累積嫁接對黃瓜雌雄花及花粉萌發(fā)的影響

管雪松++李洪巖++歐陽明安

摘要：通過插接法對接穗黃瓜和砧木黑籽南瓜進(jìn)行多次累積嫁接，研究不同嫁接次數(shù)黃瓜雌雄花的生物學(xué)性狀和花粉在不同溫度下萌發(fā)率的變化。結(jié)果表明，巨豐八號黃瓜接穗生長節(jié)間數(shù)分別為2～10節(jié)位、11～20節(jié)位、大于20節(jié)位時，其黃瓜雄花的花梗長、花瓣長、總長和質(zhì)量均顯著高于自根苗，且雄花梗長隨嫁接次數(shù)的增加呈先增加后略降低趨勢，2～10節(jié)位嫁接的花梗比其他更長；盛花期時，嫁接黃瓜的雌花其果梗長、花瓣長和總長顯著大于對照，而子房長度顯著小于對照，2次嫁接的黃瓜子房最短；嫁接的黃瓜花粉萌發(fā)率顯著高于對照，且具有一定耐低溫和高溫特性；10、35 ℃處理下，花粉萌發(fā)率隨嫁接次數(shù)提高而提高。累積嫁接具有一定的性狀累積效應(yīng)，這為嫁接誘變育種提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：累積嫁接；黃瓜；生物學(xué)性狀；花粉萌發(fā)；花梗；節(jié)位

中圖分類號： S642.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0248-04

收稿日期：2015-12-29

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（編號：K1312004C）；福建省重點(diǎn)基金項(xiàng)目（編號：K53150006A）。

作者簡介：管雪松（1989—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，從事嫁接誘變育種研究。E-mail：fafugxs@163.com。

通信作者：歐陽明安，男，研究員，主要從事小分子化合物與生物學(xué)研究。E-mail：maouyang@hqu.edu.cn。植物嫁接技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)中，對提高植物抗生物和非生物脅迫、作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)等有重大意義[1-4]。目前，隨著國內(nèi)外對嫁接嵌合體接穗和砧木間頻繁大量遺傳物質(zhì)交流的深入研究，嫁接可促使不同物種間基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）[5-6]或誘導(dǎo)接穗DNA甲基化[7]，使其具有可遺傳性變異，這為作物遺傳育種提供了新思路和新方法。嫁接是無性繁殖，但大量研究表明，嫁接可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生變異，主要是來自韌皮部RNA的運(yùn)輸調(diào)控作用[8-9]，近年來，在蓖麻、西瓜、擬南芥、甜瓜、黃瓜等植物韌皮液中發(fā)現(xiàn)大量的mRNA，且具有廣泛的功能[10-13]。Xoconostle-Cázares 等在南瓜韌皮液內(nèi)得到第1 個RNA 結(jié)合蛋白CmPP16[14]；同年，Ruiz-Medrano 等以黃瓜為接穗、南瓜為砧木進(jìn)行異源嫁接，結(jié)果表明，CmGAIP、Cmpp16、CmNACP 可從南瓜砧木中被運(yùn)輸?shù)近S瓜接穗[15]。Ham等發(fā)現(xiàn)，CmGAIP、Cmpp16、CmSTMP、CmMybP 可與蛋白CmRBP50一起被運(yùn)輸?shù)近S瓜接穗中，南瓜韌皮部中CmGAIP是能進(jìn)行長距離移動且具有功能的RNA[16]。Haywood等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)野生型番茄為接穗和含南瓜功能缺失突變基因Cmgaip或擬南芥 ΔDELLA-gai轉(zhuǎn)基因番茄為砧木，其接穗葉片形態(tài)也隨之改變[17]。

黃瓜是葫蘆科重要的一種蔬菜，黑籽南瓜是一種對低溫、干旱、土壤貧瘠及瓜類枯萎病等逆境具有較強(qiáng)抗性的葫蘆科草本植物[18]，栽培過程中，常用黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia）作為砧木[19]來提高黃瓜嫁接苗的抗土傳病害、耐鹽脅迫、產(chǎn)量等[20-21]。目前，研究較多的是1次嫁接引起的接穗變異，多次嫁接引起的變異還未見報(bào)道，而且針對黃瓜嫁接的研究主要集中在嫁接的親和性、抗性生理、嫁接植株?duì)I養(yǎng)吸收及果實(shí)品質(zhì)評價等方面[22-24]，關(guān)于累積嫁接對接穗黃瓜雌雄花發(fā)育的生物學(xué)特性和花粉耐低溫、高溫特性的影響研究相對較少。本試驗(yàn)利用巨豐八號黃瓜為接穗、黑籽南瓜為砧木，通過累積嫁接研究接穗黃瓜花在不同嫁接次數(shù)間的差異及花粉在不同溫度下耐低溫、耐高溫特性，以期通過累積嫁接充分利用砧木南瓜的抗性優(yōu)勢，培育出抗生物或非生物脅迫的黃瓜品種，為嫁接誘變育種提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

