患者HPA 1-6，9，15基因多態(tài)性對(duì)血小板輸注無效的臨床意義

李園，曾惠， 吳海兵，趙曉燕，顏敏超，郭曉

(嘉興市第一醫(yī)院 血液科，浙江 嘉興 314001)

患者HPA 1-6，9，15基因多態(tài)性對(duì)血小板輸注無效的臨床意義

(嘉興市第一醫(yī)院 血液科，浙江 嘉興 314001)

目的 觀察人類血小板特異性抗原(human platelet alloantigens， HPA)1-6，9，15系統(tǒng)及其基因多態(tài)性與血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness， PTR)的研究。方法 選取40例血小板輸注無效患者的外周血標(biāo)本和供者標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行血小板特異性糖蛋白抗體檢測(cè)，根據(jù)血小板回收率評(píng)判血小板輸注效果，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合直接測(cè)序方法，對(duì)供、患者進(jìn)行HPA1-6，9，15抗原系統(tǒng)基因進(jìn)行分型，動(dòng)態(tài)觀察患者同型血小板輸注后血小板恢復(fù)百分率(percent platelet recovery，PPR)，探討HPA基因多態(tài)性和血小板輸注無效的關(guān)系。結(jié)果 患者和供者HPA-1、4、9均未檢測(cè)出HPA-b基因，呈呈aa純合子單態(tài)性分布；HPA-5、6則主要以aa純合子為多，較少看到bb純合子。而HPA-2、3、15呈明顯多態(tài)性分布，HPA-2、3、5、6、15等位基因頻率均呈多態(tài)性分布。結(jié)論 對(duì)反復(fù)多次發(fā)生血小板輸注無效的患者，除需考慮HLA基因相關(guān)外，還與HPA基因多態(tài)性相關(guān)。在做HPA配型時(shí)，多數(shù)人只需檢測(cè)供者與患者HPA2、3、15基因就可以顯著減少血小板輸注無效的發(fā)生。

血小板特異性抗原；基因多態(tài)性；血小板輸注無效；血小板恢復(fù)百分率

人類血小板特異性抗原(human platelet alloantigens， HPA)是血小板糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，其主要表達(dá)于血小板膜糖蛋白上[1]。血小板膜糖蛋白基因迄今為止已有22中，這些基因具有單核苷酸多態(tài)性(SNP)[2]，從而導(dǎo)致HPA的多態(tài)性。且HPA基因頻率與種族、地域等關(guān)系密切[3]。若HPA不合則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體進(jìn)而引起免疫反應(yīng)導(dǎo)致血小板損傷。其與輸血過程中可能出現(xiàn)的血小板輸注無效(PTR)、輸血后紫癜(PTP)等直接相關(guān)[4]。PTR是指臨床上應(yīng)用血小板輸注進(jìn)行治療時(shí)，患者血液內(nèi)的血小板計(jì)數(shù)增加值顯著低于臨床預(yù)期或者患者再次出血現(xiàn)象甚至?xí)捎谘“宓钠茐亩＜吧黐5]。血小板輸注是目前治療血小板減少及預(yù)防出血的主要方法，但可能會(huì)產(chǎn)生PTR，達(dá)不到理想的治療效果[6]。有研究表明[7]，引起PTR的主要為人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，但是HPA引起的PTR的嚴(yán)重程度顯著高于HLA。而引起PTR的HPA系統(tǒng)主要集中在HPA1-6，9，15[8]中。因此，本次研究主要集中于以上幾個(gè)系統(tǒng)。

