精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制研究

沈 寅，范云智，范宇蔥，符 榮

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·論著·

精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制研究

沈 寅，范云智，范宇蔥，符 榮

430030湖北省武漢市，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科

【摘要】背景目前，臨床上針對(duì)哺乳動(dòng)物氨基酰-tRNA合成酶的研究主要集中在精氨酰-tRNA合成酶、亮氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰-tRNA合成酶、丙氨酰-tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)和功能方面，對(duì)哺乳動(dòng)物尤其是大鼠腦缺血與氨基酰-tRNA合成酶關(guān)系的研究報(bào)道極少。目的探討精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制。方法選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，其中4只大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用線栓法栓塞大腦中動(dòng)脈建立局灶性腦缺血再灌注模型。然后將剩余的56只大鼠隨機(jī)分為正常組8只、假手術(shù)組8只、腦缺血再灌注組40只。正常組不做任何外科處理；假手術(shù)組大鼠外科操作步驟與腦缺血再灌注組相同，只是線栓不進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈、不造成腦缺血；腦缺血再灌注組大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定正常組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組大鼠再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用Western Blotting法測定正常組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組大鼠再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)精氨酰-tRNA合成酶蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果假手術(shù)組與腦缺血再灌注組大鼠再灌注2 h、腦缺血再灌注組再灌注48 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于腦缺血再灌注組再灌注6 h、12 h及24 h(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注6 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于再灌注2 h和12 h(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注24 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于再灌注12 h和48 h(P<0.05)。結(jié)論大鼠局灶性腦缺血再灌注后6 h及24 h精氨酰-tRNA合成酶表達(dá)明顯升高，可能與缺血和再灌注兩次損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】腦缺血；再灌注損傷；精氨酰-tRNA合成酶

沈寅，范云智，范宇蔥，等.精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2016，24(6)：54-58.[www.syxnf.net]

SHEN Y，F(xiàn)AN Y Z，F(xiàn)AN Y C，et al.Expression of arginyl-tRNA synthetase in rats with focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(6)：54-58.

缺血性腦卒中是指由于腦供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞導(dǎo)致的腦組織缺血缺氧甚至壞死，可嚴(yán)重威脅患者生命健康。目前，缺血性腦卒中的治療手段較多，但治療效果不理想。腦缺血耐受是機(jī)體自身一種強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，但其確切的分子作用機(jī)制尚不清楚。ANDERSON等[1]研究發(fā)現(xiàn)，線蟲氨基酰-tRNA合成酶基因被抑制后，蛋白質(zhì)翻譯明顯減少，線蟲的低氧耐受能力明顯增強(qiáng)，故認(rèn)為抑制氨基酰-tRNA合成酶基因能夠抑制基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為變化，如三磷腺苷(ATP)消耗減少等。臨床研究顯示，基因轉(zhuǎn)錄抑制導(dǎo)致能量消耗急劇下降是冬眠動(dòng)物在長期缺氧環(huán)境下存活的一種行之有效的內(nèi)在機(jī)制[2]，提示急性缺血狀態(tài)下氨基酰-tRNA合成酶基因沉默極有可能是一種新的腦缺血耐受保護(hù)機(jī)制。迄今為止，有關(guān)哺乳動(dòng)物腦缺血耐受與氨基酰-tRNA合成酶基因抑制關(guān)系的研究報(bào)道極少。本研究擬通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)，間接判斷缺血腦組織半暗帶細(xì)胞能量代謝的變化規(guī)律，旨在探究精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達(dá)及機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購買、麻醉和外科操作均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)。于2015年選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(280±20)g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；飼養(yǎng)條件：25 ℃、12 h晝夜喂養(yǎng)。

1.2主要儀器及試劑一氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國sigma公司，2.0 T核磁共振儀購自美國GE公司，羊抗鼠精氨酰-tRNA合成酶IgG、兔抗羊抗體及ABC試劑盒購自Santa Cruz 公司；Trizol購自GIBCOL公司；精氨酰-tRNA合成酶基因引物由巴菲爾生物技術(shù)公司合成；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自Promega公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物試劑公司；其他試劑均為國內(nèi)分析純。 LEICA-Q500IW圖像分析系統(tǒng)購自德國Meilteler公司，UVP ImageStore 5000 cobine系統(tǒng)購自美國。

