甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元興奮性的影響及作用機(jī)制

馬海濤，白云飛，劉麗娜，王迪Δ，徐志卿Δ

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元興奮性的影響及作用機(jī)制

馬海濤1，白云飛2，劉麗娜2，王迪1Δ，徐志卿2Δ

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

目的 探討甘丙肽(galanin，GAL)對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元興奮性的影響，研究甘丙肽與其受體(GalR)和鉀離子通道的作用機(jī)制。方法 制備幼年大鼠腦片，采用全細(xì)胞記錄法記錄灌流給予甘丙肽后，藍(lán)斑神經(jīng)元靜息膜電位水平和自發(fā)動(dòng)作電位的發(fā)放頻率；灌流給予不同濃度甘丙肽2型受體(GalR2)激動(dòng)劑AR-M1896和不同類型鉀離子通道阻斷劑后，研究甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元興奮性的影響。結(jié)果 甘丙肽能夠誘導(dǎo)藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位發(fā)生超級(jí)化并抑制其動(dòng)作電位的發(fā)放，但GalR2激動(dòng)劑AR-M1896只有在高濃度(1 μM)時(shí)才能夠誘導(dǎo)藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位發(fā)生輕微的超級(jí)化并減少動(dòng)作電位的發(fā)放；電壓依賴性鉀通道阻斷劑四乙胺(Tetraethylammonium，TEA)能夠部分阻斷甘丙肽的抑制作用，內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑BaCl2能夠顯著阻斷甘丙肽的抑制作用，而其他鉀通道阻斷劑，如ATP敏感性鉀通道阻斷劑格列本脲(Glybenclamide)、大電導(dǎo)鈣依賴的鉀通道(BK通道)阻斷劑北非蝎毒素(Charybdotoxin)、小電導(dǎo)鈣依賴的鉀通道(SK通道)阻斷劑蜂毒明肽(Apamin)均未能阻斷甘丙肽的抑制作用。結(jié)論 甘丙肽能夠抑制幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的興奮性，其抑制作用可能主要是通過(guò)甘丙肽1型受體(GalR1)產(chǎn)生的，并且這種抑制作用可能與TEA敏感的鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道相關(guān)，而ATP敏感的鉀通道和鈣依賴的鉀通道不參與其中。

藍(lán)斑；神經(jīng)元；甘丙肽；甘丙肽受體；鉀通道；阻斷劑

位于腦干的藍(lán)斑，主要由去甲腎上腺素能神經(jīng)元組成。由于藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元有廣泛的上行纖維投射到皮層和海馬，因此藍(lán)斑參與喚醒和警戒、學(xué)習(xí)和記憶等重要生理功能，而藍(lán)斑的功能異常與抑郁癥和焦慮等密切相關(guān)。已有研究表明，80%的藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元同時(shí)表達(dá)甘丙肽[1]，一個(gè)含有29個(gè)氨基酸殘基的多肽。甘丙肽最早是由Mutt和Tatemoto[2]于1983年從豬小腸中提取，目前已經(jīng)克隆了3種甘丙肽受體，分別是甘丙肽1型受體(GalR1)、甘丙肽2型受體(GalR2)和甘丙肽3型受體(GalR3)，它們都屬于G蛋白偶聯(lián)受體[3]。以往的電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘丙肽對(duì)成年大鼠藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元有直接的抑制作用，而且是通過(guò)GalR1介導(dǎo)的[4]。盡管原位雜交工作發(fā)現(xiàn)GalR1和GalR2在藍(lán)斑神經(jīng)元中均有表達(dá)[5]。已有研究報(bào)道藍(lán)斑神經(jīng)元對(duì)去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)的反應(yīng)具有年齡依賴性，即幼年鼠藍(lán)斑神經(jīng)元局部給予NA后能夠觀察到超級(jí)化-去極化雙相反應(yīng)，而成年鼠的藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)t只能夠觀察到單相的超級(jí)化反應(yīng)[6-7]。成年大鼠對(duì)NA的單相反應(yīng)主要是成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元α1受體表達(dá)丟失，僅通過(guò)α2受體介導(dǎo)引起的；而α1受體和α2受體共同存在可能是幼年大鼠雙相反應(yīng)的主要原因[8-9]。由于藍(lán)斑神經(jīng)元中GalR1和GalR2均有表達(dá)[10]，且一般來(lái)說(shuō)，GalR1介導(dǎo)的是抑制作用而GalR2多介導(dǎo)興奮作用[11]。因此本研究旨在探討甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元興奮性的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不限，P8～16，購(gòu)自北京維通利華有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-001。