為了對(duì)HPA1-6，9，15的基因多態(tài)性與PTR的發(fā)生情況進(jìn)行研究，本次選取了40例PTR患者及供者作為研究對(duì)象，通過PCR和直接測(cè)序的方法對(duì)研究對(duì)象的外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)HPA抗原系統(tǒng)進(jìn)行分型，明確PTR與HPA抗原系統(tǒng)基因的聯(lián)系，為臨床合理治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取于2015年1月～2015.6來嘉興市第一醫(yī)院就診的血小板輸注患者40例，年齡23～84歲，平均年齡(45±17)歲，其中男性19例，女性21例。病例中包括免疫性血小板減少性紫癜16例，白血病16例，再生障礙性貧血4例，骨髓增生異常綜合癥患者3例，巨球蛋白血癥1例。所有患者均符合臨床血小板輸注無效的診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷及輔助檢查確認(rèn)為血小板輸注無效患者;②HIV抗體陰性患者;③排除了患者與供者由于HLA類抗體導(dǎo)致的PTR；排除標(biāo)準(zhǔn)：①彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、敗血癥、脾腫大及輸注前后6 h體溫38.5者;②血小板輸注前24 h服用兩性霉素B、萬古霉素者及輸注前1個(gè)月內(nèi)輸注靜脈免疫球蛋白者;③在檢測(cè)血小板輸注后24 h PPR之前又輸注其他血液者。供血者來源于嘉興中心血站提供的血液樣本。所有患者及其家屬均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑：HPA Ready Gene Plus 試劑盒(德國 inno-train 公司)；DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；Taq酶(Promega 公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國ABI9700)；ELX型通用酶標(biāo)儀(美國Bio-Tak公司)；低溫高速離心機(jī)(BECKMAN 64R)，凝膠成像儀(美國 Bio-Rad)，瓊脂糖凝膠電泳儀(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟：取患者外周靜脈抗凝血5 mL，按照QIAGEN公司的DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行微注法DNA的提取，測(cè)定其濃度。根據(jù)HPA1-6，9，15系統(tǒng)的基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 2 min 進(jìn)行變性，94 ℃ 15 s、65 ℃ 60 s進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，94 ℃ 15 s， 61 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s的條件進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，4延伸15 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，并于紫外凝膠成像儀中進(jìn)行分析。對(duì)所有合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，并與HPA1-6，9，15系統(tǒng)的基因序列進(jìn)行比對(duì)，盡可能挑出覆蓋HPA1-6，9，15系統(tǒng)抗原的血小板細(xì)胞。

1.2.3 血小板輸注療效判定標(biāo)準(zhǔn)：臨床上一般用血小板恢復(fù)百分率(PPR)和輸注后血小板計(jì)數(shù)糾正增加指數(shù)(CCI)作為血小板輸注效果評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]。輸注24 h后，若PPR20%或者CCI<10則認(rèn)為血小板輸注無效(PTR)[10]。

2 結(jié)果

2.1 患者與供者HPA 1-6，9，15 抗原相合與否與發(fā)生PTR的臨床觀察 對(duì)40例輸注無效的患者和36名健康獻(xiàn)血者進(jìn)行HPA1-6，9，15抗原分型及匹配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40例發(fā)生PTR的患者中，有39例患者與供者的HPA分型不合，占97.5%，顯著高于患者與供者HPA分型相合時(shí)發(fā)生的PTR比例(2.5%)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 供患雙方HPA分型情況與臨床PTR發(fā)生率的相關(guān)性比較

**P<0.01，與HPA分型不合患者相比，compared with for both sides with HPA classification incompatibility

2.2 患者與供者HPA系統(tǒng)中基因的多態(tài)性分布 對(duì)患者和供者的HPA1-6，9，15系統(tǒng)及其基因分布進(jìn)行分析研究，PCR結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 患者HPA1-6，9，15基因檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of patient HPA1-6, 9, 15 gene test

圖2 供者HPA1-6，9，15基因檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of donor HPA1-6, 9, 15 gene test

對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，患者與供者的HPA 1、4、9均未發(fā)現(xiàn)HPA-b基因，均呈aa純合子單性態(tài)分布；HPA 5、6則主要以aa純合子為多，極少能夠發(fā)現(xiàn)bb純合子；HPA2、3、15則呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性分布。且HPA 2、3、5、6、15等位基因頻率均呈現(xiàn)多態(tài)性分布，其中，HPA 3、15的雜合度最高，而b等位基因的頻率則以HPA 15 為最高(0.569)，其次為HPA 3(0.458)和HPA 2(0.097)。具體結(jié)果見表2、3。

