卒中后認(rèn)知障礙小鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制研究

王鑫，孫彩花，徐旸，朱小云，陳霞，施偉，楊敏

?

·專題·

卒中后認(rèn)知障礙小鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制研究

王鑫，孫彩花，徐旸，朱小云，陳霞，施偉，楊敏

［摘要］目的觀察卒中后認(rèn)知障礙小鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)變化。方法選用清潔級(jí)ICR雄性小鼠分為假手術(shù)組（n=60）和卒中后認(rèn)知障礙組（PSCI組，n=60）。采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。水迷宮測試檢測小鼠認(rèn)知功能；分子生物學(xué)等方法檢測小鼠梗死對側(cè)膽堿能神經(jīng)環(huán)路功能和組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)變化情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，PSCI組水迷宮成績下降（t＞29.412，P＜0.05）；中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中，乙酰膽堿（ACh）的含量降低（t＞26.227，P＜0.05），膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（ChAT）mRNA和蛋白的表達(dá)降低（t＞28.593，P＜0.05），乙酰化組蛋白H3（Ac-H3）水平降低（t＞24.126，P＜0.05），磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）和CREB結(jié)合蛋白（CBP）表達(dá)降低（t＞25.634，P＜0.05），ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；较陆担╰＞24.704，P＜0.05）。結(jié)論短暫性MCAO模型可以引起小鼠認(rèn)知功能障礙。PSCI小鼠中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路的膽堿能系統(tǒng)功能受損，乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，ChAT基因啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭认陆?；這些很可能與腦卒中導(dǎo)致環(huán)路中相應(yīng)腦區(qū)中p-CREB和CBP表達(dá)降低有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］卒中后認(rèn)知障礙；膽堿能環(huán)路；乙酰膽堿；組蛋白乙?；籧AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；小鼠

［本文著錄格式］王鑫，孫彩花，徐旸，等.卒中后認(rèn)知障礙小鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制研究［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（6）：621-628.

CITED AS：Wang X，Sun CH，Xu Y，et al.Change of histone acetylation homeostasis of central cholinergic circuits in mice with post-stroke cognitive impairment［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：621-628.

認(rèn)知功能障礙是腦卒中患者最常見的并發(fā)癥之一。卒中后認(rèn)知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及功能康復(fù)，給家庭和社會(huì)帶來很大的負(fù)擔(dān)［1-2］。PSCI特指卒中后發(fā)生的認(rèn)知障礙，它被認(rèn)為是可以進(jìn)行有效防治的認(rèn)知障礙性疾?。?］。其發(fā)病機(jī)制還不完全明了，因此，探討PSCI的發(fā)病機(jī)制，尋找PSCI治療方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）是迄今發(fā)現(xiàn)的與認(rèn)知功能關(guān)系最為密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)，而腦內(nèi)的中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路，尤其是基底前腦-海馬通路，與認(rèn)知功能關(guān)系緊密［4］。在阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）或老年性認(rèn)知障礙的動(dòng)物模型和臨床病例中，均發(fā)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)環(huán)路的重要腦區(qū)（如海馬）ACh含量下降，功能明顯受損［4-5］。近年來表觀遺傳學(xué)與認(rèn)知功能的關(guān)系逐漸被人們重視，有研究發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中單核細(xì)胞DNA甲基化變化與認(rèn)知功能呈負(fù)相關(guān)，老年性認(rèn)知障礙也與腦內(nèi)相關(guān)腦區(qū)（如海馬）的染色體修飾紊亂有關(guān)［6-7］。不過，關(guān)于中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中表觀遺傳學(xué)變化對認(rèn)知功能影響的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究以PSCI小鼠為動(dòng)物模型，觀察其中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中，表觀遺傳學(xué)中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方式之一——組蛋白乙酰化的變化情況，為更好地闡明PSCI的發(fā)生機(jī)制提供動(dòng)物學(xué)研究支持，并為開發(fā)治療PSCI新的康復(fù)治療手段提供客觀依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR清潔級(jí)小鼠200只，體質(zhì)量25～30g，10～12周齡，由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照單雙號(hào)對小鼠進(jìn)行編號(hào)，單號(hào)為模型組，雙號(hào)為假手術(shù)組。

