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    藍(lán)耳病病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的“兩步法”評(píng)價(jià)

    2016-07-25 05:35:22劉曉飛馮春燕翟新驗(yàn)吳紹強(qiáng)李曉琳仇松寅劉丹丹林祥梅中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所北京0009中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心北京0009
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2016年1期
    關(guān)鍵詞:重復(fù)性

    王 勤,劉曉飛,馮春燕,翟新驗(yàn),周 智,吳紹強(qiáng),李曉琳,仇松寅,劉丹丹,林祥梅(.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所,北京 0009;.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 0009)

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    藍(lán)耳病病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的“兩步法”評(píng)價(jià)

    王 勤1,劉曉飛1,馮春燕1,翟新驗(yàn)2,周 智2,吳紹強(qiáng)1,李曉琳1,仇松寅1,劉丹丹1,林祥梅1
    (1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所,北京 100029;2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 100029)

    摘 要:本研究利用“兩步法”對(duì)藍(lán)耳病試劑盒進(jìn)行了使用效果評(píng)價(jià):第一步,利用18份參考血清對(duì)試劑盒進(jìn)行初篩,淘汰檢測(cè)準(zhǔn)確率低的試劑盒;第二步,利用參考血清和臨床樣品,分別開(kāi)展最低檢測(cè)限、重復(fù)性以及診斷敏感性和診斷特異性分析。結(jié)果顯示,A、B、C、D 4種市售試劑盒的初篩符合率均為100%,診斷敏感性和診斷特異性分別為94.58%和97.14%、94.58%和89.2%、93.1%和90%、96.55%和85%。其中,A和B為通用型試劑盒,能夠檢測(cè)歐洲型和美洲型藍(lán)耳??;C和D均為美洲型檢測(cè)試劑盒;重復(fù)性上,D試劑盒批內(nèi)與批間變異系數(shù)都較小,重復(fù)性較好。本研究首次提出了“兩步法”試劑盒評(píng)價(jià)體系并利用這一體系對(duì)4種藍(lán)耳病試劑盒進(jìn)行了評(píng)價(jià),不僅為藍(lán)耳病試劑盒的選擇提供了依據(jù),也為今后其它動(dòng)物疫病檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)提供了參考。

    關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征;ELISA檢測(cè)試劑盒;診斷敏感性;診斷特異性;重復(fù)性

    資助項(xiàng)目:國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目:豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試劑盒貝葉斯方法質(zhì)量評(píng)價(jià)模型的建立(2014IK230);中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目:動(dòng)物檢疫風(fēng)險(xiǎn)分析中關(guān)鍵參數(shù)的精準(zhǔn)估計(jì)(2014JK030);國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目《進(jìn)境高危害病毒性豬病檢測(cè)方法的系統(tǒng)性研究和完善》(2015IK310)

    豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)又稱“藍(lán)耳病”,是以母豬生殖障礙和仔豬嚴(yán)重呼吸困難和高死亡率為特征的一種高度接觸性傳染病[1]。本病于1987年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn),現(xiàn)流行于世界許多國(guó)家和地區(qū),對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大威脅。近年來(lái),我國(guó)也深受其害,2006年P(guān)RRS的大規(guī)模暴發(fā)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性打擊[2]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)分為美洲型和歐洲型兩種,在我國(guó)大陸地區(qū)主要為美洲型,近年也分離到少數(shù)歐洲型毒株[3]。2008年,我國(guó)將高致病性豬藍(lán)耳病列為一類動(dòng)物疫病。

    PRRSV基因組為單股正鏈RNA,大小為15 kb左右,含有8個(gè)開(kāi)放閱讀框,其中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,ORF2-7編碼結(jié)構(gòu)蛋白[4]。研究顯示,PRRSV感染后M蛋白和N蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,但無(wú)中和作用。E蛋白和GP5蛋白產(chǎn)生的中和抗體有不定期的保護(hù)作用[5]。豬感染PRRSV 后7天開(kāi)始出現(xiàn)抗體,2周后即可檢出抗N蛋白的抗體和基質(zhì)蛋白M的抗體,4~5周后才出現(xiàn)主要識(shí)別囊膜蛋白E特異性中和抗體。目前,針對(duì)PRRSV的檢測(cè),免疫效果評(píng)價(jià)以及疫病監(jiān)測(cè)和進(jìn)出境動(dòng)物檢疫工作中多數(shù)使用的是抗體ELISA檢測(cè)試劑盒。試劑盒的質(zhì)量成為影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。但目前市售試劑盒良莠不齊,不同品牌試劑盒檢測(cè)結(jié)果間存在差異。

