一測多評法測定決明子中蒽醌苷元類和萘并吡喃酮苷類有效成分含量

魏喜芹，魏世杰，馬研妮

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 藥劑科，寧夏 銀川 750004)

一測多評法測定決明子中蒽醌苷元類和萘并吡喃酮苷類有效成分含量

魏喜芹Δ，魏世杰，馬研妮

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 藥劑科，寧夏 銀川 750004)

目的 建立決明子中蒽醌苷元類和萘并吡喃酮苷類有效成分含量的一測多評法。方法 采用Sunfire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，乙腈-0.1% 磷酸水溶液梯度洗脫，檢測波長278 nm和284 nm，測定橙黃決明素與紅鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚間的相對校正因子，并考察其重現(xiàn)性，比較計算值與測得值的差異。結(jié)果 紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚分別在：0.0503～1.5078、0.3197～9.5899、0.5070～15.2108、0.4027～12.0814 μg范圍呈良好線性；回歸方程分別為：Y=4.95X+2.01(R2=0.9998)、Y=1.03X+0.03(R2=0.9999)、Y=3.98X-0.12(R2=0.9993)、Y=4.81X+0.26(R2=0.9996)；用一測多評法對6批決明子中大紅鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚進行測定，與外標法實測值基本一致。結(jié)論 該方法可靠，結(jié)果準確，可用于決明子的質(zhì)量控制。

一測多評法；決明子； 萘并吡喃酮苷； 蒽醌苷元； 紅鐮霉素龍膽二糖苷；橙黃決明素；大黃酚；大黃素甲醚

決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子。其性味甘、苦、咸，微寒；具有清熱明目，潤腸通便之功效。常用于目赤澀痛，羞明多淚，頭痛眩暈，目暗不明和大便秘結(jié)癥候[1]。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中早有記載 “久服能益精光，輕身”，國家衛(wèi)生部也將決明子藥食同源物質(zhì)之一。據(jù)文獻報道[2-3]，決明子主要含有蒽醌苷元類、萘并吡喃酮苷類脂肪類、肥皂化物質(zhì)、糖及氨基酸類和無機元素等成分。其中蒽醌類代表性成分有大黃酚、大黃素甲醚、橙黃決明素、黃決明素、決明素、大黃素等，而萘并吡喃酮苷類的主要代表性成分為紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷、決明子苷B、決明子苷C 等。蒽醌類成分具有瀉下和降血脂等作用，萘并吡喃酮苷類可以用于保肝和抗肝毒等癥候[4-6]。

目前，針對決明子有效成分相關(guān)研究甚多，但大多是圍繞單個或者2～3個成分開展，不能達到全面控制決明子質(zhì)量的目的，而且往往牽涉到許多種對照物質(zhì)，試驗操作繁瑣，成本較高[7-8]。因此，本研究選取決明子中蒽醌苷元類代表性成分大黃酚、橙黃決明素、大黃素甲醚和萘并吡喹酮苷類成分紅鐮霉素龍膽二糖苷為對象，以橙黃決明素為參考物，采用高效液相色譜雙波長法建立決明子一測多評法，為控制決明子藥品質(zhì)量和制定質(zhì)控方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：決明子藥材分別采集于安徽亳州、湖北襄樊、湖北宜春、安徽合肥、陜西西安、安徽阜陽，上述決明子經(jīng)本市藥檢所中藥室王英華主任鑒定均為豆科決明(CassiaobtusifoliaL)的干燥成熟種子。

大黃素甲醚對照品(批號:110758-201013，99.8%)、大黃酚對照品(批號:110796-201017，99.6%)、橙黃決明素(批號:111900-201504)、以上3種對照物質(zhì)均購自中國食品藥品鑒定研究院；紅鐮霉素龍膽二糖苷(批號: 20120614)購自上海永恒生物科技有限公司。乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

1.1.2 實驗儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司，1260VWD檢測器，Agilent ChemStation for LC systems色譜工作站)；DIONEX UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司，SRD-3400A分析泵、WPS-3000自動進樣器、TCC-3000SD柱溫箱、VDW-3000檢測器、工作站：Chromeleon?Dionex)；Waters 2695-2489高效液相色譜儀(美國沃特世科技有限公司，Empower色譜工作站)；色譜柱：Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sunfire ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)和SHIMADZU C18(250 mm×4.6 mm，4.5 μm)；JL-3600DT型數(shù)控超聲波清洗器(上海杰理超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Sunfire ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，程序：①0～18 min,乙腈濃度20%→35%，波長278 nm，②18～25 min,乙腈濃度35%→60%，波長284 nm，③25～50 min,乙腈濃度60%→85%，波長284 nm；流速：0.9 mL/min,柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

