HPLC法測(cè)定健腎丸中腺苷的含量

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(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院,南京,210002)

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HPLC法測(cè)定健腎丸中腺苷的含量

崔恩忠唐安福貢磊湯淏王曙東

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院,南京,210002)

摘要目的:建立健腎丸中腺苷含量的測(cè)定方法,為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究依據(jù)。方法:采用高效液相色譜法,流動(dòng)相:乙腈-水(6∶94);色譜柱:Agilent TC-C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm,柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。結(jié)果:腺苷在1.25～20.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率為101.04%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.93%。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、可靠、重現(xiàn)性好,可用于健腎丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞健腎丸;腺苷;高效液相色譜法

健腎丸為南京軍區(qū)總醫(yī)院全軍腎臟病研究所研制的中藥復(fù)方制劑,處方由發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、黃芪、防風(fēng)等組成,有補(bǔ)肺益腎,固表止汗之功,用于防治各種慢性腎小球腎炎、腎病綜合征,病程日久至肺衛(wèi)不固、腎氣虧虛易于感冒者。該臨床使用數(shù)十年,有確切療效。目前該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅采用TLC法對(duì)黃芪、防風(fēng)和發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉3味藥進(jìn)行薄層色譜鑒別,無(wú)定量檢測(cè)指標(biāo),無(wú)法全面有效的控制其質(zhì)量[1]。為進(jìn)一步提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本文建立了健腎丸中腺苷HPLC含量測(cè)定方法。

1資料與方法

1.1一般資料高效液相色譜儀Waters 1525,2487紫外檢測(cè)器;FA1104-電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KQ-500DE型超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))。腺苷對(duì)照品(110879-200202)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;處方藥材均購(gòu)自南京醫(yī)藥有限公司;健腎丸為南京總醫(yī)院制劑科生產(chǎn),批號(hào)為140524、140609、140623、140706、140731。甲醇和乙腈:色譜純(美國(guó)默克);水:自制純化水;其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)高效液相色譜儀Waters 1525(雙泵),2487紫外檢測(cè)器;色譜柱:Agilent TC-C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:A∶B=6∶94(A:乙腈,B:水);檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm;柱溫為25 ℃;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2溶液的制備對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備:精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品0.5 mg,置25 mL量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。供試品溶液的制備:取本品粉末約0.1 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL,稱(chēng)定重量,超聲提取0.5 h,冷卻至室溫,再稱(chēng)定重量,用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液。陰性對(duì)照溶液的制備:按處方比例及生產(chǎn)工藝制備缺發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉、黃芪和防風(fēng)的陰性樣品,按“2.1.2項(xiàng)”下方法制備。

1.2.3線性關(guān)系考察分別精密腺苷儲(chǔ)備液0.625，1.25，2.5，5.0，10.0 mL至10 mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程。

1.2.4精密度試驗(yàn)精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的腺苷對(duì)照品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)的樣品,按“2.1.1”項(xiàng)下樣品溶液測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,在常溫下分別于0、1、2、4、8 h進(jìn)樣,記錄腺苷峰面積,以峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)下的樣品5份,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)行測(cè)定,以測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.7加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品1.4 mg,置50 mL容量瓶中,加75%甲醇至刻度,搖勻,即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取已知含量的樣品0.1 g(腺苷含量為1.4 mg/g),共9份,分別置于250 mL錐形瓶中,分別精密加入腺苷對(duì)照品3 mL,5 mL和7 mL,按“2.1.2”項(xiàng)下樣品制備方法即得。精密吸取上述供試液各10 μL注入色譜儀,測(cè)定含量,計(jì)算回收率。

圖1　健腎丸HPLC圖譜

2結(jié)果

2.1方法專(zhuān)屬性試驗(yàn)供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處,有同一色譜峰,而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處則無(wú)峰出現(xiàn),表明其對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2腺苷線性關(guān)系試驗(yàn)按1.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程:Y=30561X+4205,r=0.999 5(n=5)。結(jié)果顯示,腺苷的濃度在1.25～20 μg/mL之間,與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)表1、圖2。

表1　腺苷線性關(guān)系考察結(jié)果

圖2　腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3精密度試驗(yàn)以1.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算腺苷峰面積的RSD為0.31%。結(jié)果顯示該方法的精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)以1.2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算腺苷峰面積的RSD為0.88%。表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)以1.2.6項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果樣品中腺苷含量RSD為2.20%。說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

