大劑量維生素D3補充對糖尿病大鼠胰島及肌肉細胞組織學的影響

竇曉娟，汪求真，郝海波，郭玉妹，藺瑞函，馬愛國

(青島大學醫(yī)學院，山東青島　266000)

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大劑量維生素D3補充對糖尿病大鼠胰島及肌肉細胞組織學的影響

竇曉娟，汪求真，郝海波，郭玉妹，藺瑞函，馬愛國

(青島大學醫(yī)學院，山東青島266000)

摘要：目的：探討大劑量維生素D3補充對糖尿病(DM)大鼠Lee’s指數(shù)及胰島、肌肉細胞組織學的影響。方法：高糖高脂喂養(yǎng)結(jié)合注射鏈脲佐菌素的方法制備DM模型，不同濃度的維生素D3灌胃6w，HE染色觀察胰島和肌肉形態(tài)。結(jié)果：125倍和200倍維生素D3組大鼠Lee’s指數(shù)比DM組明顯升高。各維生素D干預組胰島和骨骼肌組織學形態(tài)明顯改善。結(jié)論：適量維生素D3補充能增加DM大鼠Lee’s指數(shù)，恢復異常的胰島和肌肉形態(tài)。

關(guān)鍵詞：糖尿病；維生素D3；Lee’s指數(shù)；肌肉；胰島細胞

糖尿病(DM)是一種由于胰島素分泌和(或)作用缺陷引起的慢性代謝紊亂性疾病，無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，其患病率都有逐年升高的趨勢，已成為日益增長的全球性公共衛(wèi)生問題[1]。研究表明，DM患者除了心臟、腎臟、視網(wǎng)膜等器官組織的損傷外，還可導致各種類型的胰腺和肌肉損傷。DM存在著進行性胰島β細胞功能惡化和胰島萎縮，有報道稱，DM患者胰島β細胞功能比正常人降低50%，胰島細胞數(shù)量降低60%[2，3]，說明胰島功能缺陷在DM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。DM患者消耗大量脂肪和蛋白質(zhì)，肌肉組織不能正常利用葡萄糖和有效釋放能量，體重和Lee’s指數(shù)明顯降低，同時機體組織失水和電解質(zhì)失調(diào)，可能還存在著肌肉組織自身的病變，因此對DM患者進行胰島β細胞功能的干預，恢復體重和肌肉功能可能延緩DM的發(fā)生發(fā)展，并減少其并發(fā)癥[4，5]。

維生素D是一種重要的調(diào)節(jié)鈣磷平衡和脂質(zhì)代謝的激素，維生素D3是其最常見的一種形式[6]。近年來有研究證明，維生素D除了這些常見的功能以外，還具有一些其他的重要功能，如調(diào)控胰島素抵抗和增加體重等。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人群中維生素D受體基因的多態(tài)性與DM的發(fā)生存在一定相關(guān)性，且DM患者血清中活性維生素D3水平顯著低于正常人群[7]。目前，關(guān)于大劑量維生素D3補充對DM患者體重及肌肉和胰島組織學形態(tài)影響的研究鮮有報道。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑和儀器

SPF級雄性SD大鼠100只，體重180～220g之間(山東省魯抗制藥公司提供，合格證為soxk 魯20130001)；膽固醇、膽鹽(河南平頂山生物制品公司)；STZ(美國sigma公司)；血糖儀和試紙(Contour TS，日本拜耳保健有限責任公司)；維生素D3(青島雙鯨公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2糖尿病大鼠模型制備及維生素D干預

SD大鼠適應性喂養(yǎng)1w后隨機分為2組：對照組(12只)和糖尿病造模組(88只)。大鼠飼養(yǎng)在籠中，每籠5～6只，保持度在25℃左右，每天光照12h，自由采食和飲水，每周準確稱量大鼠體重。對照組大鼠喂養(yǎng)不含維生素D的基礎(chǔ)飼料、造模組大鼠喂養(yǎng)不含維生素D的高糖高脂飼料(含68.5%的基礎(chǔ)飼料、20%的蔗糖、10%的豬油、1%的膽固醇及0.5%的膽鹽)。喂養(yǎng)4w后，造模組空腹腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg體重、對照組空腹注射檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg 體重，注射后24h和72h測大鼠空腹血糖，2次空腹血糖均>11.1 mmol/L且大鼠出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿和體重減輕癥狀為造模成功[8]。在本研究中，88只大鼠中造模成功80只，造模成功率為91%。造模成功后，所有的大鼠均保持與之前相同的飲食。將造模成功的80只大鼠隨機分為5組，每組16只。6組大鼠給予不同劑量的維生素D連續(xù)灌胃6w，對照組N和糖尿病模型組DM組，給予生理劑量的維生素D(36 IU /kg體重)，5N、25N、125N和200N組分別給予5、25、125、200倍生理劑量的維生素D，劑量分別為180、900、4 500和7 200IU/kg體重。實驗結(jié)束時，各組大鼠的數(shù)量為N組12只、DM組14只、5N組13只、25N組14只、125N組15只、200組15只。

