microRNA—21逆向調(diào)控RECK促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究

張佑民

【摘要】 目的 研究 microRNA-21參與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制。方法 采用實時定量反轉(zhuǎn)錄 -聚合酶反應(yīng) （RT-PCR）方法檢測MDA-435、MDA-231和 MCF-7乳腺癌細(xì)胞株 microRNA-21的表達(dá)；采用 transwell方法測定上述三株乳腺癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力；人工合成 microRNA-21干擾序列 ， 轉(zhuǎn)染MDA-231、MDA-435乳腺癌細(xì)胞 ， 觀察對細(xì)胞侵襲能力的影響；應(yīng)用 Western blot檢測逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（RECK）的表達(dá)；采用熒光報告基因?qū)嶒灆z測 RECK與 microRNA-21的結(jié)合情況。結(jié)果 MCF-7、MDA-231及 MDA-435細(xì)胞株中均具有 microRNA-21高表達(dá) ， 且表達(dá)量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵襲特性的 MDA-435細(xì)胞具有最高水平 microRNA-21的表達(dá)為 （4.51±0.71）， MDA-231細(xì)胞具有中等水平的 microRNA-21表達(dá)為 （2.67±0.27）， MCF-7細(xì)胞表達(dá)microRNA-21水平相對較低為 （1.23±0.11）， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。三株細(xì)胞中 ， MDA-435細(xì)胞侵襲力最高為（425.4±35.0）細(xì)胞數(shù)/視野 ， MCF-7最低為（142.7±13.4）細(xì)胞數(shù)/視野 ， MDA-231居中為（263.7±24.4）細(xì)胞數(shù)/視野 ， 三組細(xì)胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。將 anti-microRNA-21分別轉(zhuǎn)染入 MDA-231和 MDA-435細(xì)胞 ， 與對照組比較 ， 兩種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 anti-microRNA-21后分別引起 56%和 67%的 microRNA-21表達(dá)量降低 ， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。將anti-microRNA-21轉(zhuǎn)染入MDA-231細(xì)胞， 與陰性對照組比較 ， anti-microRNA-21引起了 34%細(xì)胞侵襲數(shù)目的減少。將 anti-microRNA-21轉(zhuǎn)染入 MDA-435細(xì)胞 ， 結(jié)果表明 anti-microRNA-21引起68%侵襲細(xì)胞數(shù)目的下降。Western blot檢測顯示 ， microRNA-21表達(dá)下調(diào)， MDA-435細(xì)胞中 RECK表達(dá)明顯增強；熒光素酶實驗顯示共轉(zhuǎn)染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435細(xì)胞熒光酶活性增加38%。結(jié)論 本研究提示 microRNA-21可促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移 ， 其作用可能與逆向調(diào)控 RECK有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌；侵襲；microRNA-21；伴 Kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白；RNA干擾

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.16.195

【Abstract】 Objective To research regulation mechanism of microRNA-21 for breast cancer invasion and metastasis. Methods Real-time quantification polymerase chain reaction （RT-PCR） was applied to detect miR-21 expression in MDA-435， MDA-231 and MCF-7 breast cancer strains. In vitro invasion and metastasis of these three strains were detected by transwell method. Transfection on MDA-231 and MDA-435 cell was made by synthetic microRNA 21 interference sequence to observe the influence on cell invasion. Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs （RECK） protein expression was detected by Western blot， and combination of RECK and microRNA-21 was detected by luciferase reporter gene test. Results All MCF-7， MDA-231 and MDA-435 strains had high expressed microRNA-21， and their expression volume were shown as MDA-435>MDA-231>MCF-7. MDA-435 with high invasion feature showed the highest microRNA-21 expression level as （4.51±0.71）， followed by microRNA-21 expression in MDA-231 as （2.67±0.27） and in MCF-7 as （1.23±0.11）， and their difference had statistical significance （P<0.01）. Among the three strains， MDA-435 had the highest cell invasion as （425.4±35.0） cell number/vision， MCF-7 had the lowest as （142.7±13.4） cell number/vision， and MDA-231 as （263.7±24.4） cell number/vision. The difference of cell invasion had statistical significance across the three strains （P<0.01）. MDA-231 and MDA-435 cells received transfection of anti-microRNA-21. Comparing with the control group， transfection of anti-microRNA-21 in the two cell strains showed respectively 56% and 67% decreased microRNA-21 expression， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Comparing with the negative control group， MDA-231 with transfection of anti-microRNA-21 showed 34% decreased cell invasion count. MDA-435 with transfection of anti-microRNA-21 showed 68% decreased cell invasion count. Western blot test Detection by Western blot showed down-regulated microRNA-21 expression and enhanced RRECK expression in MDA-435 cell. Luciferase test showed increased fluorescence enzyme activity by 38% in MDA-435 cell with RECK and anti- microRNA-21 transfection. Conclusion This research shows promotion of breast cancer invasion and metastasis by microRNA-21， and its effect may have relationship with reverse regulation of RECK.