1.2模型制作

模型組采用線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型［8］。予小鼠戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔麻醉，常規(guī)消毒，于頸部縱向切開皮膚，逐層鈍性分離、暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈血流，于頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端距離分叉處約6mm的地方斜行剪一小口（不剪斷動(dòng)脈），結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，從動(dòng)脈剪開的小口處插入6-0尼龍線栓，送至頸總動(dòng)脈，然后扎緊預(yù)留好的絲線，從破口處剪斷頸外動(dòng)脈，松開頸內(nèi)動(dòng)脈上的血管夾，將線栓從遠(yuǎn)端向近端頸內(nèi)方向推送，直至遇到輕微阻力不能再前送為止，若無明顯血液返流，估計(jì)此時(shí)置入大腦中動(dòng)脈的線栓深度約1cm左右，則將頸外動(dòng)脈殘端及線栓結(jié)扎，開始記錄缺血時(shí)間。缺血30min后，拔出線栓，縫合皮膚。

假手術(shù)組除不插線栓外，其余步驟相同。

在全部造模過程中，手術(shù)室溫度保持25℃左右，并在造模后使用烤燈幫助其復(fù)溫，使體溫保持在37℃左右。

1.3三苯基氯化四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride，TTC）腦染色［9］

術(shù)后24h，假手術(shù)組和模型組進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)（均為1～100號(hào)），每組選取第5、15、25、35、45號(hào)各5只小鼠，斷頭取腦，在-20℃冰箱冷凍10min待腦組織冷凍變硬后取出，用刀片去除嗅球和腦干部分，然后自額極開始行1.5mm厚連續(xù)冠狀切片，共5片。每隔2mm切一片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間；將5片腦片放入2% TTC溶液（由PBS緩沖液配制），用錫箔紙蓋住后，放入37℃溫箱孵育15～30min，每間隔5min輕柔晃動(dòng)平皿，使均勻接觸到染色液。然后將TTC液倒出，在PBS液中洗3次，每次1min。最后在4%中性福爾馬林PBS溶液中固定24h。腦片中白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)域，紅色區(qū)域?yàn)榉枪Ｋ勒＝M織區(qū)域。

1.4蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)［10］

蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test）是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否有抑郁傾向的重要行為學(xué)方法之一，可有效客觀地反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“快感缺失”的情況。其原理是利用小鼠對蔗糖水的嗜好，用以模擬人類的興趣感。于造模后第12天進(jìn)行蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前3d，予小鼠訓(xùn)練飲用1%蔗糖水。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠單籠喂養(yǎng)，在安靜的房間內(nèi)，禁食、禁水10min后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)給予每只小鼠事先定量好的兩瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。30min后調(diào)換蔗糖水和純水的位置，60min后取走兩瓶并稱量。計(jì)算小鼠糖水消耗比例。

若模型組蔗糖水偏愛百分比與假手術(shù)組相比有所下降，提示該小鼠有抑郁傾向，則予以剔除，不進(jìn)行水迷宮測試。

1.5水迷宮測試［11］

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前世界上被普遍認(rèn)為的較為客觀的評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶的方法之一。于造模后第14天，小鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期，escape latency）、尋找到平臺(tái)時(shí)總的游泳距離（searching distance）以及穿越原平臺(tái)次數(shù)來評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.6PSCI小鼠的選?。?2］

動(dòng)物麻醉清醒后均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少，自潔能力下降。術(shù)后1d，假手術(shù)組小鼠精神逐漸開始恢復(fù)，反應(yīng)也變得靈敏，進(jìn)食增多。模型組主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)減少、不能進(jìn)食、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。3～5d后模型組小鼠精神、反應(yīng)、進(jìn)食逐漸恢復(fù)，1周后接近正常。模型組24h后TTC染色5只，12d后死亡10只，剩余85只；假手術(shù)組24h后TTC染色5只，12d后死亡1只，剩余94只。

在剩余模型組小鼠中，選取完全符合以下4個(gè)條件的小鼠作為PSCI小鼠。①蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)中，蔗糖水偏愛百分比與假手術(shù)組相比無顯著性差異；②無明顯肢體癱瘓，可沿直線爬行，無繞圈爬行；③水迷宮測試中，游泳速度與假手術(shù)組相比無顯著性差異；④水迷宮測試中，逃避潛伏期和穿越原平臺(tái)次數(shù)與假手術(shù)小鼠相比有顯著性差異。