表2 患者HPA 1-6，9，15等位基因分布情況

表3 供者HPA 1-6， 9， 15等位基因分布情況

綜上分析，HPA1-6，9，15等位基因中，HPA2，3，15呈現(xiàn)出較明顯的基因多態(tài)性分布情況，若在輸血過程中僅關(guān)注血型的匹配，則極有可能因這些基因的多態(tài)性分布而導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重的血小板輸注無效的情況，若能很好的控制供患雙方這些基因的匹配度則可能極大的減少血小板輸注無效的發(fā)生率，具有極強(qiáng)的臨床意義。

3 討論

血小板輸注是臨床上治療血小板減少和預(yù)防出血的重要方法，但是其可能會(huì)導(dǎo)致血小板輸注無效(PTR)。導(dǎo)致PTR的原因有多種，包括自身免疫性疾病、部分抗生素的使用、ABO血型抗原、HLA抗體、HPA抗體等[11]。在我國大部分地區(qū)，對(duì)患者進(jìn)行輸血時(shí)僅考慮了ABO血型這一因素[12]，因此臨川上血小板輸注效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，在免疫性致病因素中，HLA占80%，HPA因素占11.7%[13]，2者約占所有病因的16.2%，不容忽視，而HPA不匹配導(dǎo)致的PTR反應(yīng)可能會(huì)更嚴(yán)重。HPA不合的輸注可以導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生血小板同種的抗體從而引起血小板破壞，并且不合度越高，產(chǎn)生PTR的嚴(yán)重程度越高[14]。臨床上在進(jìn)行血小板輸注的時(shí)候，選擇與患者HLA和HPA均匹配的血小板或許是減少發(fā)生PTR的有效方法之一。

為了研究HPA1-6，9，15系統(tǒng)中基因多態(tài)性對(duì)血小板輸注無效的臨床意義，本研究選取了血小板輸注無效患者，采用PCR和直接測(cè)序相結(jié)合的方法對(duì)患者和供血者外周血進(jìn)行測(cè)試，并對(duì)HPA1-6、9、15系統(tǒng)等位基因進(jìn)行分型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTR患者中HPA分型不合占97.5%，顯著高于HPA分型相合的患者(2.5%)，從一定程度上提示患者和供血者的HPA分型相合有助于減少PTR的發(fā)生率。對(duì)HPA1-6、9、15系統(tǒng)等位基因多態(tài)性的分布中發(fā)現(xiàn)，患者和供者血清中HPA 2、3、15呈現(xiàn)出較明顯的多態(tài)性分布，且HPA 2、3、5、6、15等位基因頻率均呈現(xiàn)多態(tài)性分布，其中，HPA 3、15的雜合度最高，這也與其他一些研究相符合[15-16]，提示：這些系統(tǒng)基因分布的不合的比例很高，很可能是造成PTR產(chǎn)生的重要原因。

綜上所述，在進(jìn)行血小板輸注時(shí)，除需考慮ABO血型相匹配外，HLA和HPA基因的匹配也應(yīng)納入選擇標(biāo)準(zhǔn)，而做HPA配型時(shí)，多數(shù)患者只需檢測(cè)供者和受者的HPA2 、3、15基因即可顯著減少血小板輸注無效的發(fā)生。這樣既可以減少成本又能夠提高治療效率。但是，本次研究納入的研究對(duì)象僅有40例，并且僅局限于一個(gè)地區(qū)，由于HPA在人群中的分布情況與地域、人種等均有較密切的關(guān)系，因此還需納入更多的研究樣本進(jìn)行分析才能得出更加準(zhǔn)確的結(jié)論，為臨床治療提供有效的參考數(shù)據(jù)。

[1] 劉忠，等.HPA配型在免疫性血小板輸注無效中的應(yīng)用研究[J]. 中國輸血雜志， 2011(06)： 474-477.

[2] 陳揚(yáng)凱，等.血小板特異性基因(HPA-1～17)在廣州地區(qū)人群中分布的多態(tài)性研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志， 2010(08)： 699-702.

[3] 唐利娟，等. 兒童慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜與HPA基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J]. 中國輸血雜志， 2014(12)： 1309-1312.

[4] 孫國棟，等. 獻(xiàn)血者血小板1-16抗原基因遺傳多態(tài)性分析及已知HPA型供者數(shù)據(jù)庫的建立[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志， 2005(05)： 889-895.