1.3實(shí)驗(yàn)分組首先選取4只大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立局灶性腦缺血再灌注模型，4只大鼠均建模成功。然后將剩余的56只大鼠隨機(jī)分為正常組8只、假手術(shù)組8只、腦缺血再灌注組40只。正常組大鼠不做任何外科處理；假手術(shù)組大鼠外科操作步驟與腦缺血再灌注組相同，只是線栓不進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈、不造成腦缺血；腦缺血再灌注組大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型。

1.4局灶性腦缺血再灌注模型采用線栓法栓塞大腦中動(dòng)脈建立局灶性腦缺血再灌注模型：暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈；線栓(線栓為進(jìn)口尼龍線，直徑0.2 mm，長度2.4 cm，頭端為直徑0.25～0.28 mm的圓鈍小球)經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈2.0～2.2 cm，用以封閉大腦中動(dòng)脈；15 min后拔出線栓至頸外動(dòng)脈形成大腦中動(dòng)脈再灌注；造模后，觀察大鼠行為以證實(shí)栓塞大腦中動(dòng)脈有效。局灶性腦缺血再灌注模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)左側(cè)Horner征，右前爪不能伸直，爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或向右側(cè)傾倒。局灶性腦缺血再灌注造模成功大鼠方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)；造模大鼠死亡或出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血或無左側(cè)Horner征及右側(cè)偏癱表現(xiàn)均為造模失敗，不能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，選取同一批次的大鼠制成合格模型后補(bǔ)足數(shù)目。

1.5TTC染色大鼠采用2.0 T核磁共振儀掃描后腹腔注射過量麻醉劑即刻斷頭處死，無菌條件下迅速取出大鼠腦組織快速低溫冷凍，做連續(xù)2 mm厚冠狀切片，隨后放入1% TTC溶液中，37 ℃下染色30 min。正常腦組織TTC染色顯示為紅色，缺血區(qū)腦組織TTC染色顯示為白色。

1.6RT-PCR正常組、假手術(shù)組各選取4只大鼠，腦缺血再灌注組于再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別選取4只大鼠，注射過量麻醉劑致死，快速斷頭取腦。無菌條件下取出正常組、假手術(shù)組大鼠正常腦組織及腦缺血灌注組大鼠缺血區(qū)腦組織，采用RNAiso Plus裂解細(xì)胞，三氯甲烷溶解總RNA，異丙醇沉淀RNA，沉淀RNA經(jīng)無水乙醇洗滌后采用不含RNA酶的雙蒸水溶解。然后采用分光光度法測定RNA純度。精氨酰-tRNA合成酶基因擴(kuò)增引物由Primer 3軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，在上海生工生物技術(shù)公司合成。上游引物為5′-CATCAAATACGCCGACCTTT-3′，下游引物為5′-GTAAAATGCACCGTCCCAGT-3′，產(chǎn)物長度為233 bp；內(nèi)參照為β-actin，其上游引物為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，產(chǎn)物長度為462 bp。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA及PCR擴(kuò)增過程均嚴(yán)格按照試劑生產(chǎn)商提供的說明書進(jìn)行。配制1.2%瓊脂糖凝膠電泳，10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(精氨酰-tRNA合成酶基因和β-actin基因)電泳。采用GDS8000凝膠成像系統(tǒng)及LEICA-Q500IW圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶分析，并計(jì)算精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量，精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量=精氨酰-tRNA合成酶mRNA/β-actin mRNA。

1.7Western Blotting法正常組、假手術(shù)組各選取4只大鼠，腦缺血再灌注組于再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別選取4只大鼠，注射過量麻醉劑致死，快速斷頭取腦。選取正常組、假手術(shù)組大鼠正常腦組織及腦缺血灌注組大鼠缺血區(qū)腦組織，勻漿后采用TBS緩沖液(50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，5 mM CaCl，0.05%Brij-35，0.1 mM PMSF，pH 7.4)抽提，勻漿緩沖液4 ℃ 12 000 r/min離心20 min。取含細(xì)胞質(zhì)成分的上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取70 μg蛋白溶液于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)染到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)染后的PVDF膜置于含5%脫脂牛奶和小牛血清的0.05% Tween-20的TBS緩沖液中用以封閉非特異性抗體。室溫下一抗(精氨酰-tRNA合成酶1∶500，β-actin 1∶1 000)和PVDF膜反應(yīng)2 h，然后加入二抗反應(yīng)2 h。試劑盒(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法)用作抗體檢測。PVDF膜置于X線膠片下，采用化學(xué)發(fā)光法UVP ImageStore 5000 cobine系統(tǒng)對(duì)獲取的條帶進(jìn)行光密度測定和定量分析。精氨酰-tRNA合成酶蛋白相對(duì)表達(dá)量=精氨酰-tRNA合成酶蛋白/β-actin蛋白。

