核酸適體的篩選及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

靳貴曉，李娟，楊黃浩

(1.福建工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院，福建福州350118; 2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，食品安全分析與檢測教育部重點實驗室，福建福州350116)

核酸適體的篩選及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

靳貴曉1，李娟2，楊黃浩2

(1.福建工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院，福建福州350118; 2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，食品安全分析與檢測教育部重點實驗室，福建福州350116)

核酸適體是由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選獲得的能夠與靶標(biāo)物質(zhì)特異性、高親和力結(jié)合

的單鏈DNA或RNA.能夠被核酸適體識別的靶標(biāo)物質(zhì)包括各種小分子物質(zhì)、大分子蛋白質(zhì)、細(xì)胞等，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究各領(lǐng)域.為此，對核酸適體的篩選制備技術(shù)、對生物醫(yī)學(xué)靶標(biāo)物質(zhì)的檢測方法以及在疾病的靶向診斷和治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行了展望.

核酸適體;指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);傳感檢測;靶向診斷;治療

0 引言

1990年，美國研究者Tuerk和Gold［1］通過體外篩選并結(jié)合PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)，從RNA隨機(jī)文庫中首次獲得了能夠與噬菌體DNA聚合酶特異性結(jié)合的RNA序列，并將該篩選方法命名為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(system evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX).隨后，Ellington和Szoatak［2］兩位研究人員又利用SELEX技術(shù)篩選得到了能夠特異識別結(jié)合染料小分子的RNA寡核苷酸序列，并將其命名為“Aptamer”核酸適體，從此核酸適體受到研究者的廣泛關(guān)注.核酸適體可以分為兩種類型:DNA核酸適體和RNA核酸適體，長度通常為25～60個核苷酸.核酸適體能夠識別、結(jié)合的靶標(biāo)物質(zhì)范圍非常廣泛，包括酶、生長因子、基因調(diào)節(jié)蛋白、植物凝集素、細(xì)胞粘附分子，甚至是完整的細(xì)胞、病毒等［3］.經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，核酸適體可以折疊成一定的三維空間立體結(jié)構(gòu)，比如:假結(jié)(pseudoknot)、發(fā)卡(hairpin)、G－四鏈體(G－quadruplex)、鼓包(bulge)等，核酸適體的這些特殊位點能夠與靶標(biāo)物質(zhì)通過靜電作用、氫鍵作用、堆積作用、疏水作用和形狀匹配等多種相互作用力形成嵌合或包被的高親和力復(fù)合物，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)物質(zhì)的特異性識別結(jié)合［4］.部分RNA核酸適體與靶標(biāo)物結(jié)合后的Kd值甚至可以達(dá)到pmol·L－1級別［5］，表明部分核酸適體與靶標(biāo)物質(zhì)的親和力要優(yōu)于抗體與抗原的結(jié)合［6］.并且能夠嚴(yán)格區(qū)分只有一個基團(tuán)差別的靶標(biāo)分子與其他非靶標(biāo)分子［7］或旋光性不同的氨基酸［8］，具有良好的特異性.此外，核酸適體還具有無免疫源性、合成簡便、穩(wěn)定性好、易修飾等優(yōu)點［9］，因此，自發(fā)現(xiàn)以來便受到研究者的極大關(guān)注，已在生物傳感檢測［10］、成像診斷［11］、疾病的靶向治療［12］等諸多領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展.本文對核酸適體的篩選方法及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述.

1 核酸適體的篩選方法

1.1 常規(guī)SELEX篩選技術(shù)

常規(guī)SELEX篩選技術(shù)由Tuerk［1］、Ellington［2］等研究者于1990年共同創(chuàng)建.該方法以隨機(jī)寡核苷酸文庫作為篩選的基礎(chǔ)，從大量隨機(jī)序列中經(jīng)過反復(fù)篩選和富集，獲得一條或多條與靶標(biāo)物質(zhì)具有較強(qiáng)親和力的寡核苷酸序列.研究證明，作為篩選基礎(chǔ)的隨機(jī)寡核苷酸庫的設(shè)計與核酸適體的篩選結(jié)果密切相關(guān)［13］.隨機(jī)文庫分為單鏈DNA(ssDNA)庫和單鏈RNA庫，二者具有共同的特點:庫中隨機(jī)核苷酸鏈的長度通常為25～60個堿基，鏈兩端均設(shè)計有固定的PCR引物結(jié)合序列，鏈中間部分為隨機(jī)序列，不同的隨機(jī)序列折疊成不同的空間構(gòu)象，這決定了寡核苷酸庫的容量及多樣性.若隨機(jī)序列有n個堿基，則庫容量為4n.庫容量越大，篩選到優(yōu)質(zhì)核酸適體的機(jī)率越大，以達(dá)到不同靶標(biāo)核酸適體的篩選需求.研究表明，寡核苷酸庫的庫容量達(dá)到1013～1015即可滿足篩選需求［14］.根據(jù)實際篩選過程的不同，可以對庫中的隨機(jī)寡核苷酸序列的骨架或核酸配基通過有機(jī)小分子［15］、熒光染料［16］或放射性核素［17］等進(jìn)行修飾以滿足后期不同的需求.文庫SELEX篩選過程主要包括以下三個步驟(見圖1):(1)首先將靶標(biāo)與寡核苷酸庫混合孵育一定時間，當(dāng)單鏈寡核苷酸遇到靶標(biāo)時會發(fā)生適應(yīng)性變化，形成特殊的空間三維立體結(jié)構(gòu)，然后通過多種非共價作用與靶標(biāo)緊密結(jié)合形成靶標(biāo)－核酸復(fù)合物; (2)通過磁性分離［18］、膜過濾分離［19］、毛細(xì)管電泳［20］等多種分離方法將與靶標(biāo)結(jié)合的單鏈寡核苷酸分離，獲得初級的核酸適體;(3)再以分離獲得的單鏈寡核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用磁性分離［18］、酶切法［21］等獲得PCR產(chǎn)物中的一條有意義鏈作為次級文庫，用于下一輪篩選.以此方法重復(fù)篩選約9～16輪即可得到針對靶標(biāo)的核酸適體，對最后一輪篩選獲得的單鏈寡核苷酸進(jìn)行測序和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，以評估其與靶標(biāo)結(jié)合的親和力和特異性.

1.2 改進(jìn)型SELEX篩選技術(shù)

使用常規(guī)SELEX技術(shù)篩選核酸適體通常需要反復(fù)篩選9～16輪，篩選過程費時費力，并且對于各種各樣不同的靶標(biāo)物質(zhì)，常規(guī)SELEX篩選方法有其自身的局限性.為了簡化篩選過程、提高篩選的效率及自動化程度，國內(nèi)外研究者在常規(guī)SELEX方法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了多種改進(jìn)型SELEX篩選技術(shù)，如消減SELEX、加尾SELEX、細(xì)胞－SELEX、結(jié)合定量PCR的SELEX技術(shù)、結(jié)合流式細(xì)胞的SELEX技術(shù)、毛細(xì)管電泳SELEX等.