[5] 尤建國， 李玉峰，汪承亞.血小板輸注無效及干預(yù)措施的研究進(jìn)展[J]. 國際輸血及血液學(xué)雜志， 2006(06)： 499-502.

[6] 馬金平，楊和軍.血小板輸注無效的病因和對(duì)策[J]. 中國輸血雜志， 2012(09)： 906-911.

[7] Kerkhoffs JL,Eikenboom JC,van de Watering LM,et al.Theclinical impact of platelet refractoriness：correlation with bleeding and survival[J].Transfusion,2008(48):1959-1965.

[8] 夏文杰，葉欣.血小板HPA基因庫的建立和初步應(yīng)用[J].中華血液學(xué)雜志：2009，3(1)：54-55.

[9] 陳曉軍，等. 血小板抗體檢測(cè)及交叉配型在血小板輸注無效患者中的應(yīng)用[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2013(01)： 143-144.

[10] 高艷，等. 血小板輸注無效患者的血小板抗體篩查與配合性輸注[J]. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2010，9(8)： 584-585.

[11] 夏世勤，王洪波，張慧，等.兩種抗血小板抗體檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用比較[J]。貴州醫(yī)藥，2013，37(5)：439-441.

[12] 伍偉健，盧瑾. 同種免疫性抗體致血小板輸注無效輸血策略的國內(nèi)外研究進(jìn)展[J]. 中國免疫學(xué)雜志， 2014(03)： 426-429，433.

[13] 馬光麗，等. 血液病患者血小板輸注臨床療效及相關(guān)因素分析[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)， 2014(10)： 1540-1542，1574.

[14] 苗菁，曾小菁.急性白血病患者HPA-1～6、15基因多態(tài)性與血小板輸注療效的相關(guān)性研究[J].海南醫(yī)學(xué)，2014，25(3)：313-316.

[15] 劉丙現(xiàn)，等. 血小板抗原基因分型與配型在血小板輸注中的應(yīng)用[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志， 2014(01)： 199-203.

[16] 馮治偉，等. 46名血小板輸注無效患者HPA基因分型及多態(tài)性研究[J]. 中國輸血雜志， 2014(02)： 179-181.

(編校：譚玲)

Research on the clinical value between gene polymorphism of HPA 1-6,9,15 and platelet transfusion refractoriness

LI Yuan， ZENG Hui， WU Hai-bin， ZHAO Xiao-yan， YAN Min-chao， GUO Xiao-junΔ

(Department of Hematology, The First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314001, China)

ObjectiveTo research the clinical value between gene polymorphism of human platelet alloantigens (HPA) 1-6, 9, 15 and platelet transfusion refractoriness (PTR). MethodsTotally 40 patients with platelet transfusion refractoriness(PTR) were randomly selected, and patients and donors’ peripheral blood specimens were collected and tested these samples with platelet GP specific antibodies, and judged the results of platelet transfusion, and with the help of the combination of PCR and direct sequencing for classification of HPA 1-6,9,15 antigens and observe the percent platelet recovery(PPR) after the same type of platelet transfusion, and explore the relationship between HPA gene polymorphism and PTR. ResultsThere was no HPA-b gene was found neither on patients and donors’ HPA 1,4,9, showed the distribution of aa homozygous form; HPA 5,6 were mainly aa homozygous form, little bb homozygous form was discorvered. And HPA 2,3,15 were distributed of polymorphism, the frequency of HPA 2,3,5,6,15 were found with polymorphism. ConclusionFor these patients who were happened with PRT many times, in addition to taking HLA into account, HPA gene polymorphism are also need to be considered. Most people only need to test patients and donors’ HPA2,3,15 gene to decrease the occurrence of PTR significantly when making HPA matching.

human platelet allogntigens; gene polymorphism; platelet transfusion refractoriness; percent platelet recorvery

浙江省嘉興市科技計(jì)劃(2013AY21042-8)

李園，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：血小板抗體與輸血，E-mail：anne_263@sina.com；郭曉珺，通信作者，女，本科，主任醫(yī)師，研究方向：血小板抗體與輸血，E-mail：jxzzxgxj@163.com。

R475.11

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.55