2結(jié)果

2.1局灶性腦缺血再灌注模型的建立及穩(wěn)定性各組大鼠動(dòng)脈壓、肛溫、動(dòng)脈血氧分壓、血糖、心率及呼吸頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠蘇醒后進(jìn)行行為觀察及腦組織切片TTC染色，結(jié)果顯示，40只大鼠均出現(xiàn)左側(cè)Horner征、右前爪不能伸直、行走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈或向右傾倒。

Table 1Comparison of arterial pressure，rectal temperature，arterial oxygen partial pressure，blood glucose，heart rate，respiratory rate in the three groups

組別例數(shù)動(dòng)脈壓(mmHg)肛溫(℃)動(dòng)脈血氧分壓(kPa)血糖(mmol/L)心率(次/min)呼吸頻率(次/min)正常組 8 98±7 35.2±0.5514.7±0.43.6±0.1392±2273±10假手術(shù)組 8 98±12 35.6±0.7014.4±0.43.6±0.2387±1776±7腦缺血再灌注組40104±935.4±0.6514.5±0.73.5±0.1390±1177±8F值0.450.350.250.310.070.16P值0.650.720.780.750.930.86

注：1 mm Hg=0.133 kPa

2.2各組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA及蛋白表達(dá)情況各組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組與腦缺血再灌注組大鼠再灌注2 h、48 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于腦缺血再灌注組再灌注6 h、12 h及24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注6 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于再灌注2 h及12 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注24 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于再灌注12 h及48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2，圖1～2)。

3討論

哺乳動(dòng)物冬眠狀態(tài)下體溫下降、氧耗減少、心率減慢及可調(diào)節(jié)性細(xì)胞、組織代謝抑制。NATHANIEL[3]認(rèn)為機(jī)體可調(diào)節(jié)性細(xì)胞、組織代謝抑制是防治腦缺血缺氧損傷的新策略之一。ASAMI等[4]研究認(rèn)為，減少氧耗、降低細(xì)胞代謝能夠減輕組織器官缺血缺氧性損傷(包括腦損傷)，其可能成為臨床治療重癥疾病的重要研究方向之一。趙睿等[5]對(duì)冬眠動(dòng)物北極地松鼠進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在體外缺氧和葡萄糖匱乏條件下培養(yǎng)其海馬區(qū)神經(jīng)元幾乎未遭受任何損傷；用同樣方法培養(yǎng)人類海馬區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)t發(fā)現(xiàn)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷且細(xì)胞數(shù)量大量減少；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種對(duì)缺氧缺糖的耐受能力歸因于能源物質(zhì)匱乏促發(fā)了北極地松鼠神經(jīng)元再生；且通過研究ATP產(chǎn)量推測，在缺血缺氧條件下北極地松鼠神經(jīng)元能量代謝率急劇降低[6]。

Table 2Comparison of relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein in the three groups

組別只數(shù)精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量精氨酰-tRNA合成酶蛋白相對(duì)表達(dá)量正常組40.77±0.050.48±0.06假手術(shù)組40.78±0.050.49±0.06腦缺血再灌注組再灌注2h40.85±0.05b0.55±0.07b腦缺血再灌注組再灌注6h41.39±0.12a0.92±0.11a腦缺血再灌注組再灌注12h41.06±0.10abc0.66±0.09abc腦缺血再灌注組再灌注24h41.69±0.16a1.02±0.10a腦缺血再灌注組再灌注48h40.60±0.06c0.36±0.08cF值69.7234.29P值0.000.00

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦缺血再灌注組再灌注6 h比較，bP<0.05；與腦缺血再灌注組再灌注24 h比較，cP<0.05