1.2.2 溶液的制備：

① 混合對照品溶液的制備:精密稱取紅鐮霉素龍膽二糖苷對照品25.1298 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇適量超聲使溶解，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為紅鐮霉素龍膽二糖苷對照品儲備液。分別精密稱取橙黃決明素、大黃酚、大黃素甲醚對照品各適量至同一50 mL容量瓶中，同時精密量取紅鐮霉素龍膽二糖苷對照品儲備液1 mL置其中，加無水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液稀釋至刻度，混勻，即制得每1 mL中含有紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚為0.050 259 6、0.319 662、0.507 028、0.402 712 mg的混合對照品溶液，備用。

② 供試品溶液的制備[1]：精密稱取6批來源不同的樣品粉末(過3號篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加稀鹽酸30 mL，置水浴加熱水解1 h，置冰浴冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

1.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗：取混合對照溶液和供試品溶液按“1.2.1”項色譜條件進行分析，記錄色譜圖。

1.2.4 一測多評方法學考察

① 線性關(guān)系的考察：按照“1.2.1”項色譜條件，精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20、25、30 μL，注入色譜儀測定，記錄譜圖。以對照品進樣量(μg)為橫坐標(X)，以對照品峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸。

② 穩(wěn)定性試驗：取安徽亳州產(chǎn)決明子供試品溶液，室溫放置0、5、10、15、18、24、30、36 h，按照“1.2.1”項的色譜條件進行測定。

③ 精密度試驗：取混合對照品溶液10 μL，按照“1.2.1”項的色譜條件，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖。

④ 加樣回收率試驗：取已知含量的安徽亳州產(chǎn)決明子粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚對照品混合液1 mL(分別相當于0.050 3、0.319 7、0.507 0、0.402 7 mg)，按“1.2.2”項下供試品制備方法和“1.2.1”項色譜條件測定，計算回收率。

1.2.5 相對校正因子計算：本研究以橙黃決明素為內(nèi)參物，分別計算紅鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚的相對校正因子。按王智民等[9]提出的一測多評公式計算：

f=fs/fi=AsCi/AiCs

(注：As——內(nèi)參物對照品峰面積，Cs——內(nèi)參物濃度，Ai——待測成分峰面積，Ci——待測成分濃度)。

精密吸取5、10、12、15、20、25 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.6 校正因子重現(xiàn)性考察：精密吸取對照混合溶液，分別在3臺不同型號高效液相色譜儀(Waters 2695-2489、SHIMADZU LC-10tvp、戴安UltiMate 3000)上進行試驗，每臺儀器分別考察Sunfire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和SHIMADZU C18(250 mm×4.6 mm，4.5 μm)3根不同廠家色譜柱對相對校正因子的影響。

1.2.7 色譜峰專屬性考察：一測多評法應(yīng)用的前提必須是色譜峰能夠準確定位，本實驗結(jié)合各成分色譜圖整體特征采用相對保留時間進行定位，并采用不同型號高效液相色譜儀對相對保留時間進行考察。

1.2.8 樣品測定：取6批來源不同的決明子粉末，按照“1.2.1”項的色譜條件進行試驗，分別采用外標法和一測多評法計算紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果 各組分峰分離良好，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按橙黃決明素計大于3000，各峰峰形較好，本色譜系統(tǒng)適合本研究成分的分析。見圖1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard (A) and sample(B)

2.2 一測多評方法學考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果：紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚線性回歸方程分別為：Y=4.95X+2.01(R2=0.9998)、Y=1.03X+0.03(R2=0.9999)、Y=3.98X-0.12(R2=0.9993)、Y=4.81X+0.26(R2=0.9996)，線性范圍分別在：0.0503～1.5078、0.3197～9.5899、0.5070～15.2108、0.4027～12.0814 μg。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果：紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積RSD(n=8)分別為1.4%、0.6%、0.9和1.2%，表明供試品溶液在36 h穩(wěn)定。

2.2.3 精密度試驗結(jié)果：結(jié)果紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積RSD(n=6)RSD分別為0.5%、0.2%、0.8%和0.9%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4 加樣回收率試驗結(jié)果：各成分回收率結(jié)果見表2～5。

表2 紅鐮霉素龍膽二糖苷回收率測定結(jié)果(n=6)

表3 橙黃決明素回收率測定結(jié)果(n=6)

表4 大黃酚回收率測定結(jié)果(n=6)

表5 大黃素甲醚素回收率測定結(jié)果(n=6)

2.2.5 相對校正因子計算結(jié)果：鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚的相對校正因子分別為0.680、1.125和0.972，RSD(n=6)分別為1.1%、0.3%和0.5%。

2.2.6 相對校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果：通過對三臺色譜儀和三根色譜柱交叉考察，結(jié)果鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚的相對校正因子RSD分別為1.0%、0.2%和0.5%，相對校正因子重現(xiàn)性較好，方法耐用性強，簡單實用。見表6。

表6 高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子的影響(n=9)

