巨片形吸蟲病快速診斷膠體金免疫層析試條的研制與評價

周　巖，許學(xué)年，程　娜，劉榆華，孔令穎,姚愷齡，石　峰，張建國，Peter Chun，羅家軍

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巨片形吸蟲病快速診斷膠體金免疫層析試條的研制與評價

周巖1，許學(xué)年1，程娜1，劉榆華2，孔令穎3,姚愷齡3，石峰1，張建國4，Peter Chun3，羅家軍2

1.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲病病原與媒介生物學(xué)重點實驗室心，世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心，上海200025；;2 大理州血吸蟲病防治研究所，大理671000；;3 益思美詮生物科技(上海)有限公司，上海201206；;4 賓川縣血吸蟲病防治站，賓川671600

摘要：目的建立快速、簡便診斷巨片形吸蟲病的膠體金免疫層析試條方法。方法提取巨片形吸蟲總RNA，通過RT-PCR獲得FgCL1-YN基因片段，并克隆入pET28a(+)表達載體，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達得到重組蛋白(rFgCL1-YN)；將rFgCL1-YN和羊抗鼠IgG抗體分別包被于硝酸纖維素膜的適宜位置作為檢測帶和質(zhì)控帶，以膠體金標(biāo)記抗人IgG4抗體的鼠單抗作為檢測試劑，制備檢測特異性IgG4型抗體的免疫層析試條。用該試條檢測巨片形吸蟲病患者(30份)、日本血吸蟲病患者(15份)以及健康人(32份)血清，評價其診斷價值，同時用ELISA法進行平行檢測作為對照。結(jié)果試條檢測法的敏感性為100%(30/30)，特異性為97.9%(46/47)，總體符合率為98.7%(76/77)。ELISA法檢測的敏感性、特異性和總體符合率分別100%(30/30)、100%(47/47)和100%(77/77)。試條法與ELISA法的敏感性、特異性和總體符合率，經(jīng)四格表確切概率法檢驗，P值分別為1、0.5和0.5，全部大于0.05。顯示，試條法與ELISA法檢測巨片形吸蟲病患者血清的結(jié)果高度一致。另外，試條法的檢測時間為10 min，血清用量低于10 μL，且具較高的敏感度。結(jié)論以rFgCL1-YN建立的快速診斷膠體金免疫層析試條，檢測巨片形吸蟲病具有較高的診斷價值。

關(guān)鍵詞：巨片形吸蟲病；組織蛋白酶L1；免疫層析試條；ELISA；診斷

The forth round of Three-Year Public Health Action Plan (2015-2017)

巨片形吸蟲病是由巨片形吸蟲(Fasciolagigantica)感染引起的一種人獸共患寄生蟲病[1-3]。2011年底，在云南省大理白族自治州賓川縣暴發(fā)人體巨片形吸蟲病，發(fā)病人數(shù)約30人，由于之前我國巨片形吸蟲病多為散發(fā)，對該病缺乏了解，導(dǎo)致病因查找歷經(jīng)數(shù)月之久，給患者及家屬帶來極大痛苦及經(jīng)濟損失[4-10]。因此，建立合適的巨片形吸蟲病診斷方法，滿足臨床快速診斷和現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查的需要是當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)的糞便蟲卵檢測是診斷巨片形吸蟲病的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于急性期和異位感染病人無法在糞樣中查獲蟲卵、慢性期病人蟲體間歇性排卵的特點易導(dǎo)致漏診[11-12]。免疫學(xué)診斷，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)現(xiàn)已廣泛用于片形吸蟲病的輔助性診斷檢測，如血清抗體檢測取得了良好效果[13-15]。其中組織蛋白酶L1，作為一種具有診斷潛力的檢測抗原被廣泛用于抗體檢測[16-17]。Wongkham C等利用重組的組織蛋白酶L1檢測患者血清內(nèi)的IgG4型特異性抗體，其敏感性和總符合率分別為100%、99.3%[18]。O′ Neill SM等使用天然CL1作為診斷抗原檢測血清中特異性IgG4型抗體，相對于肝片形吸蟲病患者，與其它病人血清反應(yīng)均成陰性[19]。Raina OK等利用重組的28 kDa FgCL1蛋白作為抗原在動物血清學(xué)診斷上具有很好效果[20]。但是ELISA方法檢測步驟繁瑣、耗時長、需要專門設(shè)備等缺點，難以在現(xiàn)場快速應(yīng)用。近年來采用金標(biāo)免疫層析法進行寄生蟲病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷，顯示其簡單、微量、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟的特點，只須短時間培訓(xùn)現(xiàn)場人員即可操作，特別適合在基層和現(xiàn)場使用，是一種極有應(yīng)用前景的診斷手段。本研究采用巨片形吸蟲FgCL1-YN重組抗原(rFgCL1-YN)，利用rFgCL1-YN的高抗原反應(yīng)性以及IgG4 型抗體檢測的高特異性，研制了膠體金免疫層析試條，檢測巨片形吸蟲病患者血清中的IgG4型特異性抗體，并評價了其診斷價值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1巨片形吸蟲成蟲巨片形吸蟲成蟲采自云南省大理州賓川縣自然感染巨片形吸蟲牛的肝膽管，蟲體經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，用生理鹽水沖洗洗凈后，直接放在凍存管中于液氮中保存?zhèn)溆?，后再?jīng)cox1、ITS1-2間隔區(qū)和nad1分子鑒定，確認為巨片形吸蟲。