表2　腺苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6加樣回收率試驗(yàn)以1.2.7項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算平均回收率為101.04%,RSD=1.93%。見(jiàn)表2。

2.7樣品測(cè)定取5批健腎丸(批號(hào)為140524、140609、140623、140706、140731),按1.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定樣品,以外標(biāo)法計(jì)算樣品中腺苷的含量。見(jiàn)表3。

表3　腺苷含量測(cè)定結(jié)果

3討論

3.1最大吸收波長(zhǎng)的選擇參照《中國(guó)藥典》2015版一部百令膠囊中腺苷的含量測(cè)定方法[2],選擇最大吸收波長(zhǎng)為260 nm。

3.2流動(dòng)相的選擇參照《中國(guó)藥典》2015版一部百令膠囊和金水寶膠囊中腺苷的含量測(cè)定方法及其他相關(guān)文獻(xiàn)[2-9],進(jìn)行了選擇試用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相(乙腈-水)比例為6∶94時(shí),腺苷出峰時(shí)間及分離度等條件都較好,故選其為最佳流動(dòng)相。

3.3腺苷提取條件的選擇通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-10],實(shí)驗(yàn)對(duì)腺苷提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min)及溶劑用量(50倍、100倍、150倍)分別進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間在30 min時(shí)腺苷含量最高,提取溶劑用量在100倍和150倍時(shí),腺苷提取率無(wú)明顯差別,但均高于50倍用量,故最終確定腺苷提取條件選擇加入100倍溶劑超聲處理30 min,結(jié)果顯示腺苷提取效果較好。

3.4指標(biāo)成分的選擇冬蟲(chóng)夏草作為傳統(tǒng)名貴中藥,具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、降血壓血脂、平喘祛痰、治療高血糖癥、肝臟疾病及改善腎功能等作用[11-12],由于藥材資源緊張,現(xiàn)大多采用人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草菌絲體,以滿足藥材市場(chǎng)。本實(shí)驗(yàn)研究的健腎丸由發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉、黃芪、防風(fēng)、白術(shù)和甘草共5味中藥組成,處方分析后認(rèn)為發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌粉為方中君藥,其主要含核苷類(lèi)如腺苷等[4-5]成分,可能為補(bǔ)益中藥的共有物質(zhì)基礎(chǔ)[13],現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[11-12]核苷酸及核苷能促進(jìn)腸道的正常發(fā)育、成熟和修復(fù),對(duì)維持機(jī)體正常免疫功能和肝臟正常功能有重要意義。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[14]并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)方中臣藥黃芪和防風(fēng)亦含有腺苷,故增加了健腎丸中總腺苷指標(biāo)成分的含量測(cè)定。其他指標(biāo)成分后期繼續(xù)進(jìn)行考察,以不斷提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定健腎丸中腺苷的含量,所測(cè)結(jié)果重復(fù)性、精密度較好,適用于本品的質(zhì)量控制,同時(shí)進(jìn)一步提高了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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(2015-07-07收稿責(zé)任編輯：王明)

HPLC Determination of Adenosine in Jianshen Pill

Cui Enzhong,Tang Anfu,Gong Lei,Tang Hao,Wang Shudong

(NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,China)

AbstractObjective:To provide scientific proof for promoting quality standard of Jianshen Pill by determining the level of adenosine in it.Methods:HPLC(High Performance Liquid Chromatography) method was used with Agilent TC-C18(2) column ( 250 mm×4.6 mm,5 μm ) and a mobile phase of Acetonitrile-Water (6∶94).Flow rate was 1.0 mL/min,column temperature was 25 ℃.The detection wavelength was 260nm and sample loop volume 10 μl.Results:The calibration curve linear within the range of 1.25～20.00 μg /mL of acetonitrile,and the average recovery was 101.04% (RSD=1.93%).Conclusion:The method is simple,accurate and repeatable,which can be used for the quality control of Jianshen Pill.

Key WordsJianshen Pill; Acetonitrile; HPLC

基金項(xiàng)目:全軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升專(zhuān)項(xiàng)課題重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):13ZJZ13)——“腎病系列非標(biāo)準(zhǔn)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的研究”

作者簡(jiǎn)介:崔恩忠(1981.09—),男,學(xué)士,藥師,研究方向:中藥制劑工藝研究,E-mail:cez_life@163.com 通信作者:湯淏(1980.05—),男,碩士,主管藥師,研究方向:中藥制劑新技術(shù)研究,E-mail:tang_hao0518@sina.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.042