2.2.7 色譜峰專屬性考察結(jié)果：依“1.2.1”色譜條件測定，結(jié)果紅鐮霉素龍膽二糖苷、橙黃決明素、大黃酚和大黃素甲醚相對保留時間分別為：0.742、1.757和2.004，RSD(n=9)分別為0.5%、0.3%和0.6%。相對保留時間比較穩(wěn)定，可用來準確定位各種成分，為進一步開展一測多評法研究打下基礎(chǔ)。

2.2.8 樣品測定結(jié)果：為分析一測多評法與外標法是否存在差異，筆者采用2種方法進行考察：①通過比較兩種方法所測含量的夾角余弦值[5]，紅鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚夾角余弦值分別為0.999 2、0.999 2和0.999 3；②2種方法測定結(jié)果RSD值均小于0.5%?？梢钥闯霾捎靡粶y多評法和外標法測得結(jié)果基本一致。見表7。

表7 樣品的測定結(jié)果

3 討論

本研究旨在建立一種簡便快捷實驗方法來控制決明子藥材中有效成分的含量。實驗初期，曾計劃盡可能多的將該藥材所含成分納入研究，后經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)有個別成分在不同來源的藥材中含量差異太大，有的甚至檢測不出。所以最終確定本研究4中目標成分為研究對象，而這4中成分中，橙黃決明素在不同來源決明子中含量差異不大，而且含量較高，峰行也可以，確定將此作為參考物以研究其他成分。

藥材提取是否完全對試驗結(jié)果影響很大，本實驗涉及到兩類化合物，本身物理性質(zhì)存在差異，這給供試品制備方法的建立帶來很大麻煩。為探索供試品制備方法，在前期預(yù)實驗-正交實驗的基礎(chǔ)上，確定甲醇濃度、溶劑用量、加熱回流時間為主要影響因素，本研究提取條件可以將目標成分完全提取。

通過對混合對照溶液紫外可見光全波長掃描，光譜圖在225、258、275、278、284 nm處有較好的吸收，結(jié)合相關(guān)文獻，試驗初期采用278 nm為檢測波長進行試驗,發(fā)現(xiàn)橙黃決明素、大黃酚、大黃素甲醚有較好色譜行為，但紅鐮霉素龍膽二糖苷信號較弱，無法滿足定量計算要求，最后采用278 nm和284 nm波長變換方法進行試驗，結(jié)果能達到較為理想的效果。

一測多評法(QAMS)有著簡便、快捷、經(jīng)濟等優(yōu)點，不少文獻采用一測多評法對中成藥進行了研究[9-12]，它可以解決因?qū)φ掌凡蛔慊虿环€(wěn)定所帶來藥品無法檢測的困難，同時也可以避免配制多種對照品給實驗帶來的誤差，是一種值得探討檢驗方法。本研究可以在確證橙黃決明素的前提下，利用相對保留時間對紅鐮霉素龍膽二糖苷、大黃酚和大黃素甲醚進行定性，利用相對校正因子對3種成分進行定量，為對決明子進行全面質(zhì)控參考。

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(編校：王冬梅)

Determination of naphthopyrone glycosides and anthraquinone aglycone inCassiatoraLby quantitative analysis of multi-components by single marker

WEI Xi-qinΔ, WEI Shi-jie, MA Yan-ni

(Department of Pharmacy, Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750004, China)

ObjectiveTo develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS) for determination of effective components of naphthopyrone glycosides and anthraquinone aglycone inCassiatoraL.MethodsThe separation was performed on a Sunfire C18column(4. 6 mm ×250 mm，5 μm), and column temperature 30 ℃. Aetonitrile-0.1% H3PO4was used as the mobile phase with gradient elution. The detection wavelength was at 278 nm and 284 nm. Relative correction factor by determination of Between aurantio-obtusin and rubrofusarin-gentiobioside or chrysophanol or physcion.the method was evaluated for reproducibility, and the difference between calculated and measured values was compared. ResultsRubrofusarin-gentiobioside, aurantio-obtusin, chrysophanol and physcion respectively 0.0503-1.5078,0.3197-9.5899,0.5070-15.2108, 0.4027-12.0814 μg showed a good linear relationship, and the regression equation isY=4.95X+2.01(R2=0.9998),Y=1.03X+0.03(R2=0.9999),Y=3.98X-0.12(R2=0.9993),Y=4.81X+0.26(R2=0.9996).The quantitative results of six batches ofCassiatoraLby QAMS was basically consistent with that by external standard method. ConclusionThe QAMS method was reliable and accurate, which might be used for the quality control ofCassiatoraL.

quantitative qnalysis of multi-components by single marker;CassiatoraL;naphthopyrone;anthraquinone;rubrofusarin-gentiobioside;aurantio-obtusin;chrysophanol;physcion

魏喜芹，通信作者，女，本科，副主任藥師，研究方向：藥物的臨床應(yīng)用，E-mail：3362869693@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.60