1.2.1 消減SELEX(subtractive－SELEX)技術(shù)

在核酸適體篩選的過程中，有些非特異性寡核苷酸能夠與已知或未知的共有靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致干擾.這種情況下通常使用tRNA或親和基質(zhì)作為篩選的非特異性作用對象進(jìn)行反篩，將這些非特異性寡核苷酸從隨機(jī)庫中除去作為次級文庫，再從中進(jìn)行核酸適體的篩選，該方法稱為消減SELEX(subtractive－SEL-EX)技術(shù).利用該方法能夠減少靶標(biāo)物質(zhì)類似物的干擾，從而能以高度相似的靶分子篩選到具有較強(qiáng)特異性的核酸適體，所以消減SELEX技術(shù)在臨床診斷和疾病的個性化治療方面具有優(yōu)勢.陳樺等［23］以小鼠IgG亞型作為靶標(biāo)，采用靶標(biāo)替換方法進(jìn)行消減SELEX篩選，通過16輪篩選，獲得了與小鼠IgG不同亞型的相同部位Fc片段特異性結(jié)合的核酸適體.2013年，Wang等［24］利用消減SELEX技術(shù)經(jīng)過9輪篩選得到并鑒定了6條ssDNA核酸適體，它們能夠與臨床高致齲性變形鏈球菌特異性識別結(jié)合.

1.2.2 加尾SELEX(tailored－SELEX)技術(shù)

隨機(jī)寡核苷酸庫中的序列設(shè)計通常包括兩端的固定區(qū)和中間的隨機(jī)區(qū)，固定區(qū)作為引物結(jié)合位點引發(fā)了PCR擴(kuò)增，但同時也會影響隨機(jī)序列的退火效果，或參與到核酸適體與靶標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合中，對后續(xù)活性序列的截短造成影響.2003年，Vater等研究者［25］在寡核苷酸庫的序列隨機(jī)區(qū)兩端設(shè)計了長度較短的固定序列，并引入接頭序列與固定序列形成搭橋，PCR反應(yīng)過程中引物與模板序列通過搭橋連接，與其他方法不同的是隨后產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中的引物序列要被裂解，所以使得進(jìn)入下一輪循環(huán)的寡核苷酸兩端仍保持較短的固定序列.并且最終篩選獲得的核酸適體只包含隨機(jī)區(qū)序列，由于兩端不含引物結(jié)合序列而無需進(jìn)行常規(guī)的序列截短，避免了常規(guī)SELEX篩選方法帶來的序列后續(xù)處理問題.Vater等［25］通過該技術(shù)成功篩選出了與降鈣素基因相關(guān)多肽1(Ca－CGRP1)特異性結(jié)合的核酸適體.

1.2.3 結(jié)合定量PCR的SELEX技術(shù)

將常規(guī)SELEX篩選方法與定量PCR(qPCR)核酸擴(kuò)增方法結(jié)合，利用定量PCR對每輪篩選的核酸擴(kuò)增過程進(jìn)行實時監(jiān)測，避免過度擴(kuò)增帶來的浪費，保證了在較少的重復(fù)篩選次數(shù)的基礎(chǔ)上能夠獲得高親和力的核酸適體，提高了篩選的效率.Savory等［26］利用定量PCR技術(shù)對致腎盂腎炎大腸埃希菌的核酸適體SELEX篩選過程進(jìn)行跟蹤，經(jīng)過5輪便成功篩選得到能夠高親和性結(jié)合靶標(biāo)細(xì)菌的核酸適體，極大地簡化了篩選過程.Yang等［27］將定量PCR與新型的單珠SELEX篩選方法結(jié)合，綜合后的新方法最大的優(yōu)點是對靶標(biāo)物質(zhì)需求量極少，全程只需要45 ng即可完成篩選，經(jīng)過5輪便成功篩選到α甲酰輔酶a消旋酶的核酸適體.由于定量PCR技術(shù)靈敏度高，所以為了保證結(jié)果的特異性，需要嚴(yán)格控制PCR的各項條件.并且該方法對實驗設(shè)備也有一定的要求.

1.2.4 混合SELEX(blended－SELEX)技術(shù)

為了減少非特異性寡核苷酸吸附帶來的干擾，1995年，Drew等［28］在篩選所用的隨機(jī)寡核苷酸庫中加入小分子物質(zhì)二苯膦酸酯衍生物，它能夠促使?jié)撛诘暮怂徇m體與靶標(biāo)物質(zhì)人中性白細(xì)胞彈性蛋白酶(hNE)結(jié)合.利用該方法能夠更高效地篩選出靶標(biāo)物質(zhì)的核酸適體，被稱為混合SELEX(blended－SELEX)技術(shù).在該方法的基礎(chǔ)上，研究者又衍生出表達(dá)盒SELEX(expression cassette－SELEX)技術(shù).該方法的主要內(nèi)容是將核酸適體序列與基因表達(dá)框設(shè)計在一起，令獲得的核酸適體在體內(nèi)能夠通過表達(dá)框?qū)崿F(xiàn)上調(diào)表達(dá).Martell等［29］將E2F蛋白的核酸適體序列設(shè)計到基因表達(dá)框內(nèi)，所獲得的新核酸適體具有結(jié)合E2F蛋白的能力，同時又可以在體內(nèi)進(jìn)行高水平表達(dá).為該核酸適體的基因水平治療提供了新途徑.

1.2.5 復(fù)合靶分子SELEX(complex targets－SELEX)技術(shù)