1.1.2血清樣品巨片形吸蟲病患者血清30份，采自云南省大理州賓川縣暴發(fā)病例，健康人血清32份，由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所健康教育咨詢檢測中心提供，日本血吸蟲病患者血清15份，采自安徽省。

1.1.3表達載體大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)和原核表達載體pET28a(+)由本實驗室保存。

1.1.4膠體金免疫層析試條的制備試條由上海益思美詮生物科技上海有限公司制備。其制作方法為以塑料板為底板，用黏合劑將硝酸纖維素膜(NCM)貼于底板的中間，再將吸水膜和試劑墊分別粘貼于NCM的縱向兩端，吸水膜與NCM 以及NCM與試劑墊在其交界處有重疊連接。在NCM與試劑墊的連接處粘貼膠紙用作控流。在NCM的近吸水膜處，橫向地以線形包被羊抗鼠IgG抗體，作為質(zhì)控(Control，C)帶；在NCM的近試劑墊處，橫向地以線形包被復(fù)性后的rFgCL1-YN(濃度0.25 μg/mL)作為檢測(Test，T)帶、3.5 mm寬切條。

鼠抗人IgG4-膠體金結(jié)合物的制備：按文獻[21]方法，用檸檬酸三鈉還原氯金酸，制備顆粒直徑為15 nm的膠體金溶液，按文獻[22]制備鼠抗人IgG4單克隆抗體-膠體金結(jié)合物。

1.1.5主要試劑和工具酶TRIzol試劑、SuperScriptTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen 公司；AxyPrep質(zhì)粒，DNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司；凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A.Ultra-Sep? Gel Extraction Kit)購自美國Omega公司；XhoI、NcoI限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶和小牛腸堿性磷酸酶(CIP)購自美國NEB公司；BugBuster蛋白抽提劑、rLysozyme溶菌酶和Benzonase核酸酶購自美國Novagen公司；Ni-NTA樹脂購自德國Qiagen公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgG4單克隆抗體、制備膠體金的鼠抗人IgG4單克隆抗體均購自美國SouthernBiotech公司；羊抗鼠IgG抗體購自美國Sigma公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自天根(北京)生化科技有限公司；酶標(biāo)板(96孔板)購自丹麥Nunc公司；氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜購自德國Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1Total RNA的提取用Invitrogen公司TRIzol試劑提取巨片形吸蟲成蟲Total RNA，-80 ℃保存。用紫外分光光度計測出RNA樣品的濃度。

1.2.2RT-PCR根據(jù)FgCL1(AF112566)核苷酸序列，合成下列引物，逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CGTGCCACCATCG-3′，PF：5′-CATGCCATGGGCTCGAATGATGATTTGTGG-3′，PR: 5′-CCGCTCGAGAC

TGGCCAGCGAAGCA-3′(由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成)，使用SuperScriptTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄，所得的cDNA作為模板，進一步PCR擴增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火58 ℃ 1 min，復(fù)性72 ℃ 2 min，循環(huán)30次，最后一個循環(huán)復(fù)性延長至7 min，樣品4 ℃保存。

