木質(zhì)纖維素水解液中酚類抑制物去除的研究進(jìn)展1

謝瑤嬛， 曹淑貞， 王風(fēng)芹， 謝 慧， 宋安東

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

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木質(zhì)纖維素水解液中酚類抑制物去除的研究進(jìn)展1

謝瑤嬛， 曹淑貞， 王風(fēng)芹， 謝 慧， 宋安東

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

摘 要：利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇、丁醇已成為一種極具發(fā)展前景的可再生能源生產(chǎn)方式。然而，木質(zhì)纖維素水解液中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)對(duì)發(fā)酵起抑制作用并嚴(yán)重阻礙溶劑產(chǎn)生。文章系統(tǒng)介紹了木質(zhì)纖維素水解液中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)含量及其對(duì)終產(chǎn)物發(fā)酵的影響，綜述了近年來國內(nèi)外利用生物法去除酚類的效果，闡述了自脫毒發(fā)酵菌株的構(gòu)建。最后，對(duì)如何提高水解液中抑制物去除率提出建議與展望。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素；抑制物；酚類；漆酶

隨著能源和資源全球化及其不斷損耗，可再生能源成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。乙醇和丁醇作為新型可再生能源，因其良好的燃料性能，化石能源逐步為其所替代[1]。木質(zhì)纖維素（lignocellulose）是自然界存在的一種可再生資源，貯藏豐富并蘊(yùn)含著巨大的生物質(zhì)能，以木質(zhì)纖維素為原料來生產(chǎn)燃料乙醇、丁醇是緩解能源危機(jī)的重要途徑之一，也是在環(huán)境保護(hù)和能源危機(jī)之間尋求平衡的令人矚目的新領(lǐng)域。

然而，木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理和酶解所得水解液中存在著大量繁雜的有毒物質(zhì)，主要包括酸類、酚類和醛類三大類。纖維素大分子包裹著木質(zhì)素和半纖維素的特殊結(jié)構(gòu)使得木質(zhì)纖維素在利用前必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，此過程中纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖、木糖等多糖，木質(zhì)素則降解成多種單環(huán)芳香族化合物[2]。高溫下，上述產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步發(fā)生多種形式的分解和氧化，產(chǎn)生甲酸、乙酸等有機(jī)酸，糠醛、羥甲基糠醛等呋喃類發(fā)酵抑制物，這些抑制物通過抑制微生物的生長(zhǎng)而影響了后期的發(fā)酵。因此，去除水解液中的抑制物是木質(zhì)纖維素高效利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

本文綜述了木質(zhì)纖維素水解液中酚類物質(zhì)的種類、含量、對(duì)微生物的抑制作用及脫毒方法的研究進(jìn)展，為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素與可再生能源的高效轉(zhuǎn)化提供了參考。

1 木質(zhì)纖維素水解液中酚類抑制物的種類與含量

木質(zhì)纖維素水解液中的酚類物質(zhì)主要來源于木質(zhì)素的降解，它們通常是含苯環(huán)的芳香族化合物，雖然含量相對(duì)醛類較低，但其抑制作用較于其他物質(zhì)更為嚴(yán)重。

Carlos Martin對(duì)甘蔗渣進(jìn)行兩種不同條件的爆破預(yù)處理，在205℃的爆破條件下水解液經(jīng)纖維素酶水解，總酚量達(dá)4.1 g/L，而215℃條件下的總酚多達(dá)4.5 g/L[3]。Martin也對(duì)煙稈進(jìn)行了不同爆破條件處理，205℃下5 min得到的水解液總酚含量0.3 g/L，而10 min處理的水解液總酚含量達(dá)0.6 g/L[4]。小麥秸稈經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理后，在酶解得到的水解液中測(cè)得香草醛21 mg/L，丁香醛10 mg/L，香豆酸和阿魏酸分別為17 mg/L 和26 mg/L[5]，其中香草醛的抑制作用最為顯著。林貝用稀酸預(yù)處理玉米秸稈，后期為了提高發(fā)酵培養(yǎng)基中糖濃度將水解液濃縮大約 3倍，致使香草醛含量達(dá)到5.6 g/L[6]，盡管糖含量提高，但如此多的香草醛會(huì)嚴(yán)重影響菌體的生長(zhǎng)，糖的利用率也隨之降低。表1總結(jié)了文獻(xiàn)報(bào)道的不同木質(zhì)纖維素水解液中各種酚類物質(zhì)的含量。