核酸適體篩選技術(shù)出現(xiàn)的早期，靶標(biāo)物質(zhì)往往需要預(yù)先純化，而實際篩選時很多靶標(biāo)物質(zhì)不易獲得，甚至靶標(biāo)物質(zhì)本身比較復(fù)雜或還未研究透徹(如整個細(xì)胞).在這種情況下就需要一種針對復(fù)合靶標(biāo)物質(zhì)的篩選方法.1998年，Morris等［30］首次以人紅細(xì)胞總蛋白混合物作為靶標(biāo)物質(zhì)，通過復(fù)合靶分子SELEX技術(shù)在同一個庫中成功篩選到針對混合物中不同靶標(biāo)的核酸適體，篩選結(jié)果顯示，此方法能夠做到不同核酸適體間互不干擾，極大地擴(kuò)展了SELEX技術(shù)的應(yīng)用范圍.其中，最為成功的是對腫瘤細(xì)胞核酸適體的篩選［31－32］.由于腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用該技術(shù)則無需對其表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行透徹研究便可將整個腫瘤細(xì)胞作為靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行核酸適體的篩選，由此衍生而來的篩選方法被稱為細(xì)胞SELEX(cell－SELEX).采用細(xì)胞SELEX技術(shù)已經(jīng)篩選獲得了一批針對腫瘤細(xì)胞的核酸適體［33－34］，在臨床疾病的診斷治療研究中起到重要的作用.Wu等［35］利用細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選獲得針對胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的核酸適體XQ－2d，以其作為信號探針通過熒光成像檢測等方法對胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床樣本檢出率達(dá)到82.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他核酸適體對該種疾病的檢出率.前列腺癌的發(fā)病率逐年上升并引起人們的重視.Wang等研究者［36］以前列腺癌細(xì)胞作為靶標(biāo)(見圖2)，篩選得到核酸適體Wy－5a，該核酸適體與前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3能夠高親和力、特異性地結(jié)合，而對其他類型前列腺癌細(xì)胞不具親和力.這為激素不敏感型前列腺癌的早期診斷和治療提供了重要途徑，同時也有助于不同類型前列腺癌細(xì)胞的差別研究.然而由于細(xì)胞膜上靶分子數(shù)目過多，使得其中的低豐度靶分子不易獲得其特異性的適體.Ohuchi［37］利用基因工程在哺乳動物細(xì)胞表面過渡表達(dá)重組蛋白作為靶標(biāo)進(jìn)行核酸適體篩選，成功獲得Kd值低至nmol·L－1的核酸適體.

1.2.6FACS－SELEX技術(shù)

SELEX篩選過程中最關(guān)鍵的問題是如何將能夠與靶標(biāo)物質(zhì)特異結(jié)合的核酸序列從庫中有效分離出來.在細(xì)胞SELEX篩選過程中，通常采用離心的方法進(jìn)行分離，但離心會破壞細(xì)胞，并且無法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞.基于以上考慮，2008年Mayer等［38］改進(jìn)了細(xì)胞SELEX技術(shù)，將活細(xì)胞和死細(xì)胞的混合液與寡核苷酸庫進(jìn)行孵育，再用流式細(xì)胞儀對孵育后的細(xì)胞進(jìn)行分選，將分離后的核酸序列經(jīng)PCR擴(kuò)增形成次級寡核苷酸庫，經(jīng)過10輪篩選獲得了針對活細(xì)胞的核酸適體.研究者將這種與流式細(xì)胞儀結(jié)合的熒光分析篩選方法稱為FACS(fluorescence－activated cell sorting)SELEX技術(shù).該方法為復(fù)雜樣本中靶標(biāo)細(xì)胞亞群核酸適體的快速篩選提供了可能的途徑.

1.2.7 基因組SELEX(genomic－SELEX)技術(shù)

核酸適體的篩選是以靶標(biāo)物質(zhì)與核酸序列的相互作用為基礎(chǔ)的.Britta等研究者［39］構(gòu)建了大腸桿菌的基因組序列庫，并以這種天然基因庫作為核酸適體篩選的基礎(chǔ)，從中簡單、快速地篩選得到代謝調(diào)節(jié)酶的特異性核酸適體，被稱為基因組SELEX.該方法的最大特點是以生物活性分子作為靶標(biāo)物質(zhì)，從某種生物基因庫中識別出與之相互作用的序列.這對研究生物活性分子與自身基因的互作提供了一種新方法，尤其是為蛋白質(zhì)等調(diào)控元件參與基因調(diào)控的原理研究提供了新穎有效的手段.為了保證篩選結(jié)果的可靠性，該方法對所建立的起始文庫提出了較高的質(zhì)量要求，構(gòu)建的初始基因組文庫必須包括全部基因的序列和全部內(nèi)含子序列.2014年，Wu等研究者［40］在糖多孢菌基因組庫中通過基因組SELEX技術(shù)篩選得到針對調(diào)節(jié)因子BldD的7條天然基因序列，并通過電泳分析、定量PCR分析等闡明了調(diào)節(jié)因子BldD在紅霉素的生產(chǎn)及細(xì)菌形態(tài)學(xué)分化方面的積極作用，該方法為生物體內(nèi)基因調(diào)控的研究提供了新途徑.

1.2.8 毛細(xì)管電泳SELEX(CE－SELEX)技術(shù)

常規(guī)SELEX技術(shù)通常利用醋酸纖維素膜過濾或聚丙烯酰氨凝膠電泳等方法將結(jié)合了靶標(biāo)物質(zhì)的寡核苷酸與游離寡核苷酸進(jìn)行分離，這些方法都存在分離介質(zhì)對靶標(biāo)物質(zhì)或其復(fù)合物的非特異性吸附、操作過程繁瑣、分離效果不理想等缺陷.而將毛細(xì)管電泳應(yīng)用到SELEX篩選中恰好能夠克服以上分離方法的缺點，被稱為毛細(xì)管電泳SELEX.分離的原理是根據(jù)靶標(biāo)物質(zhì)及其復(fù)合物或游離寡核苷酸序列在毛細(xì)管電泳的高壓電場中具有不同的荷質(zhì)比，令各組分的電泳遷移率不同而實現(xiàn)分離.該方法不引入分離介質(zhì)，具有極高的分離效率，分離快速，所需樣品量很少，成本低.通常經(jīng)過2～4輪即可篩選到高親和力的核酸適體.Eaton等［41］利用毛細(xì)管電泳SELEX篩選得到針對卵巢癌標(biāo)志物HE4的核酸適體，區(qū)別于常規(guī)SELEX篩選方法的PCR擴(kuò)增及測序環(huán)節(jié)，進(jìn)一步利用高通量的測序方法對核酸適體進(jìn)行測序，并通過生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫對核酸適體進(jìn)行對比分析，為核酸適體的快速、大量篩選提供了新思路.Brito等［42］通過毛細(xì)管電泳SELEX篩選獲得了微囊藻毒素的核酸適體，篩選周期短，所需靶標(biāo)物質(zhì)微囊藻毒素的量少，這為水樣微囊藻毒素檢測傳感器的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ).但毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)也存在一定的缺陷，主要表現(xiàn)為進(jìn)樣體積小(nL級)，導(dǎo)致文庫中DNA分子的數(shù)量通常少于1013個［43］.