“巨豐八號”黃瓜、黑籽南瓜種子，均由山東壽禾種業(yè)公司提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1累積嫁接對黃瓜生物學(xué)性狀的影響2014年4月1日，用50～55 ℃水浸泡黑籽南瓜種子（標(biāo)記為HZ）8～12 h，進(jìn)行黑暗下催芽，并播種于Fafard泥炭土上；4 d后，采用同樣方法對巨豐八號黃瓜種子（標(biāo)記為G01）催芽，待黃瓜幼苗2片子葉完全展開，采用宋永海的斜插接法和嫁接后管理方法進(jìn)行嫁接和管理[25]；嫁接3 d內(nèi)保持嫁接苗90%以上的相對濕度，5 d后適度見光，15 d后移植到溫室大棚內(nèi)，盛花期進(jìn)行人工自交授粉，收獲黃瓜種子（標(biāo)記為G02）；以G02為接穗、黑籽南瓜為砧木再次嫁接，進(jìn)行人工自交收獲種子（標(biāo)記為G03）。2015年6月13日，以G01不進(jìn)行嫁接為對照，以G01、G02、G03為接穗，黑籽南瓜為砧木進(jìn)行嫁接，分別標(biāo)記為G01/HZ、G02/HZ、G03/HZ，并移植到大棚內(nèi)進(jìn)行正常生產(chǎn)管理；分別選取25株生長狀況一致的苗，在接穗生長節(jié)間數(shù)分別為2～10節(jié)、11～20節(jié)、大于20節(jié)3個時期和盛花期，于08：00—09：00分別測量G01、G01/HZ、G02/HZ、G03/HZ黃瓜的雄花花梗長、花瓣長、總長、質(zhì)量和雌花的果梗長、子房長、花瓣長、總長，以及不同溫度處理下雄花的花粉萌發(fā)率。計(jì)算公式為：花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100%；雄花總長=花梗長+雄花瓣長；雌花總長=果梗長+子房長+雌花瓣長。

1.2.2累積嫁接對花粉萌發(fā)率的影響盛花期，于開花前 1 d 下午取雄花，分別在4、10、28、30、35、40 ℃下用水瓊脂培養(yǎng)12 h，每個處理10朵雄花，每隔5 d取1次；第2 d上午，挑取花粉于150 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3+11.1 mg/L CaCl2配制而成的液體培養(yǎng)基內(nèi)，同等溫度下萌發(fā)2 h，以花粉管長度大于花粉粒直徑作為花粉萌發(fā)依據(jù)，用光學(xué)顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況，每個觀察視野的花粉粒不少于60粒，每次選擇6個視野，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003繪圖，采用IBM SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1累積嫁接對接穗黃瓜雄花生物學(xué)性狀的影響

2.1.1對接穗黃瓜2～10節(jié)雄花生物學(xué)性狀的影響由圖1、圖2可見，嫁接黃瓜2～10節(jié)位雄花的花梗長、花瓣長、總長、雄花質(zhì)量均顯著高于未嫁接G01；嫁接3代內(nèi)，雄花的花梗長和總長隨嫁接代數(shù)的增加呈先增加后略降低趨勢；花梗長在不同嫁接代數(shù)間差異較大，G02/HZ花梗長達(dá)2.42 cm，比G01、G01/HZ分別提高81.95%、13.61%，G03/HZ花梗長為2.20 cm，比G01、G02/HZ分別提高65.41%、-9.09%，G01/HZ花梗長為2.13 cm，比G01增長60.15%；雄花的花瓣長度在嫁接代數(shù)間無明顯差異，較對照增長幅度為 13.31%～14.39%；嫁接黃瓜G02/HZ、G03/HZ、G01/HZ的雄花總長分別為5.58、5.35、5.31 cm，均顯著大于對照；嫁接黃瓜的雄花質(zhì)量差異不明顯，但顯著高于對照。這說明嫁接可以改善黃瓜2～10節(jié)位雄花的質(zhì)量，2次嫁接顯著優(yōu)于1次嫁接，第3次嫁接略有下降趨勢，可能是由于連續(xù)多代自交會出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。

2.1.2對接穗黃瓜11～20節(jié)雄花生物學(xué)性狀的影響由圖3可見，嫁接黃瓜11～20節(jié)位雄花的花梗長、花瓣長、總長、質(zhì)量相互間無明顯差異，但均顯著高于G01黃瓜；G01/HZ的花瓣長最長，為3.10 cm，其次是G02/HZ，為3.08 cm，G03/HZ在嫁接黃瓜中相對最短，為3.05 cm；雄花總長與花瓣長有相似規(guī)律；G01/HZ的雄花質(zhì)量相對最大，為0.34 g，其次是G03/HZ、G02/HZ，質(zhì)量分別為0.33、0.31 g，對照G01相對最輕，為0.28 g。這說明嫁接可以明顯改善黃瓜11～20節(jié)位間的雄花質(zhì)量。

2.1.3對接穗黃瓜大于20節(jié)雄花生物學(xué)性狀的影響由圖4可見，嫁接黃瓜大于20節(jié)位雄花的花梗長、花瓣長、總長、質(zhì)量相互間無明顯差異，但均顯著高于對照組黃瓜；G03/HZ的花梗長相對最長，為1.51 cm，其次是G02/HZ、G01/HZ，花梗長分別為1.40、1.38 cm，而G01花梗長相對最短，為 0.73 cm；G03/HZ花瓣長相對最長，為3.04 cm，其次為G01/HZ、G02/HZ，均為3.03 cm；G03/HZ雄花的質(zhì)量相對最大，為0.33 g，其次是G01/HZ、G02/HZ，為0.32 g，而對照G01僅為0.29 g。這說明嫁接也可以明顯改善黃瓜大于20節(jié)位的雄花質(zhì)量。

2.1.4對接穗黃瓜雌花生物學(xué)性狀的影響由圖5、圖6可見，嫁接黃瓜的果梗長、雌花花瓣長、總長極顯著大于對照組，而子房長度顯著短于對照組，且G02/HZ的子房相對最短，為3.98 cm；果梗長隨嫁接代數(shù)的增加而增長，G03/HZ相對最長，為3.12 cm，但2次嫁接與3次嫁接的黃瓜果梗長差異不顯著；G01的子房長度相對最長，為 5.04 cm；嫁接1～2代的黃瓜雌花花瓣長顯著長于對照。