1.1.2 試劑：甘丙肽(Galanin)、AR-M1896購(gòu)自英國(guó)Tocris公司；四乙胺(Tetraethylammonium，TEA)、氯化鋇(BaCl2)、格列本脲(Glybenclamide)、北非蝎毒素(Charybdotoxin)、蜂毒明肽(Apamin)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 儀器：振動(dòng)切片機(jī)(Leica VT1000s，德國(guó))；EPC-10膜片鉗放大器(HEKA，德國(guó))；正置顯微鏡(NIKON FN-S2N，日本)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制：人工腦脊液(mM)：125 NaCl，25 NaHCO3，2.5 KCl，1.3 MgCl2，1.25 NaH2PO4，2.5 CaCl2和10 glucose，pH 7.4。電極內(nèi)液(mM)：143 KCl，8 NaCl，1 MgCl2，10 HEPES，0.4 Na2GTP，2 Na2ATP。

1.2.2 腦片制備：取SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不限，P8～16(首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，快速斷頭，置于預(yù)先充好45 min二元?dú)?95%O2+5%CO2)的0 ℃冰凍人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中，分離出大腦，進(jìn)行修塊，隨后在振動(dòng)切片機(jī)上進(jìn)行切片，厚度為300 μm。將含有藍(lán)斑的腦片移至34.5 ℃浴槽中孵育，45 min后移至室溫，孵育30 min后將腦片移至記錄浴槽進(jìn)行全細(xì)胞記錄，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程始終通二元?dú)狻?/p>

1.2.3 電生理記錄：采用膜片鉗全細(xì)胞記錄法，記錄細(xì)胞的膜電位水平和動(dòng)作電位的發(fā)放頻率。記錄信號(hào)經(jīng)EPC-10膜片鉗放大器及PatchMaster(HEKA，德國(guó))采集、儲(chǔ)存。將腦片置于正置顯微鏡工作平臺(tái)上的灌流池(容積為2.0 mL)中，固定腦片，用ACSF灌流，流速為2 mL/min。記錄電極(武漢微探科學(xué)儀器有限公司)經(jīng)垂直微電極拉制儀PC-10(Narishige，日本)兩步拉制而成，灌注電極內(nèi)液后，電極阻抗為3～5 MΩ。選用輪廓清晰膜飽滿表面光滑的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成吉?dú)W封接后，進(jìn)行電極電容補(bǔ)償。負(fù)壓或高電壓脈沖破膜，進(jìn)行膜電容、串聯(lián)電阻及漏電流補(bǔ)償，平衡5 min待電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液交換充分，膜電位和放電頻率穩(wěn)定后，向灌流池中灌流試劑，記錄給藥后的膜電位和動(dòng)作電位。數(shù)據(jù)分析時(shí)采用的細(xì)胞滿足靜息膜電位<-50 mV，動(dòng)作電位超射>5 mV，膜輸入電阻>70 MΩ。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)：采用電流鉗模式，記成年和幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電特性。灌注不同濃度甘丙肽(10、100、250、500、1000 nM)，膜片鉗檢測(cè)其對(duì)成年和幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元電興奮性的影響。灌流給予不同濃度GalR2受體的選擇性激動(dòng)劑AR-M1896(100 nM，1 μM；2 min)，檢測(cè)GalR2受體是否參與甘丙肽對(duì)藍(lán)斑神經(jīng)元的作用。在固定甘丙肽濃度(500 nM)情況下，灌流給予不同類型鉀離子通道阻斷劑，如TEA(10 mM，10 min)，內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑BaCl2(1 mM，10 min)，ATP敏感鉀通道阻斷劑Glybenclamide(100 μM，5 min)、大電導(dǎo)鈣依賴的鉀通道(BK通道)阻斷劑Charybdotoxin(500 nM，5 min)、小電導(dǎo)鈣依賴的鉀通道(SK通道)阻斷劑Apamin(200 nM，5 min)，觀察這些阻斷劑對(duì)甘丙肽抑制幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放和誘導(dǎo)膜電位超極化作用的影響。