【Key words】 Breast cancer； Invasion； microRNA-21； Reversion-inducing cysteine-richprotein with Kazalmotifs； RNA interference

microRNAs是新近識別的人體內(nèi)一類內(nèi)源性非編碼小分子核糖核酸 （RNA）， 通過與靶基因互補結(jié)合 ， 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶蛋白表達(dá) ， 從而參與生物體各項生物學(xué)活動。前期研究顯示[1]， microRNA-21在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)并與阿霉素耐藥有關(guān) ， 并有研究提示[2]， microRNA-21高表達(dá)與乳腺癌患者轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究擬采用 RNA干擾技術(shù)降低 microRNA-21的表達(dá) ， 觀察對乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 ， 并觀察對其潛在靶基因：伴Kazal域的富含半胱氨酸的 RECK的表達(dá)調(diào)控。本研究旨在為深入闡述乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控機制提供實驗室依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-231和 MDA-435由山東省腫瘤防治研究院基礎(chǔ)研究中心常規(guī)保存。于含10%小牛血清的細(xì)胞凍存培養(yǎng)基 （DMEM）中 ， 37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1. 1. 2 主要試劑和儀器 脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000、Trizol試劑、實時定量 RT-PCR試劑盒、matrigel膠購自美國 Invitrogen 公司 ， transwell小室購自美國 Coning公司 ， 蛋白提取試劑盒購自生工生物工程 （上海 ）股份有限公司。RECK和 β-actin抗體購于美國 Santa Cruz公司。定量 PCR儀 ABI7000購于美國 ABI公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 實時定量 RT-PCR檢測microRNA-21的表達(dá) 應(yīng)用Trizol提取細(xì)胞RNA。microRNA-21逆轉(zhuǎn)錄引物為 5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA3； 上游引物為 5GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG3， 下游引物為 5GTGCAGGGTCCGAGGT3； 應(yīng)用互補脫氧核糖核酸（cDNA）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 ， 采用定量 PCR試劑盒進(jìn)行PCR。應(yīng)用 U6 RNA的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算?CT值， 重復(fù)實驗 3次， 以“均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1. 2. 2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù) Pubmed數(shù)據(jù)庫中的 microRNA-21基因序列 ， 設(shè)計合成 microRNA-21干擾序列為 5-UCAA CAUCAGUCUGA UAAGCUA-3， 對照序列為 5-CAGUACU UUUGUAGUACAA-3， 上述序列由上海吉瑪技術(shù)有限公司設(shè)計合成。以 Lipofectamine 2000為載體， 轉(zhuǎn)染MDA-231、MDA-435細(xì)胞株。具體步驟為：轉(zhuǎn)染前 1 h更換為無血清的 DMEM培養(yǎng)液 ， 將 siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加到含有細(xì)胞及培養(yǎng)基的實驗組孔中；陰性對照的細(xì)胞中只加入脂質(zhì)體。細(xì)胞同時置 CO 2培養(yǎng)箱 37℃中培養(yǎng) 5 h， 更換培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。

1. 2. 3 細(xì)胞侵襲實驗 應(yīng)用 DMEM按 1∶5 稀釋 Matrigel 基質(zhì)膠 ， 將 transwell 小室置于 24 孔板中 ， 取 100 ?l稀釋膠加至上室 ， 室溫干燥過夜。siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng) 48 h后 ， 應(yīng)用無血清的 DMEM調(diào)整細(xì)胞密度至 3×10 5/ml， 轉(zhuǎn)至 Matrigel包被的 transwell小室中 （6孔板 ， 8 ?m小孔）。在小室下層加入含 10%血清的 DMEM作為趨化劑。孵育 20 h后 ， 應(yīng)用棉簽拭去非侵襲性細(xì)胞。應(yīng)用結(jié)晶紫固定并染色。在 100倍熒光顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。