2.2嫁接對接穗黃瓜盛花期不同溫度處理花粉萌發(fā)的影響

由圖7可見，4、10、28、30、35 ℃處理12 h的嫁接黃瓜，其花粉萌發(fā)率顯著高于對照組；40 ℃處理的嫁接和對照黃瓜，其花粉萌發(fā)率無明顯差異，幾乎為0%；28 ℃時，花粉體外萌發(fā)率均達(dá)到86%以上，G03/HZ的花粉萌發(fā)率相對最高，為94.40%，其次為G01/HZ、G02/HZ，花粉萌發(fā)率分別為 91.58%、94.03%，對照G01僅為86.32%；嫁接能提高雄花的耐低溫能力，4 ℃下G01/HZ的萌發(fā)率相對最高，為 3.29%，其次為G02/HZ、G03/HZ，萌發(fā)率分別為3.08%、3.01%，G01萌發(fā)率相對最低，為1.93%；10 ℃時，3代嫁接內(nèi)的花粉萌發(fā)率隨嫁接代數(shù)的增加而增大，嫁接3代萌發(fā)率最高，為61.70%，其次為嫁接1、2代，其萌發(fā)率分別為 52.51%、57.77%，而對照僅為41.06%，且均較4 ℃處理有明顯提高；嫁接也能提高花粉的耐高溫性，35 ℃處理時，嫁接3代的雄花花粉萌發(fā)率相對最高，為47.20%，其次為嫁接1、2代，其萌發(fā)率分別為44.39%、43.61%，而對照僅為 39.32%。這說明嫁接可以提高接穗黃瓜花粉的耐高溫和低溫脅迫的能力，對春季黃瓜栽培和夏季黃瓜栽培進(jìn)行嫁接，可提高自然授粉成功率。

3討論與結(jié)論

植物嫁接能改變接穗的生物學(xué)性狀，如葉片、果實(shí)、莖粗、花色等[26]，且部分性狀的改變還具有可遺傳性[27]。苗永美等研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜雄花花器性狀為數(shù)量遺傳，遺傳率相對較高，受環(huán)境影響較小[28]；馬德華等發(fā)現(xiàn)，瓜長、果梗長、瓜粗等也是數(shù)量遺傳性狀[29]。利用多代嫁接方法探究砧木對接穗的累積傳代影響有著十分重要的意義。試驗(yàn)結(jié)果表明，多代嫁接對接穗巨豐八號黃瓜的雌、雄花影響顯著，特別是對雄花花梗長和雌花果梗長、子房長度的影響；嫁接黃瓜的雄花梗長在2～10節(jié)位、11～20節(jié)位、大于20節(jié)位時的變異程度不一致，2～10節(jié)的變異程度均達(dá)到60%以上，嫁接2代達(dá)到82%，嫁接3時略降低，這可能是由于嫁接多次的砧木黑籽南瓜降低了接穗黃瓜的累積作用，在一定程度上具有自交衰退的內(nèi)因；嫁接黃瓜11～20節(jié)位和大于20節(jié)位的雄花花梗長變異程度明顯不如2～10節(jié)位，可能是由于砧木RNA的短距離運(yùn)輸調(diào)控量要比長距離運(yùn)輸量大[30]。另外，隨嫁接代數(shù)的增大，嫁接黃瓜的花瓣長、總長、質(zhì)量呈先增大后降低趨勢，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究；雌花生物學(xué)性狀變化類似于雄花，嫁接黃瓜的果梗長、子房長度、雌花瓣長、總長隨嫁接代數(shù)增加呈先增大后略減小趨勢，其中果梗長、子房長度變化極為明顯，這2個性狀在黃瓜育種中是比較重要的農(nóng)藝性狀[31]；嫁接明顯縮短果實(shí)的長度，果型指數(shù)減小，而嫁接次數(shù)對雌花發(fā)育機(jī)理的影響也有待進(jìn)一步研究。需說明的是，由于巨豐八號黃瓜3次自交花的分離性狀差異不明顯，因此，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以排除自交性狀分離的干擾。

植物耐低溫和耐高溫特性是目前研究的熱點(diǎn)，嫁接對黃瓜接穗的耐低溫和耐高溫特性已有相關(guān)研究[32-33]，但對不同溫度下嫁接是否能提高雄花的花粉萌發(fā)率研究極少。10、35 ℃培養(yǎng)12 h時，與對照相比，嫁接黃瓜花粉的萌發(fā)率顯著提高，分別達(dá)到52.51%、43.61%以上，這對春季和夏季黃瓜栽培及植物花粉低溫保存有一定的理論指導(dǎo)意義。須強(qiáng)調(diào)的是，在鏡檢時，最好確保環(huán)境溫度和花粉處理溫度的一致性，計(jì)數(shù)過程中盡量快速，盡可能減少環(huán)境溫度、光照等因素的影響。

總之，嫁接黃瓜3種不同節(jié)位的雄花生物學(xué)性狀均顯著高于黃瓜自根苗，多次累積嫁接在一定程度上具有優(yōu)勢累積效應(yīng)，其接穗性狀更加趨向于砧木，越靠近嫁接口的花，其生物學(xué)性狀受到誘導(dǎo)變異的可能性越大；嫁接黃瓜果梗長、雌花花瓣長、總長顯著大于對照，而子房長度顯著短于對照；嫁接黃瓜雄花花粉的萌發(fā)率顯著高于對照，耐低溫和高溫性得到明顯提高。累積嫁接研究為嫁接誘變育種提供了基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lee J M. Cultivation of grafted vegetables Ⅰ. current status，grafting methods，and benefits[J]. Hort Science，1994，29（4）：235-239.