2 結(jié)果

2.1 幼年與成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的電生理特性比較 與成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元相比，幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的膜特性與其在很多方面都基本類似，2者最顯著的差別在于：幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元能夠記錄到一種緩慢的有節(jié)律的3～15 mV的去極化電位(見(jiàn)圖1B)，而這種去極化電位在成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)t很少出現(xiàn)(見(jiàn)圖1A)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分的幼年藍(lán)斑神經(jīng)元都出現(xiàn)自發(fā)的簇狀放電(見(jiàn)圖1C)，而成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)t幾乎不存在這種自發(fā)的放電模式(見(jiàn)圖1A)。

圖1 幼年與成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元電生理特性比較A：典型的成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電特性；B：幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的放電特性，箭頭表示3～15 mV的去極化電位；C：幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的簇狀放電Fig.1 Comparison of electrophysiology properties of LC neurons between adult and neonatal ratA: Presentive firing properties of LC neurons from adult rat;B:Presentive firing properties of LC neurons from neonatal rat(arrow shows 3～15 mV depolarization potential);C:Burst firing of LC neurons from neonatal rat

2.2 甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元電興奮性的影響 對(duì)藍(lán)斑神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞記錄時(shí)，鉗制電壓維持在-60 mV，待膜電位水平和動(dòng)作電位發(fā)放頻率穩(wěn)定后，灌流給予500 nM的甘丙肽2 min，可以看到所有藍(lán)斑神經(jīng)元的膜電位發(fā)生超極化，動(dòng)作電位發(fā)放完全被抑制，灌流給予ACSF沖洗5～10 min后膜電位水平和動(dòng)作電位發(fā)放頻率逐漸恢復(fù)到給藥前水平(見(jiàn)圖2A和2C)。與甘丙肽灌流前膜電位的水平相比，甘丙肽灌流后膜電位水平明顯降低(見(jiàn)圖2B)。當(dāng)給予不同濃度甘丙肽(10～1000 nM)時(shí)，隨著甘丙肽濃度的增加膜電位發(fā)生超極化的程度也不斷增加，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性(見(jiàn)圖2D)。

圖2 甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元興奮性的影響A：甘丙肽抑制幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放并誘導(dǎo)膜電位產(chǎn)生超極化；B：灌流給予甘丙肽前后藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位水平變化；C：灌流給予甘丙肽后藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率隨時(shí)程變化；D：甘丙肽誘導(dǎo)藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位產(chǎn)生超極化的濃度依賴曲線(EC50=173 nM，Hill系數(shù)=0.89)Fig.2 GAL affects the excitability of LC neurons from neonatal ratA:GAL inhibits the firing frequency and hyperpolarizes the membrane potential of LC neurons from neonatal rat;B:The comparison of membrane potential of LC neurons before(control) and after(GAL 500 nM) bath application of GAL;C:Time course of firing frequency of LC neurons after bath application of GAL;D:Dose-curve after bath application of different concentration of GAL(EC50=173 nM, Hill coefficient=0.89)

2.3 甘丙肽抑制藍(lán)斑神經(jīng)元電興奮性的機(jī)制 為證實(shí)GalR2受體是否參與甘丙肽對(duì)藍(lán)斑神經(jīng)元電興奮性的影響，給予GalR2受體的選擇性激動(dòng)劑AR-M1896灌流2 min。結(jié)果表明：低濃度(100 nM)的AR-M1896幾乎對(duì)藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放和膜電位超極化無(wú)影響，只有高濃度(1 μM)的AR-M1896才能減少藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放和誘導(dǎo)藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位發(fā)生輕微的超極化(見(jiàn)圖3,n=7)。說(shuō)明甘丙肽對(duì)藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢缓湍る娢坏挠绊懣赡苤饕峭ㄟ^(guò)GalR1受體介導(dǎo)。

圖3 GalR2受體激動(dòng)劑AR-M1896對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率的影響A，B：低濃度AR-M1896(100 nM)對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率的影響；C，D：高濃度AR-M1896(1 μM)對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率的影響Fig.3 Effect of AR-M1896(an angonist of GalR2) on the firing frequency of LC neurons in neonatal ratA,B:low concentration of AR-M1896(100 nM) fails to reduce the fring frequency of LC neurons;C,D:high concentration of AR-M1896(1 μM) reduces the firing frequency of LC neurons