1. 2. 4 Western Blot檢測 RECK蛋白的表達(dá) MDA-231、MDA-435siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng) 24 h， 應(yīng)用細(xì)胞裂解液[0.15 mol/L NaCl， 0.05 mol/L pH7.5 Tris-Cl， 2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）， 0.5%Triton-100， 5 mmol/L DTT， 0.2 mmol/L PMSF， 2 mg/L apoptinin]提取細(xì)胞總蛋白。取 75 ?g蛋白行 8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ， 以 100 V電轉(zhuǎn)移 1 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%脫脂奶粉封閉 2 h。加入 RECK一抗 （1∶250）、β-actin一抗 （1∶500）室溫孵育 2 h， 加入適當(dāng)比例稀釋的羊抗鼠或羊抗兔二抗常溫孵育1 h。加 ECL顯色劑于暗室曝光顯像， 行圖像分析。

1. 2. 5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?擴增包含 RECK 3UTR區(qū)靶位點的引物為上游 5- ATTAACTAGTACCTCTATTCGCCA CACAG-3；下游 5-CTACATCAGCA CTGACATATTCTG -3。經(jīng)限制性內(nèi)切酶 （SpeI）切 PCR產(chǎn)物后 ， 將 RECK 3‘UTR克隆入pGL3熒光素酶質(zhì)粒載體， 轉(zhuǎn)染入MDA-435細(xì)胞株。5 h后， 繼續(xù)轉(zhuǎn)入 50 nMmicroRNA-21 inhibitor或?qū)φ招蛄小?4 h后 ， 裂解細(xì)胞檢測熒光素酶活性。pGL3質(zhì)粒作為共轉(zhuǎn)染的對照。每次轉(zhuǎn)染實驗重復(fù) 2次。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 乳腺癌細(xì)胞株 microRNA-21基因表達(dá) 應(yīng)用 Taqman PCR方法檢測 3種乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7、MDA-231和 MDA-435）microRNA-21的表達(dá)。其中， 具有高侵襲特性的 MDA-435細(xì)胞具有最高水平 microRNA-21的表達(dá)為 （4.51±0.71）， MDA-231細(xì)胞具有中等水平的 microRNA-21表達(dá)為 （2.67±0.27）， MCF-7細(xì)胞表達(dá)microRNA-21水平相對較低為 （1.23±0.11）， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

2. 2 乳腺癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力的測定 采用 transwell方法測定侵入濾膜的細(xì)胞數(shù) ， 判定上述三株乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果顯示 ， MDA-435細(xì)胞侵襲力最高為 （425.4±35.0）細(xì)胞數(shù) /視野 ， MCF-7最低為 （142.7±13.4）細(xì)胞數(shù) /視野 ， MDA-231居中為 （263.7±24.4）細(xì)胞數(shù) /視野。三組細(xì)胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2. 3 乳腺癌細(xì)胞株 microRNA-21基因干擾效果評價 將 anti-microRNA-21分別轉(zhuǎn)染入 MDA-231和 MDA-435細(xì)胞 ， 與對照組比較 ， 兩種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 anti-microRNA-21后分別引起 56%和 67%的 microRNA-21表達(dá)量降低 ， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2. 4 microRNA-21表達(dá)改變對乳腺癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移的影響將anti-microRNA-21轉(zhuǎn)染入MDA-231細(xì)胞， 與陰性對照組比較 ， anti-microRNA-21引起了 34%細(xì)胞侵襲數(shù)目的減少。將 anti-microRNA-21轉(zhuǎn)染入 MDA-435細(xì)胞 ， 結(jié)果表明 anti-microRNA-21引起68%侵襲細(xì)胞數(shù)目的下降。見圖3。

2. 5 microRNA-21對 RECK的表達(dá)調(diào)控影響 將 anti-microRNA-21分別轉(zhuǎn)染入 MDA-231細(xì)胞和 MDA-435細(xì)胞。Western blot 結(jié)果顯示 ， MDA-231及 MDA-435細(xì)胞無或少許 RECK表達(dá) ， 在 MDA-435細(xì)胞中 anti-microRNA-21下調(diào) ， 引起較明顯的 RECK蛋白的表達(dá)增加。MDA-231細(xì)胞中 RECK的表達(dá)亦有增強 ， 但變化不明顯。見圖4。為了進(jìn)一步證實 RECK mRNA的3UTR區(qū)是 microRNA-21的功能性靶點 ， 進(jìn)行了熒光素酶實驗 ， 與陰性對照組比較 ， 共轉(zhuǎn)染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435細(xì)胞熒光酶活性增加了38%。見圖5。