最終PSCI小鼠為70只，認(rèn)知障礙率約為80%。

1.7腦組織樣品的制備［12］

PSCI小鼠選取后，隨機(jī)將兩組小鼠進(jìn)行編號(hào)（假手術(shù)組1～94號(hào)，PSCI組1～70）。每組選取前60號(hào)小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。基底前腦-海馬膽堿能神經(jīng)環(huán)路是與認(rèn)知關(guān)系最為密切的中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路。小鼠斷頭取腦，選擇左側(cè)（即MCAO模型栓塞對側(cè)）的基底前腦（basal forebrain，BF）和海馬（hippocampus，HIP）作為研究對象。標(biāo)記后，放入液氮中保存，以備行組織中ACh測定、實(shí)時(shí)定量熒光PCR、Western blotting和染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）檢測。

每種檢測每組取15只小鼠。小鼠隨機(jī)編號(hào)，每組均為1至60號(hào)，ACh測定選用1、5、9……53、57號(hào)小鼠；實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定選用2、6、10……54、58號(hào)小鼠；Western blotting測定選用3、7、11……55、59號(hào)小鼠；染色質(zhì)免疫共沉淀測定選用4、8、 12……56、60號(hào)小鼠。

1.8膽堿能系統(tǒng)的功能相關(guān)指標(biāo)的測定

1.8.1ACh含量［12］

采用ACh濃度測試試劑盒。取基底前腦和海馬的組織與組織裂解液按質(zhì)量：體積=1：9混合，在冰浴中勻漿5min后，3000 r/min，4℃離心10min，取上清液，使用ACh試劑盒、酶標(biāo)儀，測定組織中ACh含量。樣品操作流程如下圖。

表1　樣品操作流程

混勻，靜置10min，取200 μl于96孔板在550nm處酶標(biāo)儀測定各孔OD值。組織中ACh含量的計(jì)算公式如下。

1.8.2膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶mRNA水平

中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路的活性依賴于膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（choline acetyl transferase，ChAT）、囊泡ACh轉(zhuǎn)運(yùn)體、ACh酯酶和ACh受體等，這些物質(zhì)分別承載著ACh的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存、降解和接受功能。ChAT由于穩(wěn)定性高并且僅存在于膽堿能神經(jīng)元內(nèi)，因此被廣泛認(rèn)為是膽堿能神經(jīng)元活性狀態(tài)的最佳標(biāo)記物［13］。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中ChAT mRNA水平［12］。取基底前腦和海馬組織50～100mg，加入1ml預(yù)冷TRIZOL試劑裂解組織，用玻璃勻漿器迅速充分勻漿，根據(jù)試劑盒（PROMEGA公司，SV total RNA isolation system試劑盒，編號(hào)Z3100）操作步驟，提取腦組織中總RNA，并檢測RNA的純度和完整性。選取符合要求的RNA樣品，進(jìn)行Q-PCR檢測（每組至少10個(gè)樣品）。

根據(jù)美國基因生物庫提供基因核酸序列，選取G+C含量約50%的無發(fā)卡結(jié)構(gòu)，相互間無同源序列的兩段特異性保守序列，用PRIMER 5.0設(shè)計(jì)引物。引物均由INVITROGEN公司合成。引物序列見表2。

表2　引物序列

根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司，產(chǎn)品編號(hào)DRR036A）操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒（TAKARA公司，產(chǎn)品編號(hào)DRR041A）操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 45s；59℃50s；72℃35s；35個(gè)循環(huán)，20 μl反應(yīng)體系；應(yīng)用SDS分析軟件（APPLIED BIOSYSTEMS），以2-ΔΔCT法計(jì)算ChAT的相對表達(dá)量。1.8.3 ChAT蛋白水平