圖1　3組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA表達(dá)情況

Figure 1Expression of arginyl-tRNA synthetase mRNA in the three groups

圖2　3組大鼠精氨酰-tRNA合成酶蛋白表達(dá)情況

Figure 2Expression of arginyl-tRNA synthetase protein in the three groups

氨基酰-tRNA合成酶作為蛋白質(zhì)生物合成過程中的一類關(guān)鍵酶，其底物是氨基酸、tRNA 和ATP。通常細(xì)胞中含有20種氨基酰-tRNA合成酶，根據(jù)保守序列和特征結(jié)構(gòu)花式不同可分為兩大類，各包括10種氨基酰-tRNA合成酶，且每種氨基酰-tRNA合成酶對(duì)應(yīng)一種氨基酸和相應(yīng)的tRNA。氨基酰-tRNA合成酶可催化相應(yīng)tRNA的氨基?；?，氨基?；膖RNA 通過tRNA的反密碼子與mRNA上的密碼子配對(duì)，在核糖體上將氨基酸依次連接并合成蛋白質(zhì)[6]。

2009年ANDERSON等[1]通過RNAi技術(shù)抑制了線蟲體內(nèi)氨基酰-tRNA合成酶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基酰-tRNA合成酶基因沉默后蛋白質(zhì)翻譯明顯減少，其低氧耐受能力明顯增強(qiáng)，缺氧所致的死亡率明顯降低，且低氧耐受能力與蛋白質(zhì)翻譯水平呈負(fù)相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，抑制氨基酰-tRNA合成酶基因能夠抑制蛋白質(zhì)翻譯，導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為變化，如ATP消耗減少等,故推測蛋白質(zhì)翻譯減少導(dǎo)致能量消耗急劇下降是冬眠動(dòng)物在長期缺氧環(huán)境下存活的一種行之有效的內(nèi)在機(jī)制。KAMPHUIS等[7]對(duì)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血60 min前進(jìn)行5 min缺血預(yù)處理，采用微陣列技術(shù)分析了104個(gè)已知基因在缺血預(yù)處理后1～7 d的表達(dá)情況；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理能夠完全阻止后續(xù)缺血對(duì)視網(wǎng)膜的損傷，對(duì)視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)編碼氨基酰-tRNA合成酶的基因(Iars，Lars，Cars，Yars，Gars，Tars)表達(dá)明顯下調(diào)，缺血預(yù)處理后24 h和48 h下降幅度達(dá)30%～45%；定量PCR結(jié)果顯示，Iars、Lars、Cars、Yars、Tars等基因的轉(zhuǎn)錄在缺血預(yù)處理后24 h平均下降31.7%，在缺血預(yù)處理后48 h平均下降 49.3%；微陣列探針發(fā)現(xiàn)14個(gè)已知的氨基酰-tRNA合成酶中9個(gè)在缺血預(yù)處理后24 h和48 h轉(zhuǎn)錄減少，提示缺血預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)作用與缺血預(yù)處理后參與氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程的氨基酰-tRNA合成酶和基因轉(zhuǎn)錄減少有關(guān)，因此推測氨基酰-tRNA合成酶基因轉(zhuǎn)錄減少和功能降低可能是保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的一種有效機(jī)制。另有研究顯示，采用放線菌酮抑制蛋白質(zhì)合成能夠降低腦[8]和脊髓[9-10]的缺血性損傷，有助于維持細(xì)胞存活，但蛋白質(zhì)合成的全面下調(diào)如何介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制目前尚不清楚。