1.2.3rFgCL1-YN 表達載體的構(gòu)建上述PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收的目的片段和pET28a(+)表達載體質(zhì)粒分別經(jīng)NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切，使用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α擴增后提取質(zhì)粒，測序(由華大基因研究中心測序)驗證插入序列。獲得rFgCL1-YN重組表達質(zhì)粒。

1.2.4重組蛋白的表達、純化及復(fù)性將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行表達，按照組氨酸標(biāo)簽蛋白表達和純化試劑盒(Qiagen 公司)操作說明進行變性方式純化目的蛋白。使用BugBuster?蛋白抽提劑、rLysozyme溶菌酶和Benzonase核酸裂解酶表達細菌，用組氨酸標(biāo)簽親和純化柱(Ni NTA樹脂)純化表達產(chǎn)物，使用含不同pH值的洗脫液洗滌樹純化脂重組蛋白。行12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)，檢測重組蛋白的純化情況。

收集合并洗脫液，用含50 mmoL Tris·HCl，1 mmol EDTA，DTT 0.15 g/L，甘油100 ml/L的透析buffer，分別配制成含6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、0 mol/L尿素(pH 8.0)梯度的透析液，逐級透析。透析結(jié)束后，取出透析袋內(nèi)樣品，4 ℃離心，10 000 r/min，離心10 min。收集上清，取樣進行12%的SDS-PAGE電泳分析，蛋白濃度的測定參考Bradford方法，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5試條的使用和評判采用動力流體型血清學(xué)檢測方法。將2滴(80 μL)膠體金試劑加入試劑墊，待膠體金試劑進入NCM后，將7 μL待測血清加于控流膠紙端的NCM處。僅出現(xiàn)C線者判為陰性，出現(xiàn)C和T線者判為陽性，無C線者判為無效。檢測結(jié)果均在10 min內(nèi)判斷。

1.2.6間接ELISA方法檢測血清中的抗體參照文獻[23]進行，并做適當(dāng)調(diào)整。以復(fù)性后的重組抗原為包被抗原，包被濃度為0.5 μg/mL，每孔包被量為100 μL，4 ℃過夜，甩干，加入200 μL PBST (含1% 的BSA) 37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次，5 min/次。血清樣本用PBST (含1% 的BSA) 進行稀釋，稀釋度為1∶200作為一抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h，PBST洗滌3次，5 min/次。HRP-鼠抗人IgG4作為二抗(工作濃度為1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌4次，5 min/次。加入100 μL/孔TMB后，測定吸光度(A450)值。以32個健康者血清的A450均值加上4個標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性閾值，每一受檢樣本的A450大于或等于此閾值為陽性。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 11.0軟件對各種方法的檢測結(jié)果進行四格表確切概率法檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1FgCL1-YN基因的克隆根據(jù)AF112566的序列特征，設(shè)計了逆轉(zhuǎn)錄引物和正反向PCR引物。RT-PCR擴增結(jié)果如圖1所示?？寺∑伍L度為915 bp，GenBank登錄號：KT713623。

2.2FgCL1-YN重組抗原蛋白的表達和純化使用T4DNA連接酶，將目的片段和載體片段進行連接，構(gòu)建成rFgCL1-YN原核表達質(zhì)粒。在1 mmol/L的IPTG 條件下37 ℃誘導(dǎo)4 h。在34 kD處可見明顯的重組蛋白條帶，該重組蛋白主要在沉淀(包涵體)中表達。用Ni-NTA樹脂純化重組蛋白。使用變性純化方法將得到的重組蛋白，再行透析復(fù)性。結(jié)果如圖2所示。

2.3試條法和ELISA法檢測結(jié)果以rFgCL1-YN為檢測抗原的試條檢測法，其敏感性為100%(30/30)，特異性為97.9%(46/47)，總體符合率為98.7%(76/77)。使用rFgCL1-YN以間接ELISA方法檢測血清中的特異性抗體。巨片形吸蟲病患者、健康人對照組、日本血吸蟲病患者的A450值的平均值分別為0.275±0.217、0.004±0.005、0.010±0.004。ELISA法檢測的敏感性、特異性和總體符合率分別100%(30/30)、100%(47/47)和100%(77/77)。試條法與ELISA法的敏感性、特異性和總體符合率，經(jīng)四格表確切概率法檢驗，P值分別為1、0.5和0.5，全部大于0.05。顯示，試條法與ELISA法檢測巨片形吸蟲病患者血清的結(jié)果高度一致，結(jié)果見表1。

Marker: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：FgCL1-YN RT-PCR擴增結(jié)果

Marker: DNA marker; 1: RT-PCR product of FgCL1-YN.

