活體動物中大環(huán)內(nèi)脂類殘留檢測微生物抑制法的建立

黃 晨，陳本龍，王乃福，李衛(wèi)華（.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 30046；.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 66000）

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活體動物中大環(huán)內(nèi)脂類殘留檢測微生物抑制法的建立

黃 晨1，陳本龍1，王乃福1，李衛(wèi)華2
（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300461；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266000）

摘要：［目的］建立活體動物中大環(huán)內(nèi)酯類殘留的檢測方法。［方法］采用微生物抑制方法，對藤黃微球菌CMCC 28001的選擇性和特異性、樣品提取方法、平板制備條件、方法檢出限等技術(shù)參數(shù)進行研究。［結(jié)果］建立的方法可用于活體動物中紅霉素、泰樂菌素、螺旋霉素、林可霉素、吉他霉素和克林霉素等6種大環(huán)內(nèi)脂類藥物的殘留檢測。當菌懸液添加濃度為10-3倍稀釋液（5.5×106CFU/mL）以及培養(yǎng)基PH值為7.5且培養(yǎng)溫度為30℃時，可產(chǎn)生直徑最大，邊緣光滑、完整、清晰的抑菌圈。［結(jié)論］該方法具有良好的敏感性和重復(fù)性，成本低，操作簡便，是色譜分析、免疫分析等其它方法的有益補充。

關(guān)鍵詞：微生物抑制法；藤黃微球菌；大環(huán)內(nèi)脂；殘留；活體動物；抗生素

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrolide antibiotics，MALs）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌作用相近的堿性抗生素群，屬于中譜抗生素。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可分為14元環(huán)類，如紅霉素（Erythromycin）、羅紅霉素（Roxithromycin）、地紅霉素（Dirthromycin）；15元環(huán)類，如阿奇霉素（Azithromycin）；16元環(huán)類，如螺旋霉素（Spiramycin）、交沙霉素（Josamycin）、柱晶白霉素（Kitasamycin）和麥迪霉素（Midecamycin）［1-2］。獸醫(yī)臨床中常將其用于治療和預(yù)防畜禽呼吸道及消化道疾病，其對需氧革蘭陽性細菌、革蘭陰性球菌、厭氧球菌及軍團菌屬、支原體屬、衣原體屬等病原體有較強的抗菌活性，如紅霉素、泰樂菌素被廣泛用于家禽呼吸道疾病的治療［3］?？墒牵绻蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用方法不當或非法超量添加，可造成其在動物體內(nèi)或組織中的殘留。盡管大環(huán)內(nèi)酯類抗生素本身對機體沒有很強的毒性，但一些敏感個體食用了含有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的肉品后會產(chǎn)生劇烈的過敏反應(yīng)或胃腸道紊亂、腹瀉、惡心和嘔吐、肝損害等［4］。獸藥殘留的問題已引起國際社會的廣泛關(guān)注和各國政府的高度重視［5］。因此許多國家對動物使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行了嚴格控制。本研究可應(yīng)用于進出口活動物大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的快速篩選檢測，同時對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留監(jiān)控及強化食品安全有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備

培養(yǎng)皿、離心機、牛津杯、恒溫培養(yǎng)箱（0～50℃）、游標卡尺、電子天平（感量0.0001 g）、高壓滅菌器、可調(diào)移液器等。

1.2 菌種

藤黃微球菌 Micrococcus luteus CMCC 28001。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 細菌保存和傳代培養(yǎng)基。稱量蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15.0 g ，加入蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.3±0.1，將各成分加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15 min。

1.3.2 增菌固體培養(yǎng)基。稱量牛肉膏1.5g、酵母膏3.0 g、胰酪蛋白4.0 g、蛋白胨6.0 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15.0 g，加入蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.55±0.05，將各成分加熱溶解，分裝300 mL于克氏瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15 min。

1.3.3 檢定培養(yǎng)基。稱量牛肉膏1.5 g、酵母膏3.0 g、蛋白胨6.0 g、瓊脂15.0 g、加入蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.5±0.1，將各成分加熱溶解，分裝每瓶100 mL，121℃高壓滅菌15 min。