    本研究采用兩步法,利用參考樣品(OIE參考實(shí)驗(yàn)室提供)和臨床樣品,對(duì)4種市售的PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)范圍、檢測(cè)限、診斷敏感性、診斷特異性、重復(fù)性幾個(gè)方面開(kāi)展了使用效果評(píng)價(jià)。研究結(jié)果為藍(lán)耳病檢測(cè)試劑盒的選擇提供了依據(jù),同時(shí)也為其他試劑盒的評(píng)價(jià)提供了參考。

    1 材料與方法

    1.1血清

    1.1.1參考血清。18份參考血清:由OIE豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)提供。5種參考血清購(gòu)自荷蘭GD公司,其中REF2為歐洲型血清,REF3為美洲型血清,REF4為美洲型血清,REF5為歐洲和美洲型血清,REF6為美洲型血清。

    1.1.2田間樣品。343份臨床血清樣品,包括免疫群血清75份、感染群血清176份、陰性血清92份。

    1.2試劑盒

    本研究中購(gòu)買的試劑盒品牌分別為IDEXX、Biochek、LSI、業(yè)為基,文中分別用A、B、C、D表示。通過(guò)初篩的試劑盒,每個(gè)抽取3個(gè)批次,每個(gè)批次抽3盒進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。批號(hào)見(jiàn)表1。

    表1 所用試劑盒品牌和批次號(hào)

    1.3方法

    1.3.1初篩。對(duì)OIE豬藍(lán)耳病參考實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的18份參考血清統(tǒng)一編號(hào),嚴(yán)格按照各試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均用550型酶標(biāo)儀按要求的波長(zhǎng)讀取數(shù)值,然后根據(jù)各試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

    1.3.2試劑盒最低檢測(cè)限的確定及試劑盒檢測(cè)范圍的測(cè)定。利用荷蘭GD公司的5份包含了歐洲型和美洲型的參考血清,進(jìn)行梯度稀釋(1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256),進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行結(jié)果判定。

    1.3.3試劑盒的診斷特異性、敏感性。利用343份血清臨床樣品,對(duì)4個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),判斷其診斷敏感性、診斷特異性。對(duì)于差異樣品,利用IFA方法作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步復(fù)核。根據(jù)測(cè)定的結(jié)果整理,如表2所示,計(jì)算診斷敏感性:DSe= TpDp/(TpDp+TnDp),診斷特異性為:DSp= TnDn/(TnDn+TpDn)。其中,TpDp為真陽(yáng)性、TnDp為假陰性、TnDn為真陰性、TpDn為假陽(yáng)性。

    表2 2×2列聯(lián)表

    1.3.4重復(fù)性測(cè)定。試劑盒:每種試劑盒抽取3個(gè)批次,每個(gè)批次抽取3個(gè)試劑盒;樣品:選取5份參考血清(4份陽(yáng)性、1份陰性),見(jiàn)表3。

    表3 PRRS重復(fù)性樣品表

    2 結(jié)果

    2.1初篩結(jié)果

    利用已知的參考樣品,對(duì)4個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B、C和D的檢測(cè)結(jié)果與18份樣品真實(shí)狀態(tài)符合率達(dá)100%,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,如表4所示。

    表4 4種試劑盒對(duì)PRRSV的參考血清的檢測(cè)

    2.2最低檢測(cè)限和檢測(cè)范圍測(cè)定結(jié)果

    本研究利用標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行稀釋,檢測(cè)試劑盒能檢測(cè)到的稀釋度(表5)。對(duì)于樣品REF2,A可檢測(cè)到1:8,其他試劑盒未檢出;對(duì)于樣品REF3,D可檢到1:16,其他試劑盒未檢出;對(duì)于樣品REF4,A可檢到1:32,B可檢到1:8,D可檢到1:64,C未檢出;對(duì)于樣品REF5,A可檢到1:16,B和D可檢到1:8,C未檢出;對(duì)于樣品REF6,A可檢到1:64,B可檢到1:32,D可檢到1:16,B未檢出。

    通過(guò)4種試劑盒對(duì)參考血清樣品的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),A和B對(duì)于歐洲型和美洲型病毒抗體均可檢測(cè),為通用型試劑盒;而C和D只能檢測(cè)美洲型病毒抗體。