[2]Koepke T，Dhingra A. Rootstock scion somatogenetic interactions in perennial composite plants[J]. Plant Cell Reports，2013，32（9）：1321-1337.

[3]張圣平，顧興芳，王燁. 野生棘瓜砧木對黃瓜生長及抗逆性的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2006，33（6）：1231-1236.

[4]Zhang W N，Kollwig G，Stecyk E，et al. Graft-transmissible movement of inverted-repeat-induced siRNA signals into flowers[J]. The Plant Journal 2014，80（1）：106-121.

[5]Fuentes I，Stegemann S，Golczyk H，et al. Horizontal genome transfer as an asexual path to the formation of new species[J]. Nature，2014，511（7508）：232-235.

[6]Tsaballa A，Athanasiadisa C，Pasentsis K，et al. Molecular studies of inheritable grafting induced changes in pepper （Capsicum annuum） fruit shape[J]. Scientia Horticulturae，2013，149：2-8.

[7]Avramidou E，Kapazoglou A，F(xiàn)ilippos A A，et al. Global DNA methylation changes in Cucurbitaceae inter-species grafting[J]. Crop Breeding and Applied Biotechnology，2015，15（2）：112-116.

[8]孫敬爽，李少峰，董辰希，等. 嫁接植物體中RNA分子長距離傳遞研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科學(xué)，2014，50（11）：158-165.

[9]張志宏，張鋒. 園藝植物MicroRNA研究進(jìn)展[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（4）：385-392.

[10]Doering-Saad C，Newbury H J，Couldridge C E，et al. A phloem-enriched cDNA library from Ricinus：insights into phloem function[J]. Journal of Experimental Botany，2006，57（12）：3183-3193.

[11]Omid A，Keilin T，Glass A，et al. Characterization of phloem-sap transcription profile in melon plants[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（13）：3645-3656.

[12]Deeken R，Ache P，Kajahn I，et al. Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments[J]. Plant Journal，2008，55：746-759.

[13]Guo S，Zhang J，Sun H，et al. The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus） and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics，2013，45：51-58.

[14]Xoconostle-Cázares B，Xiang Y，Ruiz-Medrano R，et al. Plant paralog to viral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem[J]. Science，1999，283（5398）：94-98.

[15]Ruiz-Medrano R，Xoconostle-Cazares B，Lucas W J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA：Implications for supracellularregulation in plants[J]. Development，1999，126：4405-4419.

[16]Ham B K，Brandom J L，Xoconostle-Cazares B，et al. A polypyrimidine tract binding protein pumpkin RBP50，forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex[J]. Plant Cell，2009，21：197-215.

[17]Haywood V，Yu T S，Huang N C，et al. Phloem long-distance trafficking of gibberellic acid-insensitive RNA regulates leaf development[J]. Plant Journal，2005，42：49-68.

[18]尹梅，楊明摯，陳善娜，等. 黑子南瓜的抗逆性初探[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，25（增刊1）：131-134.

[19]費(fèi)雨蘭，王晶，沈佳，等. 不同砧木嫁接對黃瓜長勢及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：147-149.

[20]曾義安，朱月林，黃保健，等. 黑籽南瓜砧木對黃瓜生長結(jié)實(shí)、抗病性及營養(yǎng)元素含量的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2004，13（4）：15-19.

[21]田雪梅，魏珉，劉青，等. 不同抗性砧木嫁接黃瓜幼苗對NaCl脅迫的生理響應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，23（1）：147-153.

[22]姜闖，張青，方偉，等. 3種嫁接方法對黃瓜嫁接苗前期生長的影響[J]. 園藝與種苗，2011（6）：4-6.

[23]楊歡歡，李景富. 不同砧木黃瓜/南瓜嫁接愈合過程的解剖學(xué)觀察[J]. 北方園藝，2014（8）：5-8.

[24]劉青，魏珉，沈瓊，等. 不同砧木對嫁接黃瓜蠟粉形成及硅吸收分配的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39（5）：897-904.

[25]宋永海. 黃瓜嫁接技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（20）：145，147.

[26]王燕，謝輝，陳利萍. 植物嫁接誘導(dǎo)的遺傳變異機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2011，33（6）：585-590.

[27]Zhang D H，Meng Z H，Xiao W M，et al. Graft-induced inheritable variation in mungbean and its application in mungbean breeding[J]. Acta Botanica Sinica，2002，44（7）：832-837.

[28]苗永美，隋益虎，簡興. 黃瓜雄花性狀的遺傳分析[J]. 廣西植物，2015（5）：704-708.

[29]馬德華，呂淑珍，沈文云，等. 黃瓜主要品質(zhì)性狀配合力分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9（4）：65-68.

[30]李蘋芳，羊杏平，徐錦華，等. RNA分子在植物韌皮部長距離運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（10）：2058-2066.

[31]王敏，董邵云，張圣平，等. 黃瓜果實(shí)品質(zhì)性狀遺傳及相關(guān)基因分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（9）：1752-1766.

[32]郄麗娟，齊鐵權(quán)，蘇俊坡，等. 低溫弱光對不同砧木嫁接黃瓜幼苗生理特性的影響[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，30（10）：68-72.

[33]郝婷，丁小濤，余紀(jì)柱，等. 絲瓜作砧木對黃瓜幼苗耐熱性的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（3）：365-371.