3 討論

>50%的人類 miRNA定位于與腫瘤相關(guān)的基因組位置， 并且 miRNAs通過調(diào)控多個靶基因的表達(dá)從而調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程 ， 提示這些分子在腫瘤中具有潛在的重要作用[3-6]。microRNA-21就是這類分子的其中之一。microRNA-21定位于染色體17q23.2， 此位點在一個常見的斷裂位點 FRA17B之內(nèi)。這一區(qū)域通常在結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌中出現(xiàn)擴增 ， 同時也與microRNA-21在多種類型腫瘤中過表達(dá)相一致[7-12]。本研究中 ， 發(fā)現(xiàn) microRNA-21在多種乳腺癌細(xì)胞中均有高表達(dá) ， 而且細(xì)胞內(nèi)源性 microRNA-21的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與既往幾個研究相一致 ， 提示 microRNA-21高表達(dá)可能與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

RECK基因是一個轉(zhuǎn)化抑制基因 ， 通過篩查纖維母細(xì)胞cDNAs表達(dá)文庫被證實 ， 其可將 v-Ki-ras轉(zhuǎn)化的 NIH3T3細(xì)胞的圓形形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉寝D(zhuǎn)化的扁平形態(tài)[13-15]。RECK是一個分子量為 110 kPa的膜嵌合糖蛋白， 位于9p13～p12， 長度 >87 kb， 包含多個表皮生長因子樣重復(fù)片段和絲氨酸蛋白酶抑制物樣的結(jié)構(gòu)域 ， 在結(jié)構(gòu)上與 TIMPs具有同源性[16-18]。RECKmRNA在人類的各種正常組織和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中廣泛表達(dá) ， 但在癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞中檢測不到或下調(diào)。經(jīng) Pubmed數(shù)據(jù)庫比對 ， RECK部分基因序列與 microRNA-21序列互補結(jié)合。在最近的研究中[19， 20]， RECK被報道是 microRNA-21的功能性靶基因 ， 并參與膠質(zhì)瘤、食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

本文研究結(jié)果顯示， MCF-7、MDA-231及 MDA-435細(xì)胞株中均具有 microRNA-21高表達(dá) ， 且表達(dá)量 MDA-435>MDA-231>MCF-7， 其中 ， 具有高侵襲特性的 MDA-435細(xì)胞具有最高水平 microRNA-21的表達(dá)為 （4.51±0.71）， MDA-231細(xì)胞具有中等水平的 microRNA-21表達(dá)為 （2.67± 0.27）， MCF-7細(xì)胞表達(dá)microRNA-21水平相對較低為 （1.23± 0.11）， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。三株細(xì)胞中， MDA-435細(xì)胞侵襲力最高為 （425.4±35.0）細(xì)胞數(shù) /視野 ， MCF-7最低為（142.7±13.4） 細(xì)胞數(shù) /視野 ， MDA-231居中為 （263.7± 24.4）細(xì)胞數(shù) /視野 ， 三組細(xì)胞侵襲力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。將 anti-microRNA-21分別轉(zhuǎn)染入 MDA-231和 MDA-435細(xì)胞 ， 與對照組比較 ， 兩種細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 anti-microRNA-21后分別引起 56%和 67%的 microRNA-21表達(dá)量降低 ， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。將anti-microRNA-21轉(zhuǎn)染入MDA-231細(xì)胞， 與陰性對照組比較， anti-microRNA-21引起了 34%細(xì)胞侵襲數(shù)目的減少。將 anti-microRNA-21轉(zhuǎn)染入 MDA-435細(xì)胞 ， 結(jié)果表明 anti-microRNA-21引起68%侵襲細(xì)胞數(shù)目的下降。Western blot檢測顯示 ， microRNA-21表達(dá)下調(diào) ， MDA-435細(xì)胞中 RECK表達(dá)明顯增強；熒光素酶實驗顯示共轉(zhuǎn)染 RECK和 anti-microRNA-21的 MDA-435細(xì)胞熒光酶活性增加38%。microRNA-21高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞侵襲特性相關(guān) ， 因此假設(shè) RECK在乳腺癌中也是 microRNA-21的一個重要靶點。經(jīng) Western blot和熒光素酶實驗顯示 ， microRNA-21表達(dá)下調(diào)與 RECK蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān) ， 在MDA-435細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 RECK 3UTR和 anti-microRNA-21導(dǎo)致了顯著性熒光報告基因活性的增加。這些發(fā)現(xiàn)提示 RECK可能部分受到 microRNA-21的負(fù)性調(diào)控。