目前，臨床上針對(duì)哺乳動(dòng)物氨基酰-tRNA合成酶的研究主要集中在精氨酰-tRNA合成酶[11-12]、亮氨酰-tRNA合成酶[13]、甲硫氨酰-tRNA合成酶[14]、丙氨酰-tRNA合成酶[15]的結(jié)構(gòu)和功能方面，對(duì)哺乳動(dòng)物尤其是大鼠腦缺血與氨基酰-tRNA合成酶關(guān)系的研究報(bào)道極少。本研究結(jié)果顯示，正常組、假手術(shù)組大鼠腦組織及缺血再灌注組大鼠缺血區(qū)腦組織中均有精氨酰-tRNA合成酶的表達(dá)，且正常組和假手術(shù)組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量間無差異，提示假手術(shù)對(duì)精氨酰-tRNA合成酶的表達(dá)無影響。本研究結(jié)果亦顯示，假手術(shù)組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于腦缺血再灌注組再灌注6 h、12 h及24 h，腦缺血再灌注組大鼠再灌注6 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于再灌注2 h和12 h，腦缺血再灌注組大鼠再灌注24 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于再灌注12 h和48 h，表明精氨酰-tRNA合成酶表達(dá)在局灶性腦缺血再灌注6 h和24 h出現(xiàn)兩個(gè)高峰，可能與缺血和再灌注兩次損傷有關(guān)。精氨酰-tRNA合成酶mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)規(guī)律相似，但分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)強(qiáng)度弱于mRNA表達(dá)強(qiáng)度，其原因有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，大鼠局灶性腦缺血再灌注6 h及24 h精氨酰-tRNA合成酶表達(dá)明顯升高，分析其機(jī)制可能如下：受細(xì)胞缺氧、去極化、K+水平升高等因素影響，機(jī)體通過某種機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞氨基酰-tRNA合成酶活性增加，進(jìn)而增加腦缺血再灌注組織腦細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成以穩(wěn)定缺血腦細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而維持正常的細(xì)胞功能；而腦缺血損傷導(dǎo)致精氨酰-tRNA合成酶代償性增多，在再灌注后缺氧情況得到改善，精氨酰-tRNA合成酶表達(dá)隨之降低，但隨著再灌注損傷出現(xiàn)，細(xì)胞代謝紊亂進(jìn)一步加重，為了維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定精氨酰-tRNA合成酶再次代償性增多。因此筆者推測大鼠局灶性腦缺血再灌注后6 h及24 h精氨酰-tRNA合成酶兩次增高可能與缺血和再灌注兩次損傷有關(guān)，精氨酰-tRNA合成酶基因和蛋白表達(dá)增加可能是哺乳動(dòng)物腦缺血再灌注后的一種機(jī)體自我修復(fù)機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：沈寅、符榮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；沈寅、范云志、范宇蔥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；符榮進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻(xiàn)

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(本文編輯：謝武英)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81371453)

通信作者：符榮，430030湖北省武漢市，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科；E-mail：FurongLP@163.com

【中圖分類號(hào)】R 743.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

DOI:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.06.014

Corresponding author：FU Rong，Department of Neurosurgery，Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China；E-mail：FurongLP@163.com

(收稿日期：2016-02-16；修回日期：2016-06-07)

Expression of Arginyl-tRNA Synthetase in Rats With Focal Cerebral Ischemia Reperfusion and the Mechanism

SHENYin，F(xiàn)ANYun-zhi，F(xiàn)ANYu-cong，F(xiàn)URong.

DepartmentofNeurosurgery，UnionHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

【Abstract】BackgroundsAt present，aminoacyl-tRNA synthetase related clinical studies mostly concentrate on the structure and function of arginyl-tRNA synthetase，leucyl-tRNA synthetase，methionyl-tRNA synthetase and alanyl-tRNA synthetase，research reports about relationship between aminoacyl-tRNA synthetase and cerebral ischemia is relatively rare.ObjectiveTo explore the expression of arginyl-tRNA synthetase in rats with focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism.MethodsAt first，4 out of 60 clean healthy male SD rats were selected to carry out the preliminary experiment，then the other 56 rats were randomly divided into A group(n=8)，B group(n=8)and C group(n=40)；focal cerebral ischemia reperfusion model was prepared by suture-occluded method(by embolization of middle cerebral artery).Rats of A group did not received any surgical intervention，rats of C group prepared for focal cerebral ischemia reperfusion model，while rats of B group received same surgical intervention without line-lock of internal carotid or cerebral ischemia.RT-PCR was used to detect the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA，Western Blotting method was used to detect the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase protein.ResultsAfter 2 hours and 48 hours of reperfusion，no statistically significant differences of relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA or arginyl-tRNA synthetase protein was found between B group and C group(P>0.05)；after 6 hours，12 hours and 24 hours of reperfusion，the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein of B group were statistically significantly lower than those of C group(P<0.05).After 6 hours of reperfusion，the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein of C group were statistically significantly higher than those after 2 hours and 12 hours of reperfusion(P<0.05)；after 24 hours of reperfusion，the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein of C group were statistically significantly higher than those after 12 hours and 48 hours of reperfusion(P<0.05).ConclusionAfter 6 hours and 12 hours of reperfusion，the expression of arginyl-tRNA synthetase is significantly elevated in rats with focal cerebral ischemia reperfusion，its mechanism is possibly related with the double damage of ischemia and reperfusion.

【Key words】Brain ischemia；Reperfusion injury；Arginyl-tRNA synthetase