圖1FgCL1-YN RT-PCR 擴增凝膠電泳分析圖

Fig.1Agarose gel electrophoresis analysis of RT-PCR product of FgCL1-YN

Marker：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化復(fù)性后的rFgCL1-YN；2：未誘導(dǎo)全細胞；3：誘導(dǎo)全細胞；4：誘導(dǎo)全細胞裂解上清；5：誘導(dǎo)全細胞裂解沉淀

Marker: protein marker; 1: purified rFgCL1-YN with renaturation; 2: noninducedE.colicell lysate; 3: inducedE.colicell lysate; 4: inducedE.colicell lysate supernatant; 5: inducedE.colicell lysate precipitate.

圖2rFgCL1-YN重組蛋白表達及純化的SDS-PAGE電泳分析

Fig.2Evaluation on the immunoreactivity of rFgCL1-YN by SDS-PAGE

用倍比稀釋的巨片形吸蟲病患者混合血清，檢測試條的靈敏度，起始血清量(每mm膜寬)為2 μL，逐級倍半減至0.016 μL，1-5號試條(每mm膜寬血清量分別為2 μL、1.0 μL、0.5 μL、0.25 μL和0.125 μL)呈陽性。顯示本試條具有較高的靈敏度，見圖3。

表1試條法和ELISA法檢測寄生蟲病患者和健康人血清

Tab.1Detection results of the sera from different patients and healthy donors using immunochromatographic strip test and ELISA

血清Serum檢測例數(shù)No.ofcasedetected陽性數(shù)No.ofcasepositive試條法GICAELISA法ELISA巨片形吸蟲病fascioliasisgigantic303030血吸蟲病schistosomiasis1500健康者healthydonors321(無法判別)0合計total773130

1-8：血清量倍半遞減的試條檢測結(jié)果; C：質(zhì)控帶;T：檢測帶

1-8: pooled positive sera;C: control line; T: test line.

圖3 免疫層析試條靈敏度檢測

Fig.3Sensitivity of the detection limit of the immunochromatographic strip test

3討論

金標(biāo)免疫層析法是一種快速、實用的診斷方法。以微孔濾膜為固相載體，抗原抗體在膜上結(jié)合，滲濾濃縮促進反應(yīng)，再以膠體金作為指示劑直觀顯色。本研究結(jié)合CL1的高抗原反應(yīng)性優(yōu)勢和免疫層析試條的簡便、快捷的特點，研制了巨片形吸蟲病的膠體金免疫層析試條，并通過ELISA法平行檢測驗證了該試條的診斷價值。實驗表明，該試條具有較高的敏感性和特異性，以及較高的靈敏度。通過目測定性結(jié)果能夠快速判讀，并能以極低的檢測極限，檢測微量陽性感染血清中的特異性抗體。

利用天然或重組的組織蛋白酶L1作為診斷抗原，已成為診斷巨片形吸蟲病的標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)診斷方法之一。組織蛋白酶L1屬于半胱氨酸蛋白酶類，在片形吸蟲童蟲和成蟲階段都有表達，宿主感染2-4周后體內(nèi)即可檢測到抗體[24-25]，可作為巨片形吸蟲病早期診斷抗原，在該病的診斷中有重要意義。

研究還表明ELISA法檢測IgG4型特異性抗體相比檢測所有亞型IgG抗體，具有更高的特異性[26]。本研究在試條研制過程中，曾使用該重組抗原建立了檢測IgG的免疫層析試條，但為數(shù)不少的日本血吸蟲病患者和健康人血清出現(xiàn)假陽性(實驗數(shù)據(jù)未列出)，其效果遠不及檢測IgG4的免疫層析試條。另外，鑒于巨片形吸蟲和肝片形吸蟲的CL1同源性高達95%以上，推測本研究研制的試條或許可用來檢測人體肝片形吸蟲病，但需進一步實驗驗證。