2.4 TEA對(duì)甘丙肽誘導(dǎo)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位超極化的影響 當(dāng)預(yù)先灌流給予鉀離子通道阻斷劑TEA(10 mM，10 min)后，發(fā)現(xiàn)TEA能夠增加幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆燃把娱L(zhǎng)動(dòng)作電位的復(fù)極化時(shí)程(見(jiàn)圖4B)，降低動(dòng)作電位的發(fā)放頻率，但并不會(huì)顯著改變藍(lán)斑神經(jīng)元的靜息電位水平。再給予甘丙肽2 min后，發(fā)現(xiàn)甘丙肽能夠完全抑制藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放，但是膜電位的超極化程度顯著降低[GAL：(8.9638±3.682)mV；GAL+TEA：(4.8281±1.8842)mV，P<0.01，見(jiàn)圖4C]。說(shuō)明鉀離子通道可能參與了甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的抑制作用。

圖4 TEA對(duì)甘丙肽誘導(dǎo)的幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位超級(jí)化的影響A：TEA減少甘丙肽誘導(dǎo)的膜電位超級(jí)化程度；B：TEA延長(zhǎng)了藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粡?fù)極化時(shí)程(a’、b’、c’分別對(duì)應(yīng)圖A中a、b、c)；C：正常ACSF和給予阻斷劑TEA后甘丙肽誘導(dǎo)的膜電位超極化程度**P<0.01Fig.4 GAL induced hyperpolarization can be partially blocked by TEAA:GAL induced weaker hyperpolarization in the presence of TEA;B:TEA broaden the time course of repolarization(a’,b’,c’ represent a,b,c in figure A, respectively);C:GAL induced hyperpolarization level in the presence of normal ACSF**P<0.01

2.5 BaCl2對(duì)甘丙肽抑制幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元作用的影響 當(dāng)灌流給予一種廣譜的內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑BaCl21 mM后，藍(lán)斑神經(jīng)元的放電頻率顯著增加，而靜息膜電位水平并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(見(jiàn)圖5A)。灌流給予BaCl210 min后，再給予500 nM甘丙肽2 min，甘丙肽的抑制作用幾乎被完全阻斷[GAL：(8.9638±3.682)mV；GAL+BaCl2：(0.951±0.6227)mV，P<0.001，見(jiàn)圖5B]。說(shuō)明甘丙肽的抑制作用很可能與內(nèi)向整流鉀通道密切相關(guān)。

圖5 BaCl2對(duì)甘丙肽抑制藍(lán)斑神經(jīng)元作用的影響A： BaCl2能夠顯著阻斷甘丙肽的抑制作用；B：正常ACSF和給予阻斷劑BaCl2后甘丙肽GAL誘導(dǎo)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元超極化程度比較***P<0.001Fig.5 Effect of BaCl2 on GAL induced hyperpolarizationA:GAL induced hyperpolarization can be blocked significantly by BaCl2;B:GAL induced hyperpolarization level in the presence of normal ACSF***P<0.001

2.6 ATP-敏感 K+/BK/SK通道阻斷劑對(duì)甘丙肽誘導(dǎo)的超極化作用的影響 分別選用ATP敏感鉀通道、大電導(dǎo)鈣依賴的鉀通道(BK通道)、小電導(dǎo)鈣依賴的鉀通道(SK通道)的阻斷劑Glybenclamide (100 μM)、Charybdotoxin(500 nM)、Apamin(200 nM)，預(yù)先灌流給予3種通道的阻斷劑5 min后，500 nM甘丙肽的抑制作用與給藥前相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[GAL：(8.9638±3.682)mV，GAL+Glybenclamide：(9.0684±4.3313)mV，GAL+Charybdotoxin：(9.3008±3.3969)mV，GAL+Apamin：(9.2730±5.4779)mV，P>0.05，見(jiàn)圖6)。說(shuō)明ATP-敏感K+/BK/SK通道可能并未參與甘丙肽誘導(dǎo)的超極化作用。