綜上所述 ， microRNA-21在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)增高并與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān) ， RNA干擾 microRNA-21的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲。這些作用可能部分通過 microRNA-21靶向調(diào)控RECK而產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)

[1] 李強 ， 王興武 ， 宋寶 . microRNA-21對乳腺癌 MCF-7/ADR細(xì)胞株多柔比星耐藥性影響的研究 . 中華腫瘤防治雜志 ， 2012， 19（3）：188-191.

[2] Ozgun A， Karagoz B， Bilgi O， et al. MicroRNA-21 as an indicator of aggressive phenotype in breast cancer.Onkologie， 2013， 36（3）：115-118.

[3] Calin GA， Sevignani C， Dumitru CD， et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. ProcNatlAcadSci USA， 2004， 101（9）：2999-3004.

[4] Yin-Hsun F， Chao-Liang W， Chao-Jung T， et al. Deregulated expression of sprouty2 and microRNA-21 in human colon cancer： Correlation with the clinical stage of the disease. Cancer Biology & Therapy， 2011， 11（1）：111-121.

[5] Rabien A， Ergun B， Erbersdobler A， et al. RECK overexpression decreases invasive potential in prostate cancer cells. Prostate， 2012， 72（9）：948-954.

[6] Meng N， Li Y， Zhang H， et al. RECK， a novel matrix metalloproteinase regulator. HistolHistopathol， 2008， 23（8）：1003-1010.

[7] Ciafre SA， Galardi S， Mangiola A， et al. Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma.BiochemBiophys Res Commun， 2005， 334（4）：1351-1358.

[8] Wang N， Zhang CQ， He JH， et al. MiR-21 down-regulation suppresses cell growth， invasion and induces cell apoptosis by targeting FASL， TIMP3， and RECK genes in esophageal carcinoma. Dig Dis Sci， 2013， 58（7）：1863-1870.

[9] 姜濤. 抑制microRNA-21表達(dá)降低結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的實驗研究. 天津醫(yī)科大學(xué)， 2011.

[10] 劉文新， 李月峰， 朱小蘭， 等. miR-21對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響. 江蘇醫(yī)藥， 2014， 40（17）：1998-2001.

[11] 田俊梅， 涂真珍， 顧月清. MicroRNA-21表達(dá)調(diào)控研究. 藥物生物技術(shù)， 2012（1）：65-69.

[12] 晁振華. 二甲雙胍對乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及miR-625的調(diào)控作用. 蚌埠醫(yī)學(xué)院， 2014.

[13] 馬海忠. MiR-221/222調(diào)控基底樣乳腺癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移的研究. 蘭州大學(xué)， 2014.

[14] 李秀. miRNA-21在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其功能研究. 西北大學(xué)， 2012.

[15] 劉振. MicroRNA-21通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的研究. 安徽醫(yī)科大學(xué)， 2014.

[16] 王金淼， 姜濤， 戚峰， 等. 抑制microRNA-21表達(dá)降低HCT-116細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的實驗研究. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2016（1）：13-16.

[17] 廣維， 尹新江， 何春滌. MicroRNA-21在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的研究現(xiàn)狀. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志， 2014， 30（2）：87-91.

[18] 吳子晏. MicroRNA-21在骨肉瘤生物學(xué)行為作用機制中的研究. 華中科技大學(xué)， 2011.

[19] 韓艷慶. 裸鼠人結(jié)腸癌種植瘤miRNA--21相關(guān)調(diào)控基因的實驗研究. 天津醫(yī)科大學(xué)， 2012.

[20] 邱芳， 李晶. 抑制miR-21表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231生存和凋亡的影響. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2011， 32（6）：691-693.

[收稿日期：2016-02-16]