1.2.9 熒光磁珠SELEX(FluMag－SELEX)技術(shù)

2005年，Stoltenburg等研究者［44］將磁珠和熒光素聯(lián)用，以篩選鏈霉親和素的核酸適體，由此建立了熒光磁珠SELEX技術(shù).該方法的特點是以磁珠作為固定相固定靶標(biāo)物質(zhì)，與寡核苷酸庫孵育后利用磁場對磁珠的吸附將游離寡核苷酸和復(fù)合物快速分離，分離過程操作簡便.對洗脫的特異性吸附序列通過PCR擴(kuò)增庫再投入下一輪篩選.Kumar等［45］研究者將小分子物質(zhì)尿素作為靶標(biāo)通過縮合反應(yīng)連接到磁珠表面，以熒光磁珠SELEX方法從ssDNA庫中通過8輪篩選獲得了尿素的高親和性核酸適體U38.并以U38修飾金納米粒子(AuNPs)制備出無需信號標(biāo)記的尿素檢測傳感體系.Huang等［46］以熒光磁珠SELEX方法經(jīng)過12輪篩選獲得了金黃色葡萄球菌毒素A的核酸適體A15，該核酸適體與靶標(biāo)毒素的解離常數(shù)達(dá)到48 nmol·L－1，以其制備的熒光傳感檢測體系對金黃色葡萄球菌毒素A的檢測限達(dá)到8.7 ng·mL－1.然而，最初的熒光磁珠SELEX篩選過程大部分需要人工操作，在自動化方面有待提高.

1.2.10 自動化SELEX(automated－SELEX)技術(shù)

常規(guī)SELEX篩選過程往往需要人工操作9～16個循環(huán)，費時費力，效率低.Cox等［47］在Beckmann－CoulterBiomek 2000 Pipetting系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過整合和改進(jìn)，于1998年成功研制了第一個自動化SELEX篩選工作站，主要機(jī)理是將靶標(biāo)物質(zhì)通過鏈霉親和素－生物素作用固定到磁珠表面，利用類似于熒光磁珠SELEX的方法結(jié)合已設(shè)定的RT－PCR程序進(jìn)行自動篩選.經(jīng)過12輪篩選首次得到溶菌酶的核酸適體.隨后，Eulberg等［48］和Hybarger等［49］又對該平臺進(jìn)行完善，實現(xiàn)了自動篩選過程的實時在線監(jiān)控.2009年，Lou等研究者［50］又將微流控芯片整合到自動化SELEX篩選平臺(見圖3)，在微流通道中植入磁性裝置，實現(xiàn)磁性微球的自動化精準(zhǔn)控制.該方法被稱為微流控制SELEX(microfluidic－SELEX)技術(shù)，通過一輪篩選便獲得了特異性核酸適體.自動化SELEX極大地提高了篩選速度，降低了篩選成本，克服了人為操作導(dǎo)致的不利因素，實現(xiàn)了對核酸適體的高通量篩選，所以是未來的發(fā)展趨勢.

2 核酸適體在生物醫(yī)學(xué)檢測中的應(yīng)用研究

2.1 核酸適體對小分子物質(zhì)的檢測

生命有機(jī)體的生理代謝活動與各種小分子物質(zhì)密切相關(guān)，比如各種金屬離子、三磷酸腺苷(ATP)等.因此對小分子物質(zhì)進(jìn)行檢測并分析是生物醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容.研究者利用小分子靶標(biāo)物質(zhì)的核酸適體作為識別元件構(gòu)建熒光傳感、電化學(xué)傳感等檢測體系實現(xiàn)了對生物醫(yī)學(xué)小分子物質(zhì)的快速、靈敏檢測.

Disar等［51］以As(Ⅲ)離子的核酸適體修飾銀納米粒子形成Apt－SNPs復(fù)合物(見圖4(a))，當(dāng)出現(xiàn)As(Ⅲ)離子時，它能夠引起Apt－SNPs復(fù)合物的聚集，從而導(dǎo)致銀納米粒子在403 nm處的光吸收顯著減弱，該比色傳感檢測體系對As(Ⅲ)離子檢測限達(dá)到6 μg·L－1，具有很高的靈敏度和特異性.Guo等［52］將黃連素的核酸適體序列與G－四鏈體序列巧妙地設(shè)計在一起(見圖4(b))，當(dāng)K+存在于體系中時，它能夠與黃連素－核酸適體復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)黃連素的熒光強(qiáng)度，利用這種方法構(gòu)建了一種簡單的免標(biāo)記熒光增強(qiáng)型核酸適體傳感體系，對K+的檢測限達(dá)到31 nmol·L－1，并具有較寬的線性檢測范圍(0～1 600 μmol·L－1).除了體外樣品中金屬離子的檢測，對于活細(xì)胞內(nèi)離子含量的檢測也是研究活細(xì)胞生理活動的重要內(nèi)容和難點所在，這對檢測方法提出了很高的要求.Yang等［53］發(fā)展了一種活細(xì)胞內(nèi)K+的可視化檢測方法(見圖4(c)).他們將K+的核酸適體(G－四鏈體)通過與互補序列(cDNA)結(jié)合，修飾到金納米粒子(AuNPs)表面.當(dāng)K+存在時，核酸適體與K+結(jié)合從而脫離金納米粒子表面，并且在K+的作用下核酸適體構(gòu)象發(fā)生變化，其兩端的熒光基團(tuán)靠近，引發(fā)了強(qiáng)烈的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，從而出現(xiàn)明顯的熒光增強(qiáng).細(xì)胞成像實驗表明該比率型熒光傳感檢測體系可用于活細(xì)胞內(nèi)K+的檢測.除了金屬離子之外，Li等［54］以微囊藻毒素核酸適體修飾于AuNPs表面，微囊藻毒素能夠與核酸適體結(jié)合從而脫離AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs發(fā)生聚集，等離子體共振吸收峰發(fā)生藍(lán)移，從而實現(xiàn)對微囊藻毒素的快速檢測，檢測限達(dá)到0.37 nmol·L－1.Eissa等［55］通過SELEX技術(shù)首次篩選出來雙鞭甲藻毒素的高親和力核酸適體(Kd=42 nmol·L－1)，并以其構(gòu)建了一種基于競爭性結(jié)合的電化學(xué)生物傳感器以檢測雙鞭甲藻毒素，為該毒素的快速檢測提供了有效的方法.

為了實現(xiàn)對痕量物質(zhì)的超靈敏檢測，研究者又采取了多種信號放大的方法用于傳感器的構(gòu)建，常用的有酶切循環(huán)放大技術(shù)、寡核苷酸鏈置換技術(shù)、序列擴(kuò)增等.Zhu等［56］發(fā)展了一種酶切循環(huán)放大體系，原理是利用核酸適體和兩條DNA輔助鏈構(gòu)建聚丙烯酰胺水凝膠，同時將金－鉑納米粒子(Au@PtNPs)包裹在其中，當(dāng)遇到目標(biāo)物質(zhì)時，核酸適體與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致水凝膠中Au@PtNPs釋放出來，并催化H2O2產(chǎn)生O2，通過O2推動芯片通道中紅墨水的移動距離對靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測.Au@PtNPs催化反應(yīng)具有循環(huán)放大效應(yīng)，利用該體系實現(xiàn)了對可卡因的快速、定量檢測，檢測限為60 pmol·L－1，為新型即時檢測設(shè)備的研發(fā)奠定了基礎(chǔ).