Victoria MS等[27]使用肝片形吸蟲的FhCL1重組蛋白研制的LFIA試條，用于檢測人體肝片形吸蟲病具有良好的診斷價值，該試條尚不確定是否能應(yīng)用于人體巨片形吸蟲病的檢測。該試條使用葡萄球菌蛋白A(SPA)和FhCL1的單抗(mAb-MM3)分別作為檢測帶和質(zhì)控帶，將膠體金與FhCL1結(jié)合作為檢測試劑。由于SPA可與各亞型的IgG結(jié)合，所以LFIA試條檢測血清中的抗體包括所有IgG 亞型。盡管檢測對象均為CL1的抗體，但LFIA試條與本研究研制的試條僅檢測IgG4型抗體相比，有著顯著的不同。

CL1誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的抗體，在治愈后會持續(xù)較長時間，抗體檢測難于區(qū)分治愈病例和現(xiàn)癥病人。在巨片形吸蟲病流行區(qū)進行臨床樣本檢測及大規(guī)模現(xiàn)場調(diào)查中，本試條可作為病例篩查試劑，檢測陽性結(jié)果應(yīng)注意區(qū)分現(xiàn)癥病例與治愈病人。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.003

通訊作者：許學(xué)年,Email：xuxuenian2@163.com

中圖分類號：R383

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0114-05

Corresponding author:Xu Xue-nian, Email: xuxuenian2@163.com

收稿日期：2015-09-11；修回日期:2015-11-21

Establishment and evaluation of colloid gold labeled immuno chromatographic strip test for rapid diagnosis of human fascioliasis gigantica

ZHOU Yan1,XU Xue-nian1,CHENG Na1,LIU Yu-hua2,KONG Ling-ying3,YAO Kai-ling3,SHI Feng1,ZHANG Jian-guo4,Peter CHUN3,LUO Jia-jun2

(1.National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention/Key Laboratory of ParasiteandVectorBiology,MOH/WHOcollaboratingCentreforTropicalDiseases,Shanghai200025,China;2.DaliPrefectureInstituteofSchistosomiasisPreventionandControl,Dali671000,China;3.EASE-MedtrendBiotech(Shanghai),LTD,Shanghai201206,China;4.SchistosomasisControlStationofBinchuanCounty,Binchuan671600,China)

Abstract:To establish and evaluate a colloid gold-immunochromatographic assay (GICA) dynamic flow strip for the diagnosis of human fascioliasis, total RNA was prepared from Fascioliasis gigantica (F. gigantica) collected from Dali, Yunnan Province, China. FgCL1-YN gene was obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The PCR product was sequenced and cloned into pET28a(+) vector. The recombinant plasmid was expressed and induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) to obtain recombinant protein, rFgCL1-YN. The mouse anti-human IgG4 monoclonal antibodies was conjugated with colloid gold as detecting reagent; the rFgCL1-YN and goat anti-mouse IgG antibody were immobilized on nitrocellulose in proper position as test line and control line, separately. The prepared immunochromatographic strip was evaluated using serum samples from fascioliasis gigantica patients (30 cases), schistosomiasis japonica patients (15 cases) and healthy donors (32 cases). Sensitivity detected by the GICA strip test was 100% (30/30). One serum sample from a healthy control was an invalid result with the GICA. Reference sera from schistosomiasis were all negatives for anti- F. gigantica IgG4 antibodies using the GICA. The sensitivity, specificity and total diagnostic coincidence rate of rFgCL1-YN-based the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was 100% (30/30), 100% (47/47) and 100% (77/77) respectively. Comparison between the GICA and the ELISA was made by exact probabilities in 2×2 table analysis. The P value of the total diagnostic coincidence rate, sensitivity and specificity was 1, 0.5 and 0.5, respectively (P>0.05). High degree of agreement was observed between the GICA and ELISA. The detection time of GICA was 10 min, and the serum concentration was less than 10 μL with highly sensitive. The developed immunochromatographic strip test using recombinant FgCL1-YN antigen as coated antigen is a sensitive, simple and rapid assay for diagnosing human fascioliasis.

Keywords:fascioliasis gigantica; cathepsin L1; gold-immunochromatographic assay strip; ELISA; diagnosis

上海市第四輪三年行動計劃項目(GWIV-29)