采用Western blotting方法測定神經(jīng)環(huán)路中ChAT蛋白［16］。制備基底前腦和海馬組織勻漿，提取蛋白質(zhì)并作蛋白定量，制膠，用Sample Buffer稀釋樣本并加熱使之變性，加樣及電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，結(jié)合一抗ChAT（一抗?jié)舛扔啥啻晤A(yù)試驗(yàn)得出工作濃度，為1：1000），4℃冰箱過夜。結(jié)合二抗（1 ：5000，閉液稀釋），曝光及沖洗膠片，再將X光片結(jié)果掃入計(jì)算機(jī)，用GAPDH作為內(nèi)參，一抗?jié)舛葹?：2000，二抗?jié)舛葹?：5000。用Quantity One軟件對條帶的密度進(jìn)行分析，計(jì)算各條帶的平均密度值。

1.9乙酰化內(nèi)穩(wěn)態(tài)情況的測定

本實(shí)驗(yàn)用乙?；M蛋白H3（acetylated histone H3，Ac-H3）蛋白表達(dá)情況，來判斷腦內(nèi)組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)情況。采用Western blotting方法測定神經(jīng)環(huán)路中Ac-H3蛋白。具體步驟同ChAT蛋白測定，Ac-H3的一抗?jié)舛葹?：500，H3的一抗?jié)舛葹?：1000。

1.10CREB結(jié)合蛋白（CBP）和p-CREB蛋白的測定

采用Western blotting方法測定神經(jīng)環(huán)路中CBP和磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，p-CREB）水平。具體步驟同ChAT蛋白測定，兩者的一抗?jié)舛染鶠?：1000。

1.11ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭鹊臏y定

利用CHIP（MERCK MILLIPORE公司，產(chǎn)品編號(hào)：17-20000）來測定中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭鹊母淖儭Ｓ诒鶅銮衅线x取約2mm3基底前腦和海馬組織，經(jīng)組織處理液（tissue stabilizing solution）處理后，組織中DNA經(jīng)甲醛交聯(lián)，而后由超聲波打斷為200～1000 bp大小的片段；加入Ac-H3一抗（1：1000，MERCK MILLIPORE）或者陰性對照IgG抗體，旋轉(zhuǎn)，4℃冰箱過夜。第2天，蛋白和DNA交聯(lián)復(fù)合物經(jīng)過多重洗脫后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃20s、59℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)，20 μl反應(yīng)體系；PCR擴(kuò)增引物序列是根據(jù)ChAT基因M型啟動(dòng)子而設(shè)計(jì)，引物序列為如下［17］。上游：5'-CTG TGA GGA AGA GAG GCA GG-3'；下游：5'-GAC TGA CTG CAA GCAAAC CA-3'。取PCR產(chǎn)物10 μl，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測，以條帶像素灰度值為結(jié)果進(jìn)行比較。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1TTC染色

與假手術(shù)組小鼠相比，PSCI組小鼠在MCAO造模后24h，右側(cè)皮質(zhì)、海馬和皮質(zhì)下等腦區(qū)均發(fā)生不同程度的梗死（白色箭頭所指區(qū)域），5只小鼠均有梗死區(qū)域，梗死區(qū)域和部位大致相同，提示大腦中動(dòng)脈線栓法可使小鼠發(fā)生缺血性卒中。見圖1。

2.2水迷宮測試

僅將最終選定的60只假手術(shù)組和60只PSCI組大鼠的水迷宮測試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與假手術(shù)組小鼠相比，PSCI組尋找到平臺(tái)時(shí)總的游泳距離增加（P＜0.05），逃避潛伏期延長（P＜0.05）。見表3。

表3　兩組小鼠水迷宮測試成績比較

2.3膽堿能系統(tǒng)的功能測定結(jié)果

2.3.1ACh含量

與假手術(shù)組相比，PSCI組小鼠無論是基底前腦，還是海馬，ACh含量均下降（P＜0.05）。見表4、表5。

2.3.2ChAT mRNA表達(dá)

與假手術(shù)小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦ChAT mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），海馬ChAT mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。見表4、表5。

2.3.3ChAT蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦ChAT蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），海馬ChAT蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。見圖2、表4、表5。

圖2　兩組ChAT蛋白的Western blotting

表4　兩組小鼠基底前腦膽堿能系統(tǒng)的功能比較

表5　兩組小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)的功能比較

2.4Ac-H3蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組相比，PSCI組小鼠基底前腦和海馬的Ac-H3蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）。見圖3、表6。