1.4 試劑

除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水，符合GB/T 6682的規(guī)定。

1.4.1 甲醇。

1.4.2 pH8.0磷酸鹽緩沖液。稱取0.523 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）及16.73 g磷酸氫二鉀（K2HPO4），用蒸餾水溶解并定容至1000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.4.3 標準物質(zhì)紅霉素。純度≥98%。

1.4.4 紅霉素標準儲備液。濃度為10μg/mL。稱取標準物質(zhì)紅霉素20.0 mg（精確至0.1mg），先用少量甲醇溶解，再用pH8.0磷酸鹽緩沖液定容至2 000 mL，置2～8℃冰箱中保存，可使用7 d。

1.4.5 紅霉素標準工作液。取紅霉素標準儲備液，用pH8.0磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度為0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL的標準工作液，須當日配制使用。

1.5 測定步驟

1.5.1 樣液制備

1.5.1.1 血液。未加入抗凝劑的全血樣品于室溫（20～22℃）靜置2～4 h（防止暴曬），待全血凝固并析出血清，將上層血清3 000 g離心15 min，取上清液進行檢測。

1.5.1.2 尿液。樣液經(jīng)3 000 g離心15 min后，取上清液進行檢測。

1.5.2 菌懸液的制備［6］。將復(fù)活的菌種接種于盛有增菌用固體培養(yǎng)基的克氏瓶中，反復(fù)傾斜克氏瓶，使菌液均勻覆蓋在培養(yǎng)基表面，30℃培養(yǎng)（18±1）h后，用10 mL滅菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液，2～8 ℃冰箱中保存，貯存期15 d。

1.5.3 菌懸液用量的測定。實際測定前，把不同量的菌懸液加入到檢定培養(yǎng)基中，制成平板，能使0.05μg/mL紅霉素標準工作液產(chǎn)生大于等于10 mm清晰、完整的抑菌圈為最佳菌懸液用量。

1.5.4 檢定用平板的制備。將檢定培養(yǎng)基熔化后，冷卻至45～50℃，加入適量菌懸液，混勻。立即取15 mL，注入培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基均勻覆蓋在其底面，保持水平使其凝固。制備好的平板置2～8℃冰箱中保存，貯存期2～3 d。

1.5.5 測定。取制備好的檢定用平板3個，在平板底部做好標記，把牛津杯適當間隔置于平板上，每個平板最多不超過6個。在相間隔的3個牛津杯中滴滿標準參考濃度工作液，另外3個牛津杯內(nèi)加滿被測樣液，將陶瓦蓋蓋好，置30℃培養(yǎng)（18 ±1）h，翻轉(zhuǎn)平板，除去牛津杯，如有抑菌圈產(chǎn)生，精確測量其直徑。

1.5.6 結(jié)果判定。檢定平板上待測樣品不產(chǎn)生抑菌圈或抑菌圈直徑＜10 mm的判定為“陰性”。檢定平板上待測樣品產(chǎn)生抑菌圈，抑菌圈直徑≥10mm的判定為“初篩陽性”。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌懸液濃度的影響

取藤黃微球菌增菌克氏瓶，用適量無菌生理鹽水洗下全部菌苔，充分震蕩后作為原液，并依次稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4直至10-8倍，然后利用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，同時以無菌生理鹽水作為空白，在600 nm波長下測定OD值，結(jié)果見表1。分別取10-2、10-3、10-4、10-5倍稀釋液，作為菌懸液加入到測定培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后發(fā)現(xiàn)10-5倍稀釋液平板上抑菌圈非常模糊，邊緣不清晰，難以測量。10-2、10-3、10-4倍稀釋液的標準曲線見圖1。

圖1 菌懸液濃度的影響

表1 不同濃度菌懸液的OD值

表2 培養(yǎng)基pH 值對抑菌圈直徑的影響

從圖1可以看出，10-2、10-3、10-4倍稀釋液三者的準確度比較接近，靈敏度依次增加。10-3倍稀釋度的菌懸液準確度最高，雖然其靈敏度稍低于10-2倍稀釋度，但其產(chǎn)生的抑菌圈非常清晰，最容易觀察和測量。