本實驗室Liu等［57］通過偶聯(lián)程序化的毛細(xì)管核酸適體傳感器，CdS納米粒子標(biāo)記的DNA信號序列對作為信號放大機(jī)制，設(shè)計了一種能夠超靈敏檢測ATP的電化學(xué)傳感平臺(見圖5).該系統(tǒng)由流動進(jìn)樣器、毛細(xì)管孵育系統(tǒng)和國產(chǎn)的電化學(xué)池構(gòu)成.ATP核酸適體將捕獲探針和信號探針相連接，當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)ATP出現(xiàn)時，核酸適體與ATP識別結(jié)合，從而將信號探針釋放出來，利用溶出伏安法監(jiān)測電流的變化，從而實現(xiàn)了對小分子物質(zhì)ATP的檢測.以CdS納米粒子標(biāo)記的雙鏈DNA作為放大技術(shù)比傳統(tǒng)的信號放大方法更靈敏，檢測限低至3 pmol·L－1，且改進(jìn)后的該檢測系統(tǒng)有望實現(xiàn)分析的全自動化.

2.2 核酸適體對大分子物質(zhì)的檢測

生命活動離不開各種各樣的蛋白質(zhì)酶類、生長輔助因子等大分子物質(zhì)，其中某些大分子物質(zhì)比如腫瘤標(biāo)志物，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后監(jiān)測密切相關(guān)，所以開展大分子物質(zhì)的檢測對于研究生命代謝活動及疾病的發(fā)展進(jìn)程具有重要意義.

目前，已查明的腫瘤標(biāo)志物大約有上百種，研究者通過SELEX技術(shù)已經(jīng)有針對性地篩選出部分腫瘤標(biāo)志物的核酸適體［58］，并以核酸適體為識別元件構(gòu)建了一系列腫瘤標(biāo)志物檢測傳感體系［59］.這對于腫瘤的早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療及預(yù)后效果評估都具有重要的意義和參考價值.Ma等［60］將上皮腫瘤標(biāo)記粘蛋白1(MUC1)核酸適體固定于金電極表面，在核酸適體末端連接電化學(xué)信號標(biāo)記，MUC1與核酸適體特異性結(jié)合后會引發(fā)電信號的顯著變化，對MUC1的檢測限為50 nmol·L－1，與傳統(tǒng)的商品化ELISA檢測試劑盒相比，該方法具有更高的靈敏度，為MUC1的臨床檢測提供了新方法.與常規(guī)的電化學(xué)或熒光檢測方法不同，Zheng等［61］以磁控濺射技術(shù)組裝了一種新型的基于ZnO的薄膜腔聲波諧振器作為生物傳感器檢測MUC1.鏈霉親和素在薄膜表面自組裝，生物素標(biāo)記的MUC1核酸適體通過Au－S鍵連接到AuNPs表面作為靶標(biāo)捕捉元件，體系中存在靶標(biāo)物質(zhì)MUC1時，核酸適體空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而暴露出生物素，AuNPs便可以通過生物素－鏈霉親和素的相互作用連接到薄膜表面，引發(fā)了薄膜腔聲波諧振器的共振頻移，頻移與MUC1濃度呈特定關(guān)系.生物素－鏈霉親和素結(jié)合體系的加入令該傳感器具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點.

隨著納米材料的不斷發(fā)展，研究者又利用納米材料之間的特殊互作效應(yīng)構(gòu)建傳感體系檢測腫瘤標(biāo)志物，實現(xiàn)了免標(biāo)記的信號放大過程.Wu等［62］利用前列腺特異性抗原(PSA)核酸適體及其互補序列將CdSe@ZnS量子點(QD)連接到金納米棒(AuNR)周圍形成類似衛(wèi)星的結(jié)構(gòu)(見圖6(a))，QD熒光被AuNR淬滅.當(dāng)體系中存在靶標(biāo)物質(zhì)PSA時，它能夠與互補序列競爭結(jié)合核酸適體，從而導(dǎo)致QD脫離AuNR，上清液中600 nm波長處QD的熒光顯著增強(qiáng).對PSA的檢測限達(dá)到0.029 amol·L－1.并利用該體系實現(xiàn)了血清樣品中PSA的超靈敏檢測，在更換核酸適體后又可以對其他靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測，具有廣泛的通用性.癌胚抗原(CEA)作為腫瘤標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌和宮頸癌等臨床診斷.Pan等［63］發(fā)展了一種基于核酸適體的新型電泳微芯片分析技術(shù)，用于血清樣品中CEA的檢測(見圖6(b)).他們以磁珠(MBs)作為固定載體，CEA核酸適體及其互補序列被修飾于MBs表面，靶標(biāo)物質(zhì)與核酸適體的結(jié)合導(dǎo)致游離互補序列的出現(xiàn)，該互補序列與熒光染料FAM標(biāo)記的輔助DNA序列再次結(jié)合，并引發(fā)核酸內(nèi)切酶對輔助DNA序列的切割.酶切反應(yīng)釋放出來的游離互補序列又可以引發(fā)下一輪酶切反應(yīng)，導(dǎo)致持續(xù)釋放出大量的FAM標(biāo)記的DNA片段.通過電泳微芯片可以將FAM標(biāo)記的DNA片段分離出來并進(jìn)行熒光檢測.該體系對血清CEA的檢測限為68pg·mL－1，且具有良好的線性檢測范圍，是一種快速檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，并有望進(jìn)入臨床應(yīng)用.

核酸適體由SELEX過程篩選而來，所以針對同一靶標(biāo)的核酸適體往往不止一條，選擇其中兩條與靶標(biāo)結(jié)合力強(qiáng)的核酸適體可以構(gòu)建針對靶標(biāo)物質(zhì)的“三明治”夾心結(jié)構(gòu)檢測體系.Zhu等［64］利用磁性微球的磁力優(yōu)勢，選擇血小板衍生生長因子PDGF－BB核酸適體中結(jié)合力較強(qiáng)的兩條分別修飾到磁性微球表面形成夾心結(jié)構(gòu)(見圖7(a))，以磁力將“三明治”夾心結(jié)構(gòu)固定于電極表面，第二條結(jié)合于靶標(biāo)物質(zhì)的核酸適體帶有電致化學(xué)發(fā)光(ECL)信號探針，以此方法實現(xiàn)了對靶標(biāo)物質(zhì)的超靈敏檢測.該方法極大地簡化了實驗過程，對PDGF－BB的檢測限低至0.08 fmol·L－1.