圖3　兩組Ac-H3蛋白的Western blotting

表6　兩組小鼠基底前腦和海馬的Ac-H3蛋白表達(dá)比較

2.5CBP和p-CREB蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦和海馬的CBP和p-CREB蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05），其中海馬p-CREB蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。見圖4、表7、表8。

2.6ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭?/p>

與假手術(shù)組小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦的實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增的條帶灰度值下降（P＜0.05），海馬的實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增的條帶灰度值明顯下降（P＜0.01）。見表9、圖5。

圖4　兩組CBP和p-CREB蛋白Western blotting

表7　兩組p-CREB蛋白表達(dá)比較

表8　兩組CBP蛋白表達(dá)比較

圖5　兩組ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；綄?shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增條帶結(jié)果

表9　兩組ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭缺容^（灰度值）

3　討論

ACh是迄今發(fā)現(xiàn)的與認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)［18-19］。腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元集中分布于基底前腦、海馬、腦干、皮層等部位，各部位神經(jīng)元之間由突觸相互聯(lián)系，形成廣泛而復(fù)雜的神經(jīng)回路，與工作記憶、言語、情緒、注意力調(diào)節(jié)等有關(guān)。其中，基底前腦和海馬與認(rèn)知功能的關(guān)系最為密切［20］?；浊澳X是指端腦和間腦腹側(cè)和內(nèi)側(cè)的一些灰質(zhì)結(jié)構(gòu)，與其他腦區(qū)沒有十分明確的界線，其經(jīng)典結(jié)構(gòu)包含：內(nèi)側(cè)隔核、Broca斜角帶的垂直支和水平支、腹側(cè)紋狀體蒼白球、杏仁核的延伸部、Meynert基底核和大細(xì)胞視前區(qū)等［20］?；浊澳X-海馬通路是指基底前腦的膽堿能神經(jīng)元發(fā)出纖維經(jīng)穹窿海馬傘投射至海馬，這條通路是被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，一旦損傷此通路可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙［13，20］。

在PSCI研究中均可發(fā)現(xiàn)膽堿能系統(tǒng)功能缺損，包括膽堿能神經(jīng)元缺失，ChAT、ACh等水平降低，并出現(xiàn)相應(yīng)的記憶和學(xué)習(xí)功能受損［3，21］。而針對膽堿能系統(tǒng)的藥物——膽堿能前體補(bǔ)充劑、膽堿酯酶抑制劑等，對PSCI有改善作用［3，21］。這些均說明中樞膽堿能系統(tǒng)功能與PSCI發(fā)生機(jī)制相關(guān)，但具體如何相關(guān)，還未完全闡明。

腦卒中累及基底前腦或海馬等部位可直接損傷膽堿能神經(jīng)元而影響認(rèn)知功能。而臨床上，腦卒中最常累及的部位是內(nèi)囊、屏狀核、外囊和白質(zhì)，通過阻斷膽堿能神經(jīng)環(huán)路的聯(lián)系，導(dǎo)致膽堿能系統(tǒng)功能障礙［22-23］。在本研究中，我們利用MCAO模型模擬臨床腦卒中患者的情況。我們發(fā)現(xiàn)，MCAO可使得皮質(zhì)及皮質(zhì)下區(qū)域（包括海馬等部位）發(fā)生梗死，這些腦區(qū)的壞死不可逆轉(zhuǎn)，說明梗死側(cè)的中樞膽堿能系統(tǒng)的功能受到嚴(yán)重的不可逆損害，這一點(diǎn)在我們以往的研究和他人的研究均已證實(shí)［12，22］。本研究中，通過檢測PSCI的小鼠大腦梗死對側(cè)的基底前腦-海馬膽堿能神經(jīng)環(huán)路的膽堿能系統(tǒng)的功能，發(fā)現(xiàn)其基底前腦和海馬的ACh含量、ChAT mRNA和蛋白表達(dá)均有不同程度的減少，提示PSCI的小鼠大腦梗死對側(cè)的基底前腦-海馬膽堿能神經(jīng)環(huán)路的膽堿能系統(tǒng)的功能下降；同時(shí)，小鼠水迷宮成績明顯下降，認(rèn)知功能受損。因此，可以推斷，當(dāng)梗死導(dǎo)致同側(cè)中樞膽堿能環(huán)路出現(xiàn)不可逆損害，梗死對側(cè)中樞膽堿能環(huán)路未出現(xiàn)代償性的功能提高，卻反而出現(xiàn)功能受損，這很可能是PSCI的重要發(fā)病機(jī)制之一。由于梗死側(cè)中樞膽堿能環(huán)路相關(guān)腦區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)不可逆損傷，因此，PSCI康復(fù)和治療的重點(diǎn)目標(biāo)應(yīng)著眼于改善梗死對側(cè)的中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路的功能。