表1 不同木質(zhì)纖維素水解液中酚類抑制物的含量

2 木質(zhì)纖維素水解液中酚類物質(zhì)對(duì)微生物的抑制作用

木質(zhì)素的降解物會(huì)滲透到細(xì)胞膜內(nèi)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響發(fā)酵微生物的正常生長(zhǎng)，降低發(fā)酵效率[13]。有研究表明，氯代酚類化合物會(huì)降低微生物的呼吸率，嚴(yán)重抑制微生物的呼吸反應(yīng)[14]。表2總結(jié)了香草醛、丁香醛和4-羥基苯甲醛對(duì)微生物發(fā)酵的影響，其中香草醛的抑制作用最為顯著。

表2 水解液中酚類抑制物對(duì)菌體及發(fā)酵結(jié)果的影響

相對(duì)乙醇產(chǎn)量=實(shí)驗(yàn)組乙醇產(chǎn)量/對(duì)照組乙醇產(chǎn)量；相對(duì)生長(zhǎng)率=實(shí)驗(yàn)組菌體生長(zhǎng)量/對(duì)照組菌體生長(zhǎng)量；

葡萄糖消耗率=葡萄糖殘余量/糖初始含量；L-乳酸得率=L-乳酸最大生成量/糖初始含量4 g/L香草醛完全抑制了釀酒酵母6508-127對(duì)木糖的利用，菌體自身生長(zhǎng)也被完全抑制，同時(shí)乙醇生成緩慢，6 g/L香草醛的存在使得乙醇發(fā)酵完全受到抑制[6]。劉哲對(duì)米根霉AS3.819的發(fā)酵進(jìn)行研究，在香草醛含量較低時(shí)（＜0.5 g/L）可顯著促進(jìn)葡萄糖的代謝，48 h即可全部消耗盡，而含量超過0.8 g/L，葡萄糖的代謝受到明顯抑制[15]。目前，通過對(duì)菌株進(jìn)行馴化以獲得耐受性強(qiáng)且性狀穩(wěn)定的發(fā)酵菌株同樣成為一種經(jīng)濟(jì)可行的高產(chǎn)發(fā)酵手段[16]。

3 木質(zhì)纖維素水解液中酚類物質(zhì)的去除方法

目前對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中發(fā)酵抑制物的脫毒方法主要分為三類，物理法脫毒、化學(xué)法脫毒、生物法脫毒。Converti等[20]在2000年研究證明，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)只適用于乙酸、糠醛等易揮發(fā)性物質(zhì)的去除，并伴隨酚類物質(zhì)增加，同時(shí)損失葡萄糖和木糖等可發(fā)酵糖。離子交換法的脫毒效果較好，但糖損失率高?；瘜W(xué)方法中以overliming應(yīng)用最為廣泛，通過Ca(OH)2與硫酸鹽的結(jié)合部分解除無機(jī)離子對(duì)發(fā)酵的抑制作用，但其酚類抑制的解除尚不顯著，仍需其他方法輔助，這些理化脫毒法效果并不理想且能源消耗嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致環(huán)境惡化[21]。生物法脫毒作為有效脫毒方式，通過改變抑制物的結(jié)構(gòu)而降低其毒性，相對(duì)于理化脫毒具有操作簡(jiǎn)單明確，目的準(zhǔn)確直接且對(duì)水解液中多糖物質(zhì)無影響的優(yōu)勢(shì)，因此是一種高效且環(huán)保的脫毒方法。

3.1 酚類物質(zhì)的酶法脫除

木質(zhì)纖維素水解液酶法脫毒研究中應(yīng)用最廣泛的是利用漆酶脫除水解液中的酚類物質(zhì)。

漆酶屬于多銅氧化酶，是由多種植物和真菌產(chǎn)生的一種胞外酶，它利用自己的催化功能將1分子的氧轉(zhuǎn)化成為2分子的水，同時(shí)將4分子的底物氧化成為4分子自由基，利用這種催化劑可以實(shí)現(xiàn)對(duì)酚類物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化。作為水解液中酚類物質(zhì)去除的有效方法，漆酶的酶法脫毒具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與化學(xué)脫毒法和物理脫毒法相比，酶法脫毒更具專一性和高效性。Martinez經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)使用overliming進(jìn)行脫毒總酚的最大去除率僅為41±6%[22]。而Converti等證明漆酶去酚率可達(dá)80%左右[20]。同時(shí)漆酶酶法脫毒過程操作簡(jiǎn)單，不用消耗過多額外能量，漆酶的這些優(yōu)勢(shì)和它的廣泛存在使其具有廣泛的工業(yè)實(shí)用性。