實現(xiàn)痕量物質(zhì)的超靈敏檢測一直是重要的研究方向.Wang等［65］報道了一種新型的ECL傳感器檢測凝血酶(見圖7(b))，其原理是將CdS量子點修飾到玻碳電極表面作為ECL信號物質(zhì)，其上再連接核酸適體和AuNPs，發(fā)現(xiàn)檢測過程中AuNPs發(fā)生表面等離子體共振(SPR)，并同CdS之間發(fā)生能量傳遞，導(dǎo)致ECL信號大幅度增強(qiáng).當(dāng)核酸適體與待檢測的凝血酶結(jié)合后，AuNPs脫離電極表面，致使ECL信號減弱.與傳統(tǒng)的酶切循環(huán)信號放大方法不同，該傳感器雖然屬于信號減弱型，但是靈敏度極高，與之前的檢測方法相比，使凝血酶的檢測限降低兩個數(shù)量級，達(dá)到26 amol·L－1.

Zhao等［66］利用具有表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)性質(zhì)的材料pNTP包裹到Au－SiO2核殼材料的中空層形成復(fù)合體(Au－pNTP－SiO2)(見圖7(c))，在Au最外層修飾溶菌酶核酸適體，它能夠與指紋中廣泛存在的溶菌酶結(jié)合，通過SERS成像技術(shù)對指紋進(jìn)行可視化成像.該方法保證了pNTP不受外界環(huán)境的影響，提高了SERS成像的穩(wěn)定性，全程無需前處理或后處理，對各種指紋均有良好的成像效果.

將檢測過程自動化、微型化是分析化學(xué)研究的重要目標(biāo)，也是增強(qiáng)檢測方法穩(wěn)定性和實用性的關(guān)鍵環(huán)節(jié).Wang等［67］利用單個流感病毒的通用型核酸適體和金納米粒子結(jié)合，在不同條件下可以對不同亞型的流感病毒加以區(qū)分并檢測出來.而整個過程通過一個微流控芯片即可自動完成.該微型檢測系統(tǒng)在核酸適體的臨床即時檢測方面有望發(fā)揮更大作用.

2.3 核酸適體對腫瘤細(xì)胞的檢測

以完整的腫瘤細(xì)胞作為靶標(biāo)，通過cell－SELEX技術(shù)篩選出針對不同種類腫瘤細(xì)胞的核酸適體，比如T細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤、肝癌［68］等，進(jìn)一步以腫瘤標(biāo)志物核酸適體作為識別元件構(gòu)建了大量的靶細(xì)胞檢測傳感體系，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定量檢測，成為腫瘤診斷的重要輔助方法.Cai等［69］制備了一種新型的信號放大型電化學(xué)核酸適體傳感器檢測乳腺癌細(xì)胞(見圖8(a)).首先，乳腺癌細(xì)胞核酸適體與互補序列連接到磁性微球表面，當(dāng)存在靶標(biāo)細(xì)胞時，核酸適體與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合然后釋放出游離的互補序列，同時該序列具有脫氧核酶(DNAzyme)的催化功能，在Mg2+協(xié)助下發(fā)揮酶催化作用將電極表面預(yù)連接的核酸序列循環(huán)切割，產(chǎn)生大量的短鏈核酸，導(dǎo)致電化學(xué)信號極大降低，對乳腺癌細(xì)胞的檢測限為47 cells/mL.該方法與傳統(tǒng)的細(xì)胞檢測方法相比較具有諸多優(yōu)點，比如傳感體系制備及操作過程簡單、成本經(jīng)濟(jì)低廉、無需其它信號標(biāo)記等.Chen等［70］還報道了一種“非典型”核酸適體夾心ECL傳感器.他們以植物凝集素修飾的金納米粒子代替夾心結(jié)構(gòu)中的第二條核酸適體，同時引入堿性磷酸酶催化機(jī)制，使得該傳感器對腫瘤細(xì)胞的檢測限低至38 cells/mL，并且實現(xiàn)了復(fù)雜樣品中腫瘤細(xì)胞的超靈敏檢測.

Chandra Ray課題組［71］基于納米材料“金爆米花”具有很強(qiáng)的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)作用，構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞的檢測體系(見圖8(b))，利用表面增強(qiáng)拉曼散射檢測方法對前列腺癌細(xì)胞實現(xiàn)了超靈敏檢測，檢測限低至50 cells/mL.并且“金爆米花”在激光的照射下可以進(jìn)一步用于腫瘤的光熱治療，并對治療過程動態(tài)進(jìn)行原位監(jiān)控.為腫瘤可控治療方法的發(fā)展提供了思路.

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)對于腫瘤的臨床診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后都具有重要的意義，由于CTCs在循環(huán)系統(tǒng)中的含量少，并且實際檢測樣本成分復(fù)雜，所以開展對循環(huán)系統(tǒng)中CTCs的檢測存在很大困難.Zamay等［72］首次以手術(shù)切除的肺癌組織中分離而來的腫瘤細(xì)胞作為靶標(biāo)，通過cell－SELEX技術(shù)原位篩選得到特異的核酸適體.然后以熒光染料標(biāo)記的核酸適體檢測到了血液樣品中的靶標(biāo)肺癌細(xì)胞，該檢測方法的敏感度達(dá)到86%，特異性達(dá)到76%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于以單一抗體檢測CTCs的傳統(tǒng)方法.后期還可以大量合成該核酸適體用于腫瘤后續(xù)治療，為腫瘤診療方案的個性化定制提供了一種行之有效的方法.

3 核酸適體在疾病靶向診療中的應(yīng)用研究

3.1 靶向診斷中的應(yīng)用研究

傳統(tǒng)的疾病診斷以生化指標(biāo)檢測、影像學(xué)、組織切片觀察等方法為主，然而對于腫瘤等某些疾病的診斷，由于技術(shù)原因使得傳統(tǒng)診斷方法存在一定的局限性，比如靈敏度不高、空間分辨率低、檢查過程增加患者痛苦等.此時，靶向診斷技術(shù)的優(yōu)勢便凸顯出來.鑒于核酸適體具有靶標(biāo)多樣化，較高的親和力和特異性，良好的生物相容性及穩(wěn)定等優(yōu)點，與傳統(tǒng)診斷方法相比較，在多種疾病的靶向診斷中具有極大的優(yōu)勢.

某些納米材料，比如金屬納米粒子等，由于具有熒光效應(yīng)、超順磁性等特殊性質(zhì)，研究者將核酸適體通過π－π堆積作用、共價鍵等方式連接到納米材料表面，賦予了該納米材料靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，將其注射至動物體內(nèi)，在核酸適體的靶向介導(dǎo)作用下實現(xiàn)了對活體腫瘤的熒光成像［73］及磁共振成像(MRI)［74－75］診斷，或進(jìn)一步與放射性核素聯(lián)合用于正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像(CT)［76］.