圖6 3種阻斷劑對(duì)甘丙肽誘導(dǎo)的幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元膜電位超極化的影響A：灌流給予Glybenclamide(100 μM)；B：灌流給予Charybdotoxin(500 nM)；C：灌流給予Apamin(200 nM)；D：正常腦脊液和分別給予Glybenclamide(100 μM)、Charybdotoxin(500 nM)和Apamin(200 nM)后甘丙肽誘導(dǎo)的膜電位超極化程度的變化Fig.6 Effect of three antagonist on GAL induced hyperpolarizationA:in the presence of Glybenclamide(100 μM);B:in the presence of Charybdotoxin(500 nM);C:in the presence of Apamin(200 nM);D:GAL induced hyperpolarization level in the presence of normal ACS

3 討論

本研究首次對(duì)甘丙肽在幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元上的作用進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)甘丙肽能夠抑制幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率和誘導(dǎo)其膜電位產(chǎn)生超極化，當(dāng)給予選擇性GalR2激動(dòng)劑AR-M1896后，藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率并沒(méi)有顯著減少，即使給予高濃度的AR-M1896也沒(méi)有發(fā)生明顯的超極化，表明甘丙肽的抑制作用很可能是通過(guò)GalR1介導(dǎo)的。這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室既往在成年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的觀察結(jié)果一致[4]。因此，藍(lán)斑神經(jīng)元對(duì)甘丙肽的反應(yīng)可能沒(méi)有年齡依賴性，即藍(lán)斑神經(jīng)元上同時(shí)存在GalR1和GalR2，無(wú)論是成年還是幼年大鼠甘丙肽的作用主要是通過(guò)GalR1介導(dǎo)。

在成年大鼠，甘丙肽抑制藍(lán)斑神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放并誘導(dǎo)其膜電位產(chǎn)生超級(jí)化主要是通過(guò)激活鉀通道增加鉀電導(dǎo)產(chǎn)生。TEA是一種電壓依賴性鉀通道的阻斷劑，在成年大鼠， TEA能夠顯著或完全阻斷甘丙肽在藍(lán)斑神經(jīng)誘導(dǎo)的超極化作用[12]，而在幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元，甘丙肽誘導(dǎo)的超級(jí)化作用只能被TEA部分阻斷。內(nèi)向整流鉀通道阻斷劑BaCl2能夠明顯阻斷甘丙肽的抑制作用，說(shuō)明在鉀離子通道機(jī)制上成年和幼年大鼠存在差異。此外，無(wú)論在成年或幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元，ATP敏感通道阻斷劑Glybenclamide都不能顯著影響藍(lán)斑神經(jīng)元的靜息膜電位，也未能阻斷甘丙肽誘導(dǎo)的超級(jí)化作用。Charybdotoxin是一種BK通道阻斷劑，本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)表明：激活GalR2能夠激活BK通道，增加鉀電流[13]，本實(shí)驗(yàn)中Charybdotoxin也未能阻斷甘丙肽的抑制作用，這也間接表明甘丙肽誘導(dǎo)的超級(jí)化作用很可能主要是通過(guò)激活GalR1產(chǎn)生的；SK通道阻斷劑Apamin既不能顯著影響藍(lán)斑神經(jīng)元的靜息膜電位，也不能顯著阻斷甘丙肽誘導(dǎo)的超級(jí)化作用，說(shuō)明與成年大鼠相同，SK通道可能沒(méi)有參與甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的作用。綜上所述，甘丙肽對(duì)幼年大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的抑制作用很可能是通過(guò)激活GalR1進(jìn)而增加內(nèi)向整流鉀通道電導(dǎo)產(chǎn)生的。

[1] Melander T, Hokfelt T, Rokaeus A,et al.Coexistence of galanin-like immunoreactivity with catecholamines,5-hydroxytryptamine,GABA and neuropeptides in the rat CNS[J].J Neurosci,1986,6(12):3640-3654.

[2] Tatemoto K,Rokaeus A,Jornvall H,et al.Galanin—a novel biologically active peptide from porcine intestine[J].FEBS Lett,1983,164(1):124-128.

[3] Branchek TA,Smith KE,Gerald C,et al.Galanin receptor subtypes[J].Trends Pharmacol Sci,2000,21(3):109-117.

[4] Ma X,Tong YG,Schmidt R,et al.Effects of galanin receptor agonists on locus coeruleus neurons[J].Brain Res,2001,919(1):169-174.