管雪松 李洪巖 歐陽明安

摘要：通過插接法對接穗黃瓜和砧木黑籽南瓜進(jìn)行多次累積嫁接，研究不同嫁接次數(shù)黃瓜雌雄花的生物學(xué)性狀和花粉在不同溫度下萌發(fā)率的變化。結(jié)果表明，巨豐八號黃瓜接穗生長節(jié)間數(shù)分別為2～10節(jié)位、11～20節(jié)位、大于20節(jié)位時，其黃瓜雄花的花梗長、花瓣長、總長和質(zhì)量均顯著高于自根苗，且雄花梗長隨嫁接次數(shù)的增加呈先增加后略降低趨勢，2～10節(jié)位嫁接的花梗比其他更長；盛花期時，嫁接黃瓜的雌花其果梗長、花瓣長和總長顯著大于對照，而子房長度顯著小于對照，2次嫁接的黃瓜子房最短；嫁接的黃瓜花粉萌發(fā)率顯著高于對照，且具有一定耐低溫和高溫特性；10、35 ℃處理下，花粉萌發(fā)率隨嫁接次數(shù)提高而提高。累積嫁接具有一定的性狀累積效應(yīng)，這為嫁接誘變育種提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：累積嫁接；黃瓜；生物學(xué)性狀；花粉萌發(fā)；花梗；節(jié)位

中圖分類號： S642.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0248-04

收稿日期：2015-12-29

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金（編號：K1312004C）；福建省重點(diǎn)基金項(xiàng)目（編號：K53150006A）。

作者簡介：管雪松（1989—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，從事嫁接誘變育種研究。E-mail：fafugxs@163.com。

通信作者：歐陽明安，男，研究員，主要從事小分子化合物與生物學(xué)研究。E-mail：maouyang@hqu.edu.cn。植物嫁接技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)中，對提高植物抗生物和非生物脅迫、作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)等有重大意義[1-4]。目前，隨著國內(nèi)外對嫁接嵌合體接穗和砧木間頻繁大量遺傳物質(zhì)交流的深入研究，嫁接可促使不同物種間基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）[5-6]或誘導(dǎo)接穗DNA甲基化[7]，使其具有可遺傳性變異，這為作物遺傳育種提供了新思路和新方法。嫁接是無性繁殖，但大量研究表明，嫁接可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生變異，主要是來自韌皮部RNA的運(yùn)輸調(diào)控作用[8-9]，近年來，在蓖麻、西瓜、擬南芥、甜瓜、黃瓜等植物韌皮液中發(fā)現(xiàn)大量的mRNA，且具有廣泛的功能[10-13]。Xoconostle-Cázares 等在南瓜韌皮液內(nèi)得到第1 個RNA 結(jié)合蛋白CmPP16[14]；同年，Ruiz-Medrano 等以黃瓜為接穗、南瓜為砧木進(jìn)行異源嫁接，結(jié)果表明，CmGAIP、Cmpp16、CmNACP 可從南瓜砧木中被運(yùn)輸?shù)近S瓜接穗[15]。Ham等發(fā)現(xiàn)，CmGAIP、Cmpp16、CmSTMP、CmMybP 可與蛋白CmRBP50一起被運(yùn)輸?shù)近S瓜接穗中，南瓜韌皮部中CmGAIP是能進(jìn)行長距離移動且具有功能的RNA[16]。Haywood等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)野生型番茄為接穗和含南瓜功能缺失突變基因Cmgaip或擬南芥 ΔDELLA-gai轉(zhuǎn)基因番茄為砧木，其接穗葉片形態(tài)也隨之改變[17]。

黃瓜是葫蘆科重要的一種蔬菜，黑籽南瓜是一種對低溫、干旱、土壤貧瘠及瓜類枯萎病等逆境具有較強(qiáng)抗性的葫蘆科草本植物[18]，栽培過程中，常用黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia）作為砧木[19]來提高黃瓜嫁接苗的抗土傳病害、耐鹽脅迫、產(chǎn)量等[20-21]。目前，研究較多的是1次嫁接引起的接穗變異，多次嫁接引起的變異還未見報(bào)道，而且針對黃瓜嫁接的研究主要集中在嫁接的親和性、抗性生理、嫁接植株?duì)I養(yǎng)吸收及果實(shí)品質(zhì)評價等方面[22-24]，關(guān)于累積嫁接對接穗黃瓜雌雄花發(fā)育的生物學(xué)特性和花粉耐低溫、高溫特性的影響研究相對較少。本試驗(yàn)利用巨豐八號黃瓜為接穗、黑籽南瓜為砧木，通過累積嫁接研究接穗黃瓜花在不同嫁接次數(shù)間的差異及花粉在不同溫度下耐低溫、耐高溫特性，以期通過累積嫁接充分利用砧木南瓜的抗性優(yōu)勢，培育出抗生物或非生物脅迫的黃瓜品種，為嫁接誘變育種提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