盡管漆酶是一種高效的酚類脫毒方法，但其脫毒效果與諸多因素相關(guān)。Moreno發(fā)現(xiàn)漆酶的脫毒效果與漆酶的添加時(shí)期相關(guān)，爆破預(yù)處理的小麥秸稈經(jīng)酶解糖化，對(duì)其水解液進(jìn)行兩種不同漆酶脫毒方式，結(jié)果顯示，酶解前進(jìn)行脫毒，香草醛含量由26 mg/L減少到3 mg/L，而酶解后進(jìn)行脫毒其含量由22 mg/L減少到15 mg/L，這說明酶解前脫毒的去酚率高于酶解后，然而比較糖得率與發(fā)酵周期，酶解后脫毒的糖得率與發(fā)酵周期都低于酶解前脫毒[5]。漆酶的添加時(shí)間除了影響到脫毒效果，對(duì)纖維素酶的活性也有一定影響。Alfredo Oliva-Taravilla對(duì)纖維素酶活性受漆酶脫毒抑制的機(jī)理進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)糖化過程中加入漆酶，纖維素酶活性受到抑制，于是作者猜想酶活降低的現(xiàn)象是被漆酶催化后的低聚酚類與纖維素形成復(fù)合物而產(chǎn)生的，為了克服這種情況，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)纖維素酶反應(yīng)30 h后添加漆酶為最佳添加時(shí)間，此時(shí)水解作用不再受影響[23]。

另外，預(yù)處理方式也會(huì)影響到漆酶脫毒效果。Miguel Jurado將小麥秸稈爆破處理，隨后對(duì)經(jīng)水和1% H2SO4兩種不同浸泡處理后的水解率和漆酶脫毒率分別進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)證明水處理的得糖率高于酸處理，但酸處理的漆酶去酚率相對(duì)較高。此實(shí)驗(yàn)也找到了反應(yīng)的最適條件：調(diào)pH至5，加漆酶量0.5 U/mL，150 r/min的轉(zhuǎn)速28℃下反應(yīng)2 h[24]。Carlos Martin通過兩種不同蒸汽爆破條件（205℃、215℃）處理甘蔗渣，酶解后用漆酶脫毒，比較兩種水解液的的去酚率均為約80%，得此結(jié)果可說明此兩種爆破條件并不影響漆酶的脫毒效果[3]。Moreno采用200℃、2.5 min和210℃、2.5 min的蒸汽爆破條件對(duì)小麥秸稈進(jìn)行研究，與Miguel Jurado[24]不同的是，作者將爆破料進(jìn)行不同條件的稀釋并在水解前進(jìn)行漆酶處理，經(jīng)總酚測(cè)定，去除總酚60%～80%，在蒸氣爆破200℃、稀釋20% DM（w/V）的條件下，去酚量達(dá)最高，以S. cerevisiae F12為發(fā)酵菌株，此脫毒的水解液作為培養(yǎng)基，乙醇產(chǎn)量相對(duì)于未脫毒對(duì)照組有明顯提升[25]。

除漆酶外，酪氨酸酶和辣根過氧化物酶等也被用于去除木質(zhì)纖維素水解液酚類物質(zhì)的研究。安林坤將酪氨酸酶固定化到疏水基團(tuán)修飾的瓊脂珠上，通過對(duì)酪氨酸酶的固定化處理，蛋白的吸附率及酶活力的回收分別達(dá)到90%和80%，有效地去除了鄰苯二酚、苯酚等酚類物質(zhì)[26]。Wagner等[27]研究發(fā)現(xiàn)，辣根過氧化物酶在過氧化氫存在情況下，3 h內(nèi)可除去約95%的酚類化合物。Jonsson對(duì)三種酶脫毒效果進(jìn)行了比較，將柳木進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理并水洗，對(duì)水洗液進(jìn)行不酶組合同方式的處理，分別用漆酶、過氧化物酶和兩種酶結(jié)合，然后發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量顯示單獨(dú)漆酶脫毒效果比兩種酶同時(shí)脫毒效果好，然單獨(dú)漆酶脫毒發(fā)酵后糖利用率較低，但總得率單用漆酶的效果最好[28]。