近年來，神經(jīng)元染色質(zhì)中組蛋白乙?；谡J(rèn)知功能方面的重要作用越來越受到關(guān)注。組蛋白乙酰化是表觀遺傳學(xué)中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方式之一，組蛋白乙?；癄顟B(tài)在組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetytransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）的相互拮抗作用下保持動(dòng)態(tài)平衡，HATs促使組蛋白乙酰化并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性，反之HDACs抑制基因轉(zhuǎn)錄［24-25］。Saha等提出的組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)學(xué)說表明，HATs和HDACs兩大家族相互拮抗，使細(xì)胞內(nèi)的乙?；腿ヒ阴；幱谝环N動(dòng)態(tài)平衡中，精確調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［26］。

基底前腦-海馬膽堿能神經(jīng)環(huán)路作為認(rèn)知功能的關(guān)鍵環(huán)路，其基本組成單位即膽堿能神經(jīng)元的染色質(zhì)重塑與認(rèn)知功能密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在PSCI的小鼠中，其中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路相關(guān)腦區(qū)——基底前腦和海馬的Ac-H3蛋白水平顯著下降。結(jié)果提示組蛋白乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)已經(jīng)在PSCI小鼠中的腦內(nèi)被打破很可能是其認(rèn)知障礙的始動(dòng)因素。

為了探討PSCI小鼠腦內(nèi)乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的原因，我們觀測了小鼠中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路中CBP和p-CREB蛋白的變化情況。CBP具有內(nèi)源性組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性，可增加組蛋白乙酰化程度［27］。CREB是屬于亮氨酸拉鏈家族的轉(zhuǎn)錄因子，通過與數(shù)百種基因序列的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的cAMP反應(yīng)元件（CREs）相結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［28］。CREB經(jīng)磷酸化后活性增強(qiáng)，招募CBP并形成CREB-CBP復(fù)合物［29］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CBP和p-CREB蛋白在PSCI小鼠膽堿能神經(jīng)環(huán)路中均降低，與Ac-H3蛋白水平下降表現(xiàn)一致，說明CBP和p-CREB蛋白表達(dá)下降很可能是PSCI小鼠腦內(nèi)乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的原因。

已有研究證實(shí)，組蛋白乙?；梢詫δ憠A能神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生影響［16-17］。例如，曲古霉素A（Trichostatin A，TSA）能促進(jìn)組蛋白乙酰化，啟動(dòng)ChAT mRNA轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)ChAT蛋白合成，并能逆轉(zhuǎn)由于DNA去甲基化導(dǎo)致的ChAT低表達(dá)，表明組蛋白乙?；绊慉Ch的生成［16-17］。TSA誘導(dǎo)ChAT基因轉(zhuǎn)錄與ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭仍鰪?qiáng)有關(guān)［16-17］。這是由于ChAT基因啟動(dòng)子中含有cAMP反應(yīng)元件結(jié)構(gòu)［17］，是CREB結(jié)合位點(diǎn)，CBP增多后，直接結(jié)合到啟動(dòng)子上，可使得ChAT基因啟動(dòng)子組蛋白乙酰化程度增強(qiáng)、ChAT基因轉(zhuǎn)錄增加；反之，結(jié)合到啟動(dòng)子上的CBP減少，ChAT基因啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭冉档?，ChAT基因轉(zhuǎn)錄減少。本實(shí)驗(yàn)通過CHIP也證實(shí)，PSCI小鼠中，基底前腦和海馬的ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白H3乙?；潭鹊拇_較假手術(shù)組小鼠降低，提示乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡已經(jīng)對PSCI小鼠的膽堿能神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生影響。