“巨豐八號”黃瓜、黑籽南瓜種子，均由山東壽禾種業(yè)公司提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1累積嫁接對黃瓜生物學(xué)性狀的影響2014年4月1日，用50～55 ℃水浸泡黑籽南瓜種子（標(biāo)記為HZ）8～12 h，進(jìn)行黑暗下催芽，并播種于Fafard泥炭土上；4 d后，采用同樣方法對巨豐八號黃瓜種子（標(biāo)記為G01）催芽，待黃瓜幼苗2片子葉完全展開，采用宋永海的斜插接法和嫁接后管理方法進(jìn)行嫁接和管理[25]；嫁接3 d內(nèi)保持嫁接苗90%以上的相對濕度，5 d后適度見光，15 d后移植到溫室大棚內(nèi)，盛花期進(jìn)行人工自交授粉，收獲黃瓜種子（標(biāo)記為G02）；以G02為接穗、黑籽南瓜為砧木再次嫁接，進(jìn)行人工自交收獲種子（標(biāo)記為G03）。2015年6月13日，以G01不進(jìn)行嫁接為對照，以G01、G02、G03為接穗，黑籽南瓜為砧木進(jìn)行嫁接，分別標(biāo)記為G01/HZ、G02/HZ、G03/HZ，并移植到大棚內(nèi)進(jìn)行正常生產(chǎn)管理；分別選取25株生長狀況一致的苗，在接穗生長節(jié)間數(shù)分別為2～10節(jié)、11～20節(jié)、大于20節(jié)3個時期和盛花期，于08：00—09：00分別測量G01、G01/HZ、G02/HZ、G03/HZ黃瓜的雄花花梗長、花瓣長、總長、質(zhì)量和雌花的果梗長、子房長、花瓣長、總長，以及不同溫度處理下雄花的花粉萌發(fā)率。計(jì)算公式為：花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100%；雄花總長=花梗長+雄花瓣長；雌花總長=果梗長+子房長+雌花瓣長。

1.2.2累積嫁接對花粉萌發(fā)率的影響盛花期，于開花前 1 d 下午取雄花，分別在4、10、28、30、35、40 ℃下用水瓊脂培養(yǎng)12 h，每個處理10朵雄花，每隔5 d取1次；第2 d上午，挑取花粉于150 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3+11.1 mg/L CaCl2配制而成的液體培養(yǎng)基內(nèi)，同等溫度下萌發(fā)2 h，以花粉管長度大于花粉粒直徑作為花粉萌發(fā)依據(jù)，用光學(xué)顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況，每個觀察視野的花粉粒不少于60粒，每次選擇6個視野，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003繪圖，采用IBM SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1累積嫁接對接穗黃瓜雄花生物學(xué)性狀的影響

2.1.1對接穗黃瓜2～10節(jié)雄花生物學(xué)性狀的影響由圖1、圖2可見，嫁接黃瓜2～10節(jié)位雄花的花梗長、花瓣長、總長、雄花質(zhì)量均顯著高于未嫁接G01；嫁接3代內(nèi)，雄花的花梗長和總長隨嫁接代數(shù)的增加呈先增加后略降低趨勢；花梗長在不同嫁接代數(shù)間差異較大，G02/HZ花梗長達(dá)2.42 cm，比G01、G01/HZ分別提高81.95%、13.61%，G03/HZ花梗長為2.20 cm，比G01、G02/HZ分別提高65.41%、-9.09%，G01/HZ花梗長為2.13 cm，比G01增長60.15%；雄花的花瓣長度在嫁接代數(shù)間無明顯差異，較對照增長幅度為 13.31%～14.39%；嫁接黃瓜G02/HZ、G03/HZ、G01/HZ的雄花總長分別為5.58、5.35、5.31 cm，均顯著大于對照；嫁接黃瓜的雄花質(zhì)量差異不明顯，但顯著高于對照。這說明嫁接可以改善黃瓜2～10節(jié)位雄花的質(zhì)量，2次嫁接顯著優(yōu)于1次嫁接，第3次嫁接略有下降趨勢，可能是由于連續(xù)多代自交會出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。

2.1.2對接穗黃瓜11～20節(jié)雄花生物學(xué)性狀的影響由圖3可見，嫁接黃瓜11～20節(jié)位雄花的花梗長、花瓣長、總長、質(zhì)量相互間無明顯差異，但均顯著高于G01黃瓜；G01/HZ的花瓣長最長，為3.10 cm，其次是G02/HZ，為3.08 cm，G03/HZ在嫁接黃瓜中相對最短，為3.05 cm；雄花總長與花瓣長有相似規(guī)律；G01/HZ的雄花質(zhì)量相對最大，為0.34 g，其次是G03/HZ、G02/HZ，質(zhì)量分別為0.33、0.31 g，對照G01相對最輕，為0.28 g。這說明嫁接可以明顯改善黃瓜11～20節(jié)位間的雄花質(zhì)量。

2.1.3對接穗黃瓜大于20節(jié)雄花生物學(xué)性狀的影響由圖4可見，嫁接黃瓜大于20節(jié)位雄花的花梗長、花瓣長、總長、質(zhì)量相互間無明顯差異，但均顯著高于對照組黃瓜；G03/HZ的花梗長相對最長，為1.51 cm，其次是G02/HZ、G01/HZ，花梗長分別為1.40、1.38 cm，而G01花梗長相對最短，為 0.73 cm；G03/HZ花瓣長相對最長，為3.04 cm，其次為G01/HZ、G02/HZ，均為3.03 cm；G03/HZ雄花的質(zhì)量相對最大，為0.33 g，其次是G01/HZ、G02/HZ，為0.32 g，而對照G01僅為0.29 g。這說明嫁接也可以明顯改善黃瓜大于20節(jié)位的雄花質(zhì)量。

2.1.4對接穗黃瓜雌花生物學(xué)性狀的影響由圖5、圖6可見，嫁接黃瓜的果梗長、雌花花瓣長、總長極顯著大于對照組，而子房長度顯著短于對照組，且G02/HZ的子房相對最短，為3.98 cm；果梗長隨嫁接代數(shù)的增加而增長，G03/HZ相對最長，為3.12 cm，但2次嫁接與3次嫁接的黃瓜果梗長差異不顯著；G01的子房長度相對最長，為 5.04 cm；嫁接1～2代的黃瓜雌花花瓣長顯著長于對照。