1.3檢測指標和方法

1.3.1體重、Lee’s指數(shù)及血清25(OH)D大鼠飼養(yǎng)期間，每周準確稱量大鼠體重。處死大鼠后，用皮尺量取大鼠的體長，計算Lee’s指數(shù)，計算方法為：[體重(g)×103/體長(cm)]1/3。連續(xù)灌胃第6w末，清晨空腹經(jīng)水合氯醛麻醉后處死。經(jīng)腹主動脈取大鼠全血5mL，離心后取上層血清，血清25(OH)D采用放射免疫法檢測。

1.3.2大鼠胰島及肌肉組織病理切片分離大鼠的胰腺和肌肉置于固定液中，采用HE染色的方法制備大鼠胰腺和肌肉組織切片，顯微鏡下觀察胰腺和肌肉組織學的形態(tài)。

1.4統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)兩兩比較用LSD方法進行，以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果與分析

2.1DM大鼠造模情況

在本研究中，造模的大鼠共有88只，造模成功的有80只，造模成功率為91%。

2.2維生素D3干預后各組大鼠血清25(OH)D 濃度

維生素D3干預6w后，25N、125N和200N組大鼠血清25(OH)D濃度明顯高于N組和DM組(P<0.05)，并呈現(xiàn)明顯劑量—效應關(guān)系(表1)。

表1　各組大鼠25(OH)D 濃度

注：a與N組相比，P<0.05；b與DM組相比，P<0.05。

2.3維生素D3干預對大鼠體重和Lee’s指數(shù)的影響

從第5w注射STZ后DM組大鼠體重較N組明顯降低(P<0.05)。用維生素D3灌胃后，與DM組相比，125N組體重有明顯的增長(P<0.05)，接近于正常水平，說明每日補充125倍生理劑量的維生素D3可顯著增加DM大鼠的體重。大鼠Lee’s指數(shù)見表2，DM組大鼠比N組明顯降低(P<0.05)，用維生素D3灌胃后，125N和200N組大鼠Lee’s指數(shù)明顯升高，與DM組相比，差異統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，125N組接近于正常水平。

表2　各組大鼠Lee′s指數(shù)

注：a與N組相比，P<0.05；b與DM組相比，P<0.05。

2.4各組大鼠胰島及肌肉組織學形態(tài)

圖1中N組大鼠的胰腺組織染色(×200)顯示，正常組胰島細胞成團索狀分布，形態(tài)正常，胞漿豐富，染色淡，細胞核清晰可見，呈圓形，位于中央。DM組大鼠胰島細胞明顯減少，體積減小，失去正常形態(tài)，核溶解或固縮，細胞營養(yǎng)不良或腫脹。5N、25N、125N和200N組大鼠胰島細胞體積比DM組增大，胰島細胞數(shù)目增多，細胞形態(tài)比DM組明顯好轉(zhuǎn)，其中，5N、25N、125N組更明顯。

圖2顯示，N組大鼠肌肉組織HE染色(×200)肌纖維飽滿，平行排列呈束狀，可見明暗相間的條紋，肌漿均勻，細胞核排列整齊。DM組大鼠肌纖維束明顯變窄薄弱，間隔變大，肌漿不均勻，細胞核排列紊亂，肌細胞萎縮變小，細胞間隙變大，顯示肌肉萎縮。經(jīng)維生素D3干預后，與DM組相比，5N、25N、125N和200N組大鼠肌纖維束變厚，間隙變窄，肌細胞明顯增大，說明VD3干預能緩解DM大鼠肌肉萎縮的狀況。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，適量的維生素D3補充能夠增加DM大鼠體重，并對DM大鼠異常的肌肉和胰島組織學形態(tài)起到改善作用。盡管國內(nèi)外已有一些有關(guān)維生素D補充對DM影響的報道，但其對DM影響的劑量-效應關(guān)系的研究很少，因此很難確定維生素D對DM的最佳作用劑量。Hyoung-Jun 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)12w攝入維生素D 1 200 IU/d，對2型DM老年女性的去脂體重沒有顯著影響，而Robin M 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，每日攝入維生素D增加到2 000IU時，可以改善老年2型DM患者對血糖的控制，改善身體成分并增強心血管健康，這說明低劑量的維生素D補充對DM患者或維生素D缺乏的患者作用不大，維生素D只有在高劑量時才能對DM患者發(fā)揮作用。因而在本研究中，生理劑量的維生素D(36IU/kg 體重)用于N組和DM組，5倍生理劑量的維生素D用于5N組，此劑量也是維生素D的可耐受最高攝入量(UL，成年人為 2 000IU/d、大鼠為180IU/d/kg體重)，其他劑量分別為25倍(900IU/kg體重)、125倍(4 500IU/kg體重)和200倍(7 200 IU/kg體重)[11]。