2.2 培養(yǎng)基pH值對抑菌圈大小的影響

分別配置pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的檢定培養(yǎng)基制備平板，每一工作pH值重復(fù)制備3個平板，30℃培養(yǎng)，測定不同pH值培養(yǎng)平板上各標準品中心參照濃度所產(chǎn)生的抑菌圈直徑的平均值，不同時間重復(fù)測定3次，比較pH值在6.5～8.5范圍的檢定培養(yǎng)基對抑菌圈大小的影響，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明：pH值為6.5、7和7.5時，雖然抑菌圈直徑并不都是愈來愈大，但其差異不顯著；pH值為8.0和8.5時，隨pH值的增大，細菌的生長受到抑制，抑菌圈邊緣愈來愈不平整、不清晰。就整體而言，pH值為7.5時菌落生長致密，可產(chǎn)生最大的、邊緣清晰完整的抑菌圈，所以本實驗的最適pH值選定為7.5。

2.3 單雙層平板的比較

2.3.1 單層平板的比較。取4套平板，均鋪成單層平板，每套平板中單個培養(yǎng)基的加量分別為10 mL、15 mL、20 mL、25 mL，所得數(shù)據(jù)見圖2。從比較結(jié)果可以看出，隨著培養(yǎng)皿中檢測培養(yǎng)基加量的增加，檢測的靈敏度逐漸降低，但其斜率變化不大，加量為15 mL時準確度較高。

2.3.2 雙層平板的比較。變換各種不同底層和菌層培養(yǎng)基的配比，依次制成雙層（20+5） mL、（15+5） mL、（15+10） mL、（10+10） mL（“+”號前后兩個數(shù)字分別代表底層和菌層培養(yǎng)基的加量）平板各一套，30℃培養(yǎng)18 h后測量各抑菌圈直徑，所得標準曲線見圖3。從比較結(jié)果可以看出，各曲線斜率比較接近，即對檢測的準確度影響不大，但對同一菌層而言，較小底層培養(yǎng)基加量的靈敏度較高，這可能是由于提高了指示菌敏感性的緣故。

圖2 單層平板的比較

圖3 雙層平板的比較

圖4 溫度的影響

2.3.3 比較。結(jié)合兩種平板的比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用單層加量15 mL或者雙層（15+5）mL的培養(yǎng)基都可以得到較好的結(jié)果，但考慮到操作的方便性，選用單層加15 mL培養(yǎng)基。

2.4 培養(yǎng)溫度的影響

采用三種不同的培養(yǎng)溫度（25℃、30℃、35℃），培養(yǎng)18 h后，在30℃和35℃培養(yǎng)的平板均出現(xiàn)較清晰的抑菌圈，而在25℃的培養(yǎng)平板上培養(yǎng)至48 h時，抑菌圈邊緣仍比較模糊。30℃和35℃的標準曲線見圖4。從結(jié)果可以看出，30℃培養(yǎng)的斜率較大，x軸截距較小，所以選擇30℃作為檢測的培養(yǎng)溫度比較合適。

2.5 最低檢測限的確定

取紅霉素和螺旋霉素標準儲備液用磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度，以相應(yīng)標準溶液的中心濃度為參照濃度，加入到相間隔的3個牛津杯中，其余3個牛津杯中加入其它濃度中的1個，重復(fù)3個平板。用藤黃微球菌做抑菌實驗，測定各濃度標準品稀釋液所產(chǎn)生的抑菌圈直徑，以產(chǎn)生明顯抑菌圈的最小濃度為最低檢測限，結(jié)果見表3。

由測定結(jié)果可知，本方法在活體動物血液和尿液中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的最低檢測限為0.05 mg/kg。查閱資料可知，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在體內(nèi)分布廣泛，由于其呈弱堿性和脂溶性，在組織/血漿中的比值為（5～10）∶1，且在低pH值的組織特別是肺組織中濃度較高，一般肝＞肺＞腎＞血漿，肌肉和脂肪中濃度最低［7］。 由此可知，按照此方法檢出活體動物大環(huán)內(nèi)酯類抗生素陽性后，可按照5～10倍含量推算該動物肌肉組織中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量。