    2.3診斷敏感性及診斷特異性

    利用343份豬血清樣品進(jìn)行試劑盒的Dse和Dsp的測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6。4種試劑盒的診斷敏感性都較好,都在90%以上,其中D的診斷敏感性最高,為96.55%;4種試劑盒的診斷特異性均在85%以上,A診斷特異性最高為97.14%,D的診斷特異性最低,為85%。

    表5 最低檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果

    表6 試劑盒的 DSe、DSp測(cè)定結(jié)果

    2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    4種試劑盒在批間和批內(nèi)測(cè)定的樣品都得到了一致的結(jié)果,說(shuō)明重復(fù)性良好,根據(jù)各試劑盒得出的S/P值計(jì)算批次間及批次內(nèi)的變異系數(shù)。如表7所示,A和B的批次間變異系數(shù)分 別為18.23±17.89%和18.20±8.65%,均 大于15%,批次內(nèi)變異系數(shù)分別為7.88±5.68%和11.34±5.60%,說(shuō)明這兩個(gè)品牌的試劑盒批內(nèi)重復(fù)性好而批次間的重復(fù)性差;D和C的批間變異系數(shù)分別為8.07±2.79%和17.22±6.29%,批內(nèi)變異系數(shù)分別為7.34±1.41%和8.66±4.74%,均小于10%,說(shuō)明兩種試劑盒的批內(nèi)重復(fù)性都很好,但批間重復(fù)性D優(yōu)于C。

    表7 各試劑盒批間與批內(nèi)變異系數(shù)(CV)

    3 結(jié)論與討論

    藍(lán)耳病試劑盒具有方便、快速等特點(diǎn),在體外診斷中被廣泛應(yīng)用。在口岸檢疫和國(guó)內(nèi)疫病監(jiān)測(cè)中,藍(lán)耳病檢測(cè)試劑盒也被廣泛應(yīng)用于疫情判定。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),僅國(guó)內(nèi)檢驗(yàn)檢疫部門每年購(gòu)買藍(lán)耳病抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的花費(fèi)已超過(guò)百萬(wàn)元。

    試劑盒的評(píng)價(jià)對(duì)今后建立和規(guī)范國(guó)內(nèi)檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)、市場(chǎng)準(zhǔn)入等管理制度,確保檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量,具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。國(guó)內(nèi)對(duì)動(dòng)物疫病的試劑盒評(píng)價(jià)仍然處于起步階段,如何科學(xué)、客觀、經(jīng)濟(jì)地評(píng)價(jià)一個(gè)試劑盒,成為研究的一個(gè)方向。目前已有對(duì)弓形蟲(chóng)、丙型肝炎、克倫特羅、商品化支原體液體培養(yǎng)、C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)的報(bào)道[6-12]。

    本研究建立了兩步法評(píng)價(jià)體系,并用其對(duì)市售的4種試劑盒進(jìn)行了使用效果評(píng)價(jià)。兩步法的優(yōu)點(diǎn)是,先用少量樣品,對(duì)試劑盒進(jìn)行初評(píng),能夠有效節(jié)約評(píng)價(jià)成本。兩步法評(píng)價(jià)體系分為兩個(gè)部分(圖1):第一步,利用待檢試劑盒對(duì)參考血清進(jìn)行檢測(cè),篩選出符合程度100%的試劑盒。第二步,對(duì)通過(guò)初篩的試劑盒,利用參考樣品和臨床樣品對(duì)這些試劑盒的檢測(cè)范圍、檢測(cè)限、重復(fù)性、診斷特異性和診斷敏感性進(jìn)行測(cè)定。對(duì)測(cè)定結(jié)果中存在差異的樣品,用(相對(duì))金標(biāo)方法進(jìn)行復(fù)核,以金標(biāo)方法結(jié)果為準(zhǔn),進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。通過(guò)分析比較試劑盒的特異性,敏感性及再現(xiàn)性等參數(shù),對(duì)試劑盒的優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)判。其結(jié)果可作為口岸檢疫、疫病監(jiān)測(cè)等工作試劑盒選擇的依據(jù),為提高檢測(cè)結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性奠定基礎(chǔ)。