2.2嫁接對接穗黃瓜盛花期不同溫度處理花粉萌發(fā)的影響

由圖7可見，4、10、28、30、35 ℃處理12 h的嫁接黃瓜，其花粉萌發(fā)率顯著高于對照組；40 ℃處理的嫁接和對照黃瓜，其花粉萌發(fā)率無明顯差異，幾乎為0%；28 ℃時，花粉體外萌發(fā)率均達(dá)到86%以上，G03/HZ的花粉萌發(fā)率相對最高，為94.40%，其次為G01/HZ、G02/HZ，花粉萌發(fā)率分別為 91.58%、94.03%，對照G01僅為86.32%；嫁接能提高雄花的耐低溫能力，4 ℃下G01/HZ的萌發(fā)率相對最高，為 3.29%，其次為G02/HZ、G03/HZ，萌發(fā)率分別為3.08%、3.01%，G01萌發(fā)率相對最低，為1.93%；10 ℃時，3代嫁接內(nèi)的花粉萌發(fā)率隨嫁接代數(shù)的增加而增大，嫁接3代萌發(fā)率最高，為61.70%，其次為嫁接1、2代，其萌發(fā)率分別為 52.51%、57.77%，而對照僅為41.06%，且均較4 ℃處理有明顯提高；嫁接也能提高花粉的耐高溫性，35 ℃處理時，嫁接3代的雄花花粉萌發(fā)率相對最高，為47.20%，其次為嫁接1、2代，其萌發(fā)率分別為44.39%、43.61%，而對照僅為 39.32%。這說明嫁接可以提高接穗黃瓜花粉的耐高溫和低溫脅迫的能力，對春季黃瓜栽培和夏季黃瓜栽培進(jìn)行嫁接，可提高自然授粉成功率。

3討論與結(jié)論

植物嫁接能改變接穗的生物學(xué)性狀，如葉片、果實(shí)、莖粗、花色等[26]，且部分性狀的改變還具有可遺傳性[27]。苗永美等研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜雄花花器性狀為數(shù)量遺傳，遺傳率相對較高，受環(huán)境影響較小[28]；馬德華等發(fā)現(xiàn)，瓜長、果梗長、瓜粗等也是數(shù)量遺傳性狀[29]。利用多代嫁接方法探究砧木對接穗的累積傳代影響有著十分重要的意義。試驗(yàn)結(jié)果表明，多代嫁接對接穗巨豐八號黃瓜的雌、雄花影響顯著，特別是對雄花花梗長和雌花果梗長、子房長度的影響；嫁接黃瓜的雄花梗長在2～10節(jié)位、11～20節(jié)位、大于20節(jié)位時的變異程度不一致，2～10節(jié)的變異程度均達(dá)到60%以上，嫁接2代達(dá)到82%，嫁接3時略降低，這可能是由于嫁接多次的砧木黑籽南瓜降低了接穗黃瓜的累積作用，在一定程度上具有自交衰退的內(nèi)因；嫁接黃瓜11～20節(jié)位和大于20節(jié)位的雄花花梗長變異程度明顯不如2～10節(jié)位，可能是由于砧木RNA的短距離運(yùn)輸調(diào)控量要比長距離運(yùn)輸量大[30]。另外，隨嫁接代數(shù)的增大，嫁接黃瓜的花瓣長、總長、質(zhì)量呈先增大后降低趨勢，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究；雌花生物學(xué)性狀變化類似于雄花，嫁接黃瓜的果梗長、子房長度、雌花瓣長、總長隨嫁接代數(shù)增加呈先增大后略減小趨勢，其中果梗長、子房長度變化極為明顯，這2個性狀在黃瓜育種中是比較重要的農(nóng)藝性狀[31]；嫁接明顯縮短果實(shí)的長度，果型指數(shù)減小，而嫁接次數(shù)對雌花發(fā)育機(jī)理的影響也有待進(jìn)一步研究。需說明的是，由于巨豐八號黃瓜3次自交花的分離性狀差異不明顯，因此，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以排除自交性狀分離的干擾。

植物耐低溫和耐高溫特性是目前研究的熱點(diǎn)，嫁接對黃瓜接穗的耐低溫和耐高溫特性已有相關(guān)研究[32-33]，但對不同溫度下嫁接是否能提高雄花的花粉萌發(fā)率研究極少。10、35 ℃培養(yǎng)12 h時，與對照相比，嫁接黃瓜花粉的萌發(fā)率顯著提高，分別達(dá)到52.51%、43.61%以上，這對春季和夏季黃瓜栽培及植物花粉低溫保存有一定的理論指導(dǎo)意義。須強(qiáng)調(diào)的是，在鏡檢時，最好確保環(huán)境溫度和花粉處理溫度的一致性，計(jì)數(shù)過程中盡量快速，盡可能減少環(huán)境溫度、光照等因素的影響。

總之，嫁接黃瓜3種不同節(jié)位的雄花生物學(xué)性狀均顯著高于黃瓜自根苗，多次累積嫁接在一定程度上具有優(yōu)勢累積效應(yīng)，其接穗性狀更加趨向于砧木，越靠近嫁接口的花，其生物學(xué)性狀受到誘導(dǎo)變異的可能性越大；嫁接黃瓜果梗長、雌花花瓣長、總長顯著大于對照，而子房長度顯著短于對照；嫁接黃瓜雄花花粉的萌發(fā)率顯著高于對照，耐低溫和高溫性得到明顯提高。累積嫁接研究為嫁接誘變育種提供了基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lee J M. Cultivation of grafted vegetables Ⅰ. current status，grafting methods，and benefits[J]. Hort Science，1994，29（4）：235-239.