作為一種重要的非侵入性成像方式，熒光成像以其良好的靈敏度和特異性受到研究者的廣泛關(guān)注.Chen等［77］突破以往的染料選擇慣例，以近紅外熒光染料MPA標(biāo)記MUC1的核酸適體，構(gòu)建了兩種信號探針APT－MPA和APT－PEG－MPA，并分別在體外活細(xì)胞、活體腫瘤組織及不同MUC1表達(dá)量的活體腫瘤模型中分別考察信號探針對目標(biāo)腫瘤的靶向性.結(jié)果表明，由于所選擇的近紅外熒光染料MAP具有更強(qiáng)的組織穿透力，所以成像效果好.并且核酸適體對熒光染料進(jìn)入腫瘤細(xì)胞具有明顯的介導(dǎo)作用，所以腫瘤細(xì)胞攝入速度更快，是一種非常有應(yīng)用潛力的靶向熒光成像探針.

熒光成像存在易受到樣本自身組織干擾這一局限性，而MRI卻能夠克服這一缺點，成為目前臨床疾病診斷的重要手段之一.但當(dāng)前常用的磁共振造影劑的靈敏度相對較低，限制了MRI方法的廣泛使用.最近Li等［78］將常用的兩種造影劑Fe3O4和PEG－Gd2O3通過含有二硫鍵的胱氨酸連接(見圖9(a))，最外層以核仁蛋白特異核酸適體AS1411進(jìn)行修飾，可靶向腫瘤細(xì)胞.腫瘤細(xì)胞內(nèi)部過量表達(dá)的谷胱甘肽(GSH)能夠?qū)⒍蜴I切斷，從而改變Fe3O4和PEG－Gd2O3之間的距離，由此產(chǎn)生T1和T2信號的變化，據(jù)此對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行MRI成像.該靶向腫瘤細(xì)胞的激活型復(fù)合磁共振造影劑大大地提高了成像的靈敏度和特異性，為新型造影劑的設(shè)計提供了思路.

除此以外，PET/CT也是一種重要的的成像診斷方法，Kang等［79］將熒光染料、磁共振造影劑和放射性核素組裝到SiO2納米顆粒中(見圖9(b))，以MUC－1核酸適體修飾表層，構(gòu)建了一種能夠靶向腫瘤組織并進(jìn)行熒光成像、磁共振成像和PET成像的多模式成像劑，并且彌補了單一成像方法存在的缺點，對大多數(shù)類型的腫瘤均有效，具有一定的通用性.

3.2 靶向治療中的應(yīng)用研究

針對腫瘤等疾病治療的藥物存在藥物利用率低、代謝速度快、副作用大、療效差等缺點，而靶向給藥技術(shù)可以針對病灶實現(xiàn)定點給藥，從根本上減小副作用、提高療效，是疾病治療方式的重要發(fā)展方向.

核酸適體可以將基因調(diào)控過程中的參與分子作為靶標(biāo)，并與之特異性結(jié)合，從而對基因表達(dá)的過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到疾病治療的目的.所以核酸適體本身可以作為疾病的基因治療藥物.在腫瘤靶向基因治療方面，核酸適體的調(diào)節(jié)作用可以歸納為四點:(1)抑制與腫瘤細(xì)胞粘附入侵相關(guān)分子的基因表達(dá);(2)增強(qiáng)腫瘤免疫系統(tǒng);(3)通過抑制激酶、磷酸酶等酶類的轉(zhuǎn)錄阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路［80－81］;(4)與腫瘤發(fā)展過程中的相關(guān)蛋白識別結(jié)合阻止其功能的發(fā)揮［82］.Wan等［83］將人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞與表皮生長因子受體(EGFR)的核酸適體孵育，發(fā)現(xiàn)核酸適體與EGFR的結(jié)合能夠阻止并抑制表皮生長因子(EGF)對受體的磷酸化，從而阻斷了與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的部分信號通路，并能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，展現(xiàn)出良好的腫瘤抑制能力.該實驗完全在一個仿生微芯片中進(jìn)行，通過對微芯片中腫瘤細(xì)胞的觀察和定量分析可以直觀地判斷療效.Famulok等［84］發(fā)現(xiàn)特異性的核酸適體與β－連環(huán)蛋白能夠結(jié)合并抑制其在結(jié)腸癌中的多重功能，有望在腫瘤的基因治療中發(fā)揮作用.目前，國外已有核酸適體被批準(zhǔn)應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，另有多個核酸適體正處于臨床試驗階段［85－87］.在現(xiàn)有核酸適體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，研究者又進(jìn)一步對其修飾改造，以期構(gòu)建功能性更好的核酸適體藥物［88－89］，具有廣闊的發(fā)展空間.

核酸適體除了自身可以作為基因治療的藥物以外，還可以與其他載體相結(jié)合，作為藥物靶向運送的介導(dǎo)物質(zhì)，在疾病的靶向治療中起到關(guān)鍵的作用.將常見的核酸適體修飾的藥物載體歸納后如圖10所示［90］.許多腫瘤化療藥物，比如阿霉素［91］、紫杉醇［92］等，以及基因調(diào)節(jié)藥物反義RNA［93］和具有治療功能的蛋白質(zhì)［94］，均可以通過共價連接或非共價連接的方式與核酸適體結(jié)合，用于腫瘤的靶向給藥.

而近年來新興的納米材料比如石墨烯、碳納米管等，具有尺寸小、比表面積大、易吸附單鏈核酸、生物相容性好、易進(jìn)入細(xì)胞等優(yōu)點.研究者以核酸適體作為靶向探針與石墨烯［95］、碳納米管［96］等結(jié)合作為靶向載體，同時把腫瘤治療藥物負(fù)載于其上，將藥物定向輸送進(jìn)腫瘤細(xì)胞，避免了藥物對健康細(xì)胞的毒副作用，提高了藥效.

相比于傳統(tǒng)的化療以及手術(shù)等方法，光熱材料吸收近紅外光轉(zhuǎn)化為熱能，利用局部高溫有效殺死癌細(xì)胞，而對周邊的正常組織副作用很小.這種光熱療法(PTT)正成為當(dāng)今癌癥治療領(lǐng)域的新方向.納米材料比如金納米棒［97］、金－銀合金納米粒子［98］、碳納米管［99］等均具有優(yōu)良的光熱性能，修飾核酸適體后常用于腫瘤靶向熱療的研究中.

在依賴核酸適體作為靶向探針的腫瘤基因治療方面，Tan課題組［100］利用腫瘤細(xì)胞核酸適體和輔助DNA序列，通過自組裝的方式制備了一種尺寸可控并且對刺激響應(yīng)的納米水凝膠，該納米水凝膠具有良好的生物相容性，能夠靶向腫瘤細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)GSH的作用下瓦解釋放出具有基因調(diào)節(jié)功能的反義RNA和脫氧核酶(DNAzyme)，降低MMP－9蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移.

