)鍵。

4 結(jié)論

1.0 g/kg.d體重的微生物源性抗氧化劑可以顯著延長小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時間，顯著提高GSHPx和 SOD活力，著降低 MDA和8-ISO-PGF2α含量，說明微生物源性抗氧化劑有促進小鼠睡眠、提高機體抗氧化能力的作用，且在1.0 g/kg體重劑量下效果最顯著。

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〔修回日期〕2016-03-28

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0028-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.006

［作者簡介］余思佳（1992-），女，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)E-mail：scarlettyu@yeah.net。

［通訊作者］徐建雄（1962-），男，教授，博士，研究方向：動物營養(yǎng)Email：jxxu1962@sjtu.edu.cn。

Effects of microbe-derived antioxidant on sleep and antioxidant ability in the rat

YU Si-jia1，2，XU Jian-xiong1，2
（1.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2.Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Shanghai 200240，China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of different doses of microbe-derived antioxidant on sleep and antioxidant ability in mice.Methods Sixty male Kunming mice with similar body weight were randomly divided into 4 groups.The control group received normal saline，and the experimental groups received microbe-derived antioxidant in a dose of 0.5 g/kg bw，1.0 g/kg bw or 1.5 g/kg bw once per day，respectively.The experiment period was 30 days.At the end of experiment，the mice of each group were intraperitoneally injected sodium pentobarbital to induce sleep.The mice fall sleep was judged by righting reflex.After the test of sleep，blood was taken for detection of serum antioxidant ability. Results Compared with the low dose and high dose groups，the middle dose group showed a significantly prolonged sodium pentobarbital-induced sleeping time（P＜0.05）.Compared with the control group，low and high dose groups，the middle dose group had highly significantly increased GSH-Px activity（P＜0.01）and significantly increased content of SOD.Under these conditions，the middle dose group reduced both the contents of MDA and 8-ISO-PGF2α（P＜0.05）compared with the control group.Conclusions Our results suggest that microbe-derived antioxidant exerts effect on sleep and antioxidant ability in rats.Supplement of 1.0 g/kg bw/d shows the most significant effects.

【Key words】Microbe-derived antioxidant；Righting reflex；Antioxidant ability；Sleep；Rat