維生素D進入機體后，在肝臟中轉(zhuǎn)化為25(OH)D，在腎臟進一步羥化成為維生素D的活化形式1，25(OH)2D3。由于25(OH)D在血中含量相對較高，半衰期長，較1，25(OH)2D3更穩(wěn)定，因此目前臨床上普遍通過測定血中25(OH)D的水平來反映機體維生素D儲備情況。Lee’s指數(shù)是目前在評價成年大鼠肥胖程度方面的有效指數(shù)。有研究表明，維生素D可以調(diào)節(jié)能量代謝[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)6w每天攝入125倍和維生素D可以增加DM大鼠的體重和Lee’s指數(shù)，并使其接近正常大鼠水平，連續(xù)6w每天攝入200倍維生素D也可以增加大鼠的Lee’s指數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可以通過作用于呼吸鏈能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，影響細胞能量代謝，糾正高糖負荷造成的細胞能量代謝紊亂，繼而使細胞發(fā)揮正常功能[13]。

圖1　各組大鼠胰島組織學形態(tài)

圖2　各組大鼠的肌肉組織學形態(tài)

本研究發(fā)現(xiàn)，在病理學上，DM模型組大鼠肌肉和胰腺組織損傷加重，明顯大于正常對照N組。大劑量的維生素D3干預下大鼠肌肉和胰腺組織，其損傷都明顯小于DM模型組，說明維生素D3對DM大鼠的肌肉和胰腺具有保護作用。DM患者常會有“糖尿病肌病”，即表現(xiàn)為四肢軟弱無力，肌肉酸痛等癥狀，嚴重者甚至出現(xiàn)肌肉萎縮，可能是由于周圍神經(jīng)病變、代謝障礙和微血管病變等所致的一系列復雜的病理過程。Curry等[14]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D嚴重缺乏的兔肌肉中肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)ATP-依賴的Ca2+攝取孤立小泡比VD充足的兔明顯減少，在預先補充維生素D后，該結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。1，25(OH)2D3可以通過Ca-ATPase向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)轉(zhuǎn)運Ca2+，在維生素D缺乏的動物中，肌細胞內(nèi)重要的收縮蛋白肌動蛋白和肌鈣蛋白C的水平降低，給予維生素D治療后上述蛋白的表達量恢復正常，由此可見，維生素D可以改善異常的肌肉形態(tài)。胰島素(INS)主要由胰島β細胞分泌，能提高肝臟和肌肉組織攝入葡萄糖(GLU)，促進GLU進入肌肉組織細胞內(nèi)。在INS缺乏的時候，進入組織的GLU減少，肝糖原的分解和異生增強，由肝臟釋放入血的GLU增加，血糖水平升高，超過腎糖閾會從尿中排除，表現(xiàn)為DM[15]。大量臨床觀察發(fā)現(xiàn)，DM發(fā)病是一個長期的胰島β細胞慢性損傷與凋亡過程[16]。臨床流行病學調(diào)查和細胞層次的實驗研究發(fā)現(xiàn)，DM患者口服維生素D3有助于保護胰島β細胞的功能，減少急性高糖刺激引起的β細胞的損傷，改善DM并發(fā)癥[17]。郭麗萍[18]等研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3可通過調(diào)控細胞內(nèi)外鈣離子濃度影響胰島細胞中的INS表達分泌情況。INS的分泌依賴于β細胞內(nèi)外鈣離子濃度及β細胞內(nèi)鈣信號通路的活化，而活性維生素D3對于鈣信號通路的激活意義重大。

在本研究中，我們應用了從生理劑量到200倍生理劑量較大范圍內(nèi)的不同水平維生素D補充，國內(nèi)外尚未見類似報道，同時，在造模時我們得到了一個高達91%的成模率，但是此研究是針對大鼠的，其研究結(jié)果不能直接推及到人。本研究為大劑量維生素D3干預對能量代謝及肌肉和胰腺組織的影響提供了重要的科學依據(jù)，其機制有待進一步的深入研究?！?/p>

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(責任編輯李婷婷)

基金項目：國家自然科學基金(項目編號：81472983)。

作者簡介：竇曉娟(1989—)，女，碩士，研究方向：營養(yǎng)流行病學。

通訊作者：汪求真(1971—)，女，博士，碩士生導師，研究方向：營養(yǎng)流行病學。

Influence of High Dosage of Vitamin D3Supplementation on Islet and Muscle Histology Morphology in Diabetic Rats

DOU Xiao-juan，WANG Qiu-zhen，HAO Hai-bo，GUO Yu-mei，LIN Rui-han，MA Ai-guo

(College of Public Health，Qingdao University，Qingdao 266000，China)

Abstract：ObjectiveTo discuss the influence of high dosage of vitamin D3supplementation on Lee’s index， islet，and muscle histology form in diabetic rats.MethodWe established diabetic rats models by intraperitoneally injection streptozocin based on high-fat diet.The rats were divided into 6 groups and supplemented with four different high doses of vitamin D3 for 6 weeks，islet muscles morphology were observed by HE staining.ResultTotally 125 times vitamin D3 supplementation could increase the Lee’s index of diabetic rats when compared with DM group.Islet and muscles morphology were obviously improved in vitamin D3 supplementation group.ConclusionModerate vitamin D3 supplementation could increase the weight of diabetic rats and recover abnormal morphology of islet and muscles.

Keywords：diabetes mellitus(DM)；vitamin D3；Lee’s index；muscle；islet