    圖1 試劑盒評(píng)價(jià)方案

    通過(guò)兩步法,對(duì)4種PRRSV抗體ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),可以得出以下結(jié)論:PRRSV分為歐洲型(EU)和美洲型(US),因此試劑盒所能檢測(cè)的病毒類型是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。對(duì)初篩符合率100%的4個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)限及檢測(cè)類型的分析,發(fā)現(xiàn)僅有A和B試劑盒可以檢出歐洲型血清(REF2),其中A針對(duì)REF2的敏感性更高,能檢測(cè)到1:8個(gè)稀釋濃度。而在EU/US混合的血清中,1:1稀釋的情況下,4種試劑盒均能檢出,A的敏感度更高。而對(duì)US型的檢測(cè),D的敏感性高于C。值得注意的是,在另外3組僅含US型的血清中,敏感性的結(jié)果也不相同。在REF3中,D的敏感性最高,其它試劑盒敏感性相同。REF4中,D敏感性也最高,但是A>B> C。在REF6中,A的敏感性最高,而B(niǎo)>D> C。出現(xiàn)這種差異的主要原因很可能是因?yàn)槊總€(gè)試劑盒包被的抗原不同,并且包被的抗原的比例不同。而不同血清中,由于個(gè)體差異,免疫系統(tǒng)針對(duì)不同抗原產(chǎn)生的抗體的含量也不同,因此導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果的差異。由于缺乏對(duì)這些抗體的種類及抗體絕對(duì)定量的檢測(cè)方法,這些差異是否能作為判斷試劑盒好壞的標(biāo)準(zhǔn),還需要進(jìn)一步研究數(shù)據(jù)的支持。

    在利用大量臨床樣本進(jìn)行診斷特異性、診斷敏感性及重復(fù)性的測(cè)試中,A、B、C、D 等4種試劑盒的診斷敏感性和診斷特異性分別為:94.58%、97.14%、94.58%、89.29%和 93.1%、90%、96.55%和85%,其中,D的診斷敏感性最高,為96.55%,其他3個(gè)都在90%以上;A的診斷特異性最高,為97.14%,D的診斷特異性最差,為85%,由于各試劑盒能夠檢測(cè)的藍(lán)耳病抗體不同,需要結(jié)合檢測(cè)目的選擇合適的試劑盒使用。從重復(fù)性上看,幾乎所有試劑盒的批次間差異均顯著,大部分試劑盒的批次內(nèi)差異顯著。這說(shuō)明試劑盒批次間和批次內(nèi)存在不可忽略的系統(tǒng)誤差,從而影響了檢測(cè)結(jié)果。因此,在更換批次之前,建議對(duì)試劑盒進(jìn)行復(fù)驗(yàn)后再使用,以保證檢測(cè)的質(zhì)量。

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    (責(zé)任編輯:朱迪國(guó))

    中圖分類號(hào):S851.3

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

    文章編號(hào):1005-944X(2016)01-0071-05

    通訊作者:林祥梅

    Evaluation of ELISA Kits for PRRSV Antibody Detection by ‘Two Steps' Method

    Wang Qin1,Liu Xiaofei1,F(xiàn)eng Chunyan1,Zhai Xinyan2,Zhou Zhi2,Wu Shaoqiang1,Li Xiaolin1,Qiu Songyin1,Liu Dandan1,Lin Xiangmei1
    (1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine Institute of Animal Quarantine,Beijing 100029;2.China Animal Disease Prevention and Control Center,Beijing 100125)

    Abstract:This study aimed at evaluating four commercial ELISA kits for PRRSV antibody detection by using twosteps for the fi rst time. Firstly,18 reference sera were used to screen. Secondly,6 reference sera were used to detect the limitation of detection(LOD)and repeatability(Re),and 343 fi eld samples were used to test sensitivity and specifi city. The results showed that 4 kits were 100% identical to the reference seras in screening test in the fi rst step,and the sensitivity and specifi city of A,B,C and D were 94.58% and 97.14%,94.58% and 89.2%,93.1% and 90%,96.55% and 85% respectively in the second step. Kit A and B are universal kits for detecting antibody against EU and US type of PRRSV. Kit C and D can only detect US type virus antibody. D kit showed coeffi cient of variation was low among the batches and had good repeatability. The 4 PRRSV kits were varying in detection scale,validity and accuracy. By applying twostep method,this study supplied evidences for the selection of PRRSV antibodies ELISA detection kits,also gave the reference for the evaluation of animal disease detection.

    Key Words:PRRS;commercial ELISA diagnostic kit;diagnostic sensitivity;diagnostic specifi city;diagnostic repeatability

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