3.3 靶向“診療合一”中的應(yīng)用研究

將疾病診斷和治療分開的傳統(tǒng)模式有其自身的局限性，隨著核酸適體的發(fā)展及新型功能納米材料的不斷涌現(xiàn)，研究者有機(jī)會將疾病的診斷和治療合二為一，同步進(jìn)行，以期達(dá)到提高藥效、改善預(yù)后、減少患者痛苦的目的，開創(chuàng)了靶向“診療合一”的生物醫(yī)學(xué)研究的新模式.常見的具有靶向“診療合一”功能的藥物載體如圖11所示.

為了增強(qiáng)抗腫瘤藥物的親水性和生物兼容性，研究者將某些具有熒光性質(zhì)的腫瘤化療藥物比如阿霉素(DOX)，負(fù)載于核酸適體修飾的石墨烯［102］、碳納米管［103］等載體表面，對腫瘤細(xì)胞實施熒光成像診斷的同時釋放藥物殺滅腫瘤細(xì)胞，實現(xiàn)診療合一.而對于某些具有化療抗藥性的腫瘤細(xì)胞株，為了改善治療效果，研究者又進(jìn)一步引入具有光敏性質(zhì)的藥物或納米材料，比如金納米粒子［104］、二硫化鉬［105］等，利用納米材料的光熱作用抑制腫瘤細(xì)胞的同時釋放DOX實施化療并進(jìn)行熒光成像診斷.這種將光動力療法(PDT)或光熱療法(PTT)與化療結(jié)合的方式極大地提高了單一藥物的作用效果［106］.此外，研究者還將磁共振造影劑、放射性核素和熒光染料等與化療藥物結(jié)合，發(fā)展了MRI成像－化療［107］、CT成像－化療［108］、熒光成像－化療［109］等一系列診療合一的新方法.其中，Yuan等［110］將核酸適體與G－四連體設(shè)計在同一條序列中，并在其中嵌入光敏劑，將核酸序列修飾到具有熒光效應(yīng)的上轉(zhuǎn)換納米材料NaLuF4表面，靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后在激發(fā)光照射下NaLuF4產(chǎn)生發(fā)射光，光敏劑在發(fā)射光的作用下進(jìn)一步產(chǎn)生單線態(tài)氧殺死腫瘤細(xì)胞.該方法能針對特定的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像并殺滅，具有過程可控的巨大優(yōu)勢.

另外一種由兩親分子組裝而成的脂質(zhì)體囊泡或者膠束由于其巨大的應(yīng)用潛力而受到關(guān)注.此類載體最大的優(yōu)勢是結(jié)構(gòu)單元能夠通過自組裝而形成載體結(jié)構(gòu)，過程簡單快速，自組裝的同時可以在結(jié)構(gòu)中心封裝親水性藥物，還可以在雙分子膜層之間封裝疏水性藥物.在具有靶向能力的膠束或囊泡中核酸適體作為結(jié)構(gòu)組成的一部分，同時又是靶向腫瘤細(xì)胞的介導(dǎo)探針［111－112］.脂質(zhì)體囊泡或者膠束能夠高效地運送化療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，提高了藥物利用率，減少了毒副作用.

核酸作為生命體本身所含有的物質(zhì)，具有良好的生物相容性、降解性及可復(fù)制擴(kuò)增的優(yōu)點.近幾年隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究者利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等核酸擴(kuò)增技術(shù)輕松制得一系列DNA聚合體，被稱為“納米火車”、“納米花”等［113－115］，并將核酸適體結(jié)合于序列中，發(fā)展了一類新型的靶向載體，以其包裹化療藥物和熒光染料，應(yīng)用于腫瘤靶向診療一體的研究，避免了使用納米材料可能帶來的毒性.

4 結(jié)語

核酸適體由發(fā)現(xiàn)至今的二十多年中，SELEX篩選技術(shù)經(jīng)過不斷地改進(jìn)和豐富，自動化SELEX篩選系統(tǒng)能夠?qū)⒃痉爆嵑臅r的篩選過程縮短至一周時間，成為核酸適體篩選方法未來的發(fā)展方向.到目前為止，研究者已經(jīng)篩選得到了大量針對各種靶標(biāo)物質(zhì)的核酸適體.各種核酸適體可以作為靶標(biāo)物質(zhì)識別元件，被廣泛應(yīng)用于生物檢測與分析、臨床靶向診斷與治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域.

雖然核酸適體具有諸多優(yōu)點，但是與疾病常規(guī)治療方法相比，仍有不足之處:(1)核酸適體易被降解，在體外的穩(wěn)定性差，在體內(nèi)的半衰期較短，尚未有通用的修飾解決方法;(2)自身透過細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞或靶組織的效率低，往往需要借助載體;(3)大規(guī)模合成核酸適體以及核酸適體的修飾成本較高.這些都局限了核酸適體的實際應(yīng)用及商品化，所以目前絕大多數(shù)的核酸適體的研究仍處于實驗階段.為了安全有效地利用核酸適體，未來有必要進(jìn)一步拓展對核酸適體的研究，生化特性方面包括開展對其結(jié)構(gòu)、折疊方式、靶標(biāo)親和力等的相關(guān)研究;臨床應(yīng)用方面開展包括其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)、藥效、細(xì)胞毒性、全身反應(yīng)及基因調(diào)節(jié)機(jī)理等的研究.經(jīng)過全面、深入的研究后，相信核酸適體一定能夠成為一種便捷高效的工具，在生物醫(yī)學(xué)檢測及診療方面發(fā)揮重要的作用.

致謝:福建工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院碩士研究生王琪，在本文的撰寫過程中幫助查找搜集資料，特此感謝!

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(責(zé)任編輯:洪江星，鄭美鶯)

Research progress of aptamer screening and its application in biomedicine

JIN Guixiao1，LI Juan2，YANG Huanghao2
(1.College of Ecological Environment and Urban Construction，F(xiàn)ujian University of Technology，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350118，China; 2.The Key Lab of Analysis and Detection Technology for Food Safety of the MOE and Fujian Province，College of Chemistry，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350116，China)

Aptamer is a kind of single－stranded DNA or RNA developed by systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)process，which bind to the target with high selectivity and specificity，such as small molecules，proteins，whole cells，etc.The aptamer was widely used in various fields of biomedical research.In this review，the research progress of aptamer screening，detection methods of biomedical target，targeted diagnosis and treatment of disease were reviewed.And，the prospect of application of aptamer in biomedicine was discussed.

aptamer;SELEX;sensing detection;targeteddiagnosis;therapy

O6－1

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0919

1000－2243(2016)06－0919－016

2016－11－24

李娟(1985－)，副教授，主要從事生物分析和生物成像研究，lijuan@fzu.edu.cn楊黃浩(1975－)，教授，主要從事生物傳感及納米生物醫(yī)藥研究，hhyang@fzu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(21475026，U1505221，21505021，21622502，21635002);福建省自然科學(xué)基金資助項目(2015H6011，2016J05035);長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃資助項目(IRT15R11);能源與環(huán)境光催化國家重點實驗室獨立研究資助項目(2014B02)