2.6 交叉反應(yīng)與特異性測定

表3 測定低限

2.6.1 交叉反應(yīng)性測定。為了驗證本方法對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的選擇性，選取紅霉素、螺旋霉素、泰樂菌素、林可霉素、吉他霉素、克林霉素進行交叉反應(yīng)試驗。在磷酸鹽緩沖液中加入一定濃度的藥物標準品，分別測定其抑菌圈直徑（重復(fù)6次），計算平均值，結(jié)果見表4。結(jié)果表明本方法對各大環(huán)內(nèi)酯類藥物高度敏感。

2.6.2 特異性測定。用磷酸鹽緩沖溶液配制0.05μg/mL的紅霉素、螺旋霉素、恩諾沙星、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)霉素的標準溶液，分別培養(yǎng)，測定6次樣品抑菌圈直徑，計算平均值，結(jié)果見表5。結(jié)果表明其他類藥物經(jīng)培養(yǎng)不能產(chǎn)生邊緣清晰的抑菌圈，說明本方法對各大環(huán)內(nèi)酯類藥物特異性良好。

表4 交叉反應(yīng)測定結(jié)果（n=6）

表5 特異性反應(yīng)測定結(jié)果（n=6）

2.7 精密度試驗

表6 日內(nèi)差異（n=3）

表7 日間差異（n=3）

精密度是指用某種方法重復(fù)測定同一均值樣品所得測定值的彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性，常用變異系數(shù)（CV）表示。選擇高、中、低3個濃度在同一日和不同日分別測定3批，計算其日內(nèi)及日間差異，結(jié)果見表6、表7。公式如下：

式中：S為標準偏差；—x為各測量值的平均值。

實驗結(jié)果表明，本實驗的日內(nèi)和日間差異變異系數(shù)均低于10%，說明本實驗具有較高的精密度，可滿足實驗的要求。

3 小結(jié)

本研究建立的活體動物中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留微生物抑制檢測方法的檢測結(jié)果準確可靠。該方法簡便易行，樣品前處理簡單，成本相對較低，可快速、準確地對采集的血液、尿樣樣品進行大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留測定，具有很好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，而且不需要昂貴的檢測儀器，是色譜分析、免疫分析等其他方法的有益補充。本方法不會產(chǎn)生假陰性結(jié)果，但對可能產(chǎn)生的假陽性結(jié)果應(yīng)進一步采用儀器分析的方法進行確證。

參考文獻：

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（責任編輯：杜憲）

Establishment of Microbial Inhibition Method for Lipid Residues Detection in Living Animals

Huang Chen1，Chen Benlong1，Wang Naifu1，Li Weihua2
（1.Animal & Plant & Foodstuffs Inspection Center， Tianjin Import & Export Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461；2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266000）

Abstract：［Objective］ To establish a detection method for Macrolide Antibiotics in living animals.［Methods］The conditions of Microbiological inhibition assay method were optimized， such as selectivity and specifi city of the Micrococcus Luteus CMCC28001， which was a sensitive strain to the test， the sample extraction method， the condition of plate preparation and the detection limit of the procedure.［Results］The procedure was suitable for testing the residue of Macrolide Antibiotics（Erythrocin， Tylosin， Spriamycin， Lincomycin， Kitasamycin， Clindamycin）.When the inoculum concentration were 10-3（5.5×106CFU/mL）of the Micrococcus Luteus， the inhibition zone diameters were the biggest of the center concentration and the edges were clearly.And the best pH of substrate was 7.5， and the best culture temperature was 30℃.［Conclusions］The microbial inhibition method of Micrococcus Luteus used as an indicator is capable of detecting antibiotic residues in animal sera， simple for operation， and low in cost and has good sensitivity and repeatability.This study provides useful supplement for other methods such as color spectrum analysis and immune analysis.

Key words：Microbiological inhibition assay method；Micrococcus Luteus；Macrolide；residue；living animals；antibiotics

中圖分類號：S859.84

文獻標識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）02-0029-05