[5] O’donnell D,Ahmad S,Wahlestedt C,et al.Expression of the novel galanin receptor subtype GALR2 in the adult rat CNS:distinct distribution from GALR1[J].J Comp Neurol,1999,409(3):469-481.

[6] Finlayson PG,Marshall KC.Locus coeruleus neurons in culture have a developmentally transient alpha 1 adrenergic response[J].Brain Res,1986,390(2):292-295.

[7] Finlayson PG,Marshall KC.Hyperpolarizing and age-dependent depolarizing responses of cultured locus coeruleus neurons to noradrenaline[J].Brain Res,1984,317(2):167-175.

[8] Williams JT,Marshall KC.Membrane properties and adrenergic responses in locus coeruleus neurons of young rats[J].J Neurosci,1987,7(11):3687-3694.

[9] Williams JT,North RA,Shefner SA,et al.Membrane properties of rat locus coeruleus neurones[J].Neuroscience,1984,13(1):137-156.

[10] Wang S,Hashemi T,Fried S,et al.Differential intracellular signaling of the GalR1 and GalR2 galanin receptor subtypes[J].Biochemistry,1998,37(19):6711-6717.

[11] Lang R,Gundlach AL,Holmes FE,et al.Physiology,signaling,and pharmacology of galanin peptides and receptors:three decades of emerging diversity[J].Pharmacol Rev,2015,67(1):118-175.

[12] Pieribone VA,Xu ZQ,Zhang X,et al.Galanin induces a hyperpolarization of norepinephrine-containing locus coeruleus neurons in the brainstem slice[J].Neuroscience,1995,64(4):861-874.

[13] Pan NC,Bai YF,Yang Y,et al.Activation of galanin receptor 2 stimulates large conductance Ca(2+)-dependent K(+) (BK) channels through the IP3 pathway in human embryonic kidney (HEK293) cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,446(4):316-321.

(編校：吳茜)

Effect and function mechanism of Galanin on neonatal rat locus coeruleus neurons

MA Hai-tao1, BAI Yun-fei2, LIU Li-na2, WANG Di1Δ, XU Zhi-qing2Δ

(1.School of Basic Medical Sciences, Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000, China;2.School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo explore the effect of galanin (GAL) on locus coeruleus (LC) neurons from neonatal rat and mechanism with its receptor GalR and potassium channel. MethodsBrain slices from neonatal rats were prepared and the resting membrane potential and spontaneous action potential of LC neurons were recorded with whole cell patch-clamp configuration. GAL, AR-M1896 and potassium channel blockers were bath applied with different concentration. ResultsBath application GAL induced hyperpolarization and inhibited firing rate of LC neurons. However, AR-M1896 (a selective GalR2 agonist) did not induce significant effect on LC neurons, only at very high concentration(1 μM) it induced slight hyperpolarization and reduced firing rate. The inhibitory effect of GAL was partially blocked by TEA (an antagonist of voltage-dependent potassium channel) and significantly blocked by BaCl2(an antagonist of inward-rectifying potassium channels), while other potassium channels blockers such as Glybenclamide(ATP-sensitive potassium channel blocker),Charybdotoxin(large-conductance Ca2+-activated K+channels blocker),Apamin(small-conductance Ca2+-activated K+channels blocker)failed to block it. ConclusionGAL inhibits LC neurons from neonatal rats, mainly through GalR1. TEA-sensitive potassium channels and inward-rectifying potassium channels, but not ATP-sensitive potassium channel and calcium-activated potassium channel, are involved in this inhibition.

Locus coeruleus; neurons; galanin; galanin receptors; potassium channels; antagonist

留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金

馬海濤，男，碩士在讀，E-mail：mahaitao1988@126.com；王迪，通信作者，女，博士，教授，研究方向：運(yùn)動(dòng)行為的神經(jīng)細(xì)胞分子機(jī)制及神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)；腦卒中基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究，E-mail：tulip_wang@yahoo.com；徐志卿，共同通信作者，男，博士，教授，研究方向：腦重大疾病(抑郁癥、癲癇等)中神經(jīng)肽及受體的作用及其分子機(jī)制研究，E-mail：zhiqingxu@ccmu.edu.cn。

R338.8

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.10