[2]Koepke T，Dhingra A. Rootstock scion somatogenetic interactions in perennial composite plants[J]. Plant Cell Reports，2013，32（9）：1321-1337.

[3]張圣平，顧興芳，王燁. 野生棘瓜砧木對黃瓜生長及抗逆性的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2006，33（6）：1231-1236.

[4]Zhang W N，Kollwig G，Stecyk E，et al. Graft-transmissible movement of inverted-repeat-induced siRNA signals into flowers[J]. The Plant Journal 2014，80（1）：106-121.

[5]Fuentes I，Stegemann S，Golczyk H，et al. Horizontal genome transfer as an asexual path to the formation of new species[J]. Nature，2014，511（7508）：232-235.

[6]Tsaballa A，Athanasiadisa C，Pasentsis K，et al. Molecular studies of inheritable grafting induced changes in pepper （Capsicum annuum） fruit shape[J]. Scientia Horticulturae，2013，149：2-8.

[7]Avramidou E，Kapazoglou A，F(xiàn)ilippos A A，et al. Global DNA methylation changes in Cucurbitaceae inter-species grafting[J]. Crop Breeding and Applied Biotechnology，2015，15（2）：112-116.

[8]孫敬爽，李少峰，董辰希，等. 嫁接植物體中RNA分子長距離傳遞研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科學(xué)，2014，50（11）：158-165.

[9]張志宏，張鋒. 園藝植物MicroRNA研究進(jìn)展[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（4）：385-392.

[10]Doering-Saad C，Newbury H J，Couldridge C E，et al. A phloem-enriched cDNA library from Ricinus：insights into phloem function[J]. Journal of Experimental Botany，2006，57（12）：3183-3193.

[11]Omid A，Keilin T，Glass A，et al. Characterization of phloem-sap transcription profile in melon plants[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（13）：3645-3656.

[12]Deeken R，Ache P，Kajahn I，et al. Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments[J]. Plant Journal，2008，55：746-759.

[13]Guo S，Zhang J，Sun H，et al. The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus） and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics，2013，45：51-58.

[14]Xoconostle-Cázares B，Xiang Y，Ruiz-Medrano R，et al. Plant paralog to viral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem[J]. Science，1999，283（5398）：94-98.

[15]Ruiz-Medrano R，Xoconostle-Cazares B，Lucas W J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA：Implications for supracellularregulation in plants[J]. Development，1999，126：4405-4419.

[16]Ham B K，Brandom J L，Xoconostle-Cazares B，et al. A polypyrimidine tract binding protein pumpkin RBP50，forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex[J]. Plant Cell，2009，21：197-215.

[17]Haywood V，Yu T S，Huang N C，et al. Phloem long-distance trafficking of gibberellic acid-insensitive RNA regulates leaf development[J]. Plant Journal，2005，42：49-68.

[18]尹梅，楊明摯，陳善娜，等. 黑子南瓜的抗逆性初探[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，25（增刊1）：131-134.

[19]費(fèi)雨蘭，王晶，沈佳，等. 不同砧木嫁接對黃瓜長勢及果實(shí)品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：147-149.

[20]曾義安，朱月林，黃保健，等. 黑籽南瓜砧木對黃瓜生長結(jié)實(shí)、抗病性及營養(yǎng)元素含量的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2004，13（4）：15-19.

[21]田雪梅，魏珉，劉青，等. 不同抗性砧木嫁接黃瓜幼苗對NaCl脅迫的生理響應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，23（1）：147-153.

[22]姜闖，張青，方偉，等. 3種嫁接方法對黃瓜嫁接苗前期生長的影響[J]. 園藝與種苗，2011（6）：4-6.

[23]楊歡歡，李景富. 不同砧木黃瓜/南瓜嫁接愈合過程的解剖學(xué)觀察[J]. 北方園藝，2014（8）：5-8.

[24]劉青，魏珉，沈瓊，等. 不同砧木對嫁接黃瓜蠟粉形成及硅吸收分配的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39（5）：897-904.

[25]宋永海. 黃瓜嫁接技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（20）：145，147.

[26]王燕，謝輝，陳利萍. 植物嫁接誘導(dǎo)的遺傳變異機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2011，33（6）：585-590.

[27]Zhang D H，Meng Z H，Xiao W M，et al. Graft-induced inheritable variation in mungbean and its application in mungbean breeding[J]. Acta Botanica Sinica，2002，44（7）：832-837.

[28]苗永美，隋益虎，簡興. 黃瓜雄花性狀的遺傳分析[J]. 廣西植物，2015（5）：704-708.

[29]馬德華，呂淑珍，沈文云，等. 黃瓜主要品質(zhì)性狀配合力分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9（4）：65-68.

[30]李蘋芳，羊杏平，徐錦華，等. RNA分子在植物韌皮部長距離運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（10）：2058-2066.

[31]王敏，董邵云，張圣平，等. 黃瓜果實(shí)品質(zhì)性狀遺傳及相關(guān)基因分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（9）：1752-1766.

[32]郄麗娟，齊鐵權(quán)，蘇俊坡，等. 低溫弱光對不同砧木嫁接黃瓜幼苗生理特性的影響[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，30（10）：68-72.

[33]郝婷，丁小濤，余紀(jì)柱，等. 絲瓜作砧木對黃瓜幼苗耐熱性的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（3）：365-371.