3.2 自脫毒發(fā)酵菌株的構(gòu)建與應(yīng)用

目前應(yīng)用于木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化的自脫毒發(fā)酵菌株最廣泛的是漆酶的異源表達(dá)菌，漆酶雖已被商業(yè)化，但考慮其購買成本，通過異源表達(dá)漆酶構(gòu)建工程菌逐漸受到廣泛關(guān)注。漆酶基因廣泛存在于多種擔(dān)子真菌和子囊真菌中，并且在許多真菌中漆酶的基因通常成簇狀排列[29-30]。對(duì)于酚類抑制物的去除，可以通過構(gòu)建基因工程菌株使發(fā)酵微生物具備一定的脫毒能力，進(jìn)而在發(fā)酵的同時(shí)去除抑制物，這種脫毒方法無需在發(fā)酵前對(duì)水解液中強(qiáng)抑制物酚類進(jìn)行任何脫毒處理，可直接通過生物脫毒與發(fā)酵協(xié)同進(jìn)行，進(jìn)而減少脫毒環(huán)節(jié)的成本，同時(shí)避免了還原糖的損失。Thomas將來自于Myceliophthora thermophila的漆酶基因MtL表達(dá)于Saccharomyces cerevisiae中，通過酶活性分析，這種工程菌表達(dá)出的漆酶活力提高了約170倍[31]。Bleve 將Pleurotus eryngii中編碼胞外漆酶的基因Ery3表達(dá)于Saccharomyces cerevisiae 中，經(jīng)細(xì)胞固定化，酶產(chǎn)量139 mU/mL，提升1.6倍，且穩(wěn)定性好[32]。來自于白腐真菌Trametes versicolor的漆酶基因在啟動(dòng)子PGKI的作用下表達(dá)于釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae中，Sso2p的超表達(dá)提升了漆酶活力，酶活高達(dá)0.002 2 nKat/mL。此外，在1.25 mM松伯醇的SC-Ura培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)乙醇10 g/L[33]。

3 展望

對(duì)于日漸枯竭的石油資源和日益惡化的環(huán)境，以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇、丁醇具有廣闊的發(fā)展前景。當(dāng)今國內(nèi)外不論是在木質(zhì)纖維素前處理還是后期的發(fā)酵上的研究都在不斷進(jìn)步，但大規(guī)模的工廠化仍存在一定困難，難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。因此今后的發(fā)展可以從以下幾點(diǎn)重點(diǎn)考慮：1）對(duì)于研究較為深入的三種關(guān)鍵抑制物，多種脫毒方式已顯示出高效的酚類、醛類去除率，但甲酸、乙酸的去除尚未有明確可行的方案，因此水解液中小分子酸的去除應(yīng)成為我們今后努力研究的方向。2）構(gòu)建高效復(fù)合脫毒方法。根據(jù)不同脫毒方法的各種抑制物去除效果，協(xié)調(diào)結(jié)合多種有效脫毒方式，例如將去除醛類的物理化學(xué)法與去除酚類的生物酶法結(jié)合，在盡可能環(huán)保節(jié)能的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)最大脫毒率。3）通過基因工程技術(shù)修飾或改造發(fā)酵菌株的代謝途徑，或通過菌種馴化篩選有抗性的發(fā)酵菌株，以期提高菌種的耐毒性或糖醇轉(zhuǎn)化率。此方法減少發(fā)酵前脫毒步驟與成本，實(shí)現(xiàn)了脫毒與發(fā)酵同步進(jìn)行。

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中圖分類號(hào)：TQ35

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-8405(2016)02-0093-06

DOI:10.16561/j.cnki.xws.2016.02.12

收稿日期：2016-01-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21206033）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（15IRTSTHN014）。

作者簡(jiǎn)介：謝瑤嬛（1991~），女，碩士研究生；研究方向：微生物能源工程。annayaohuan@163.com

* 通訊作者：宋安東，男，博士，教授；研究方向：微生物能源工程，發(fā)酵工程。Song1666@126.com

Recent Advances in Detoxification of Phenolic Compounds in Lignocellulose Hydrolysate

XIE Yao-huan, CAO Shu-zhen, WANG Feng-qin, XIE Hui, SONG An-dong
（Key Laboratory of Enzyme Engineering ofAgricultural Microbiology, Ministry ofAgriculture, College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China）

Abstract:The fermentation to produce ethanol or butanol by using the lignocellulose hydrolysate has become a renewable energy production mode that provide development prospect extremely. Phenolic compounds have a considerable inhibitory effect on the fermentation and hinder the solvent to produce. The paper systematically introduced the phenolic content in the lignocellulose hydrolysate and the effect onfermented product. Reviewed the domestic and foreign effect of removing phenols by using biological method, and narrated the construction of its own detoxification fermentation strains. Last, make recommendations and prospect on how to improve the removal rate of inhibitor in the hydrolysate.

Key words:lignocellulose; inhibitor; phenolic compound; laccase