綜上所述，PSCI小鼠中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路功能受損機(jī)制很可能是，腦卒中導(dǎo)致腦內(nèi)p-CREB和CBP蛋白減少，膽堿能神經(jīng)環(huán)路乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，ChAT基因M型啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭冉档?，ChAT基因轉(zhuǎn)錄減少，Ach生成減少，認(rèn)知功能下降。短暫性MCAO模型可以引起小鼠認(rèn)知功能障礙，PSCI的小鼠中樞膽堿能神經(jīng)環(huán)路的膽堿能系統(tǒng)功能受損，乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，ChAT基因啟動(dòng)子組蛋白H3乙酰化程度下降，而這些很可能與腦卒中導(dǎo)致環(huán)路中相應(yīng)腦區(qū)中p-CREB和CREB結(jié)合蛋白表達(dá)降低有關(guān)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Dong Y，Venketasubramanian N，Chan BP，et al.Brief screening tests during acute admission in patients with mild stroke are predictive of vascular cognitive impairment 3-6 months after stroke［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2012，83（6）：580-585.

［2］Brainin M，Tuomilehto J，Heiss WD，et al.Post-stroke cognitive decline：an update and perspectives for clinical research［J］.Eur J Neurol，2015，22（2）：229-238.

［3］Pasi M，Poggesi A，Salvadori E，et al.Post-stroke dementia and cognitive impairment［J］.Front Neurol Neurosci，2012，30：65-69.

［4］Zhang X，Jin G，Li W，et al.Ectopic neurogenesis in the forebrain cholinergic system-related areas of a rat dementia model［J］.Stem Cells Dev，2011，20（9）：1627-1638.

［5］Muth K，Schnmeyer R，Matura S，et al.Mild cognitive impairment in the elderly is associated with volume loss of the cholinergic basal forebrain region［J］.Biol Psychiatry，2010，67（6）：588-591.

［6］Di Francesco A，Arosio B，F(xiàn)alconi A，et al.Global changes in DNA methylation in Alzheimer's disease peripheral blood mononuclear cells［J］.Brain Behav Immun，2015，45：139-144.

［7］Spiegel AM，Sewal AS，Rapp PR.Epigenetic contributions tocognitive aging：disentangling mindspan and lifespan［J］.Learn Mem，2014，21（10）：569-574.

［8］Hou SZ，Li Y，Zhu XL，et al.Ameliorative effects of diammonium glycyrrhizinate on inflammation in focal cerebral ischemic-reperfusion injury［J］.Brain Res，2012，1447：20-27.

［9］Lee JH，Wei ZZ，Chen D，et al.A neuroprotective role of the NMDA receptor subunit GluN3A（NR3A）in ischemic stroke of the adult mouse［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2015，308 （7）：C570-C577.

［10］Aisa B，Tordera R，Lasheras B，et al.Cognitive impairment associated to HPA axis hyperactivity after maternal separation in rats［J］.Psychoneuroendocrinology，2007，32（3）：256-266.

［11］Park HR，Kim JY，Lee Y，et al.PMC-12，a traditional herbal medicine，enhances learning memory and hippocampal neurogenesis in mice［J］.Neurosci Lett，2016，617：254-263.

［12］Wang X，Li J，Qian L，et al.Icariin promotes histone acetylation and attenuates post-stroke cognitive impairment in the central cholinergic circuits of mice［J］.Neuroscience，2013，236：281-288.

［13］Robinson L，Platt B，Riedel G.Involvement of the cholinergic system in conditioning and perceptual memory［J］.Behav Brain Res，2011，221（2）：443-465.

［14］Shi S，Shi R，Hashizume K.American ginseng improves neurocognitive function in senescence-accelerated mice：possible role of the up-regulated insulin and choline acetyltransferase gene expression［J］.Geriatr Gerontol Int，2012，12（1）：123-130.

［15］Zhang M，Xu JT，Zhu X，et al.Postsynaptic density-93 deficiency protects cultured cortical neurons from N-methyl-D-aspartate receptor- triggered neurotoxicity［J］.Neuroscience，2010，166：1083-1090.

［16］Aizawa S，Teramoto K，Yamamuro Y.Histone deacetylase 9 as a negative regulator for choline acetyltransferase gene in NG108-15 neuronal cells［J］.Neuroscience，2012，205：63-72.

［17］Aizawa S，Yamamuro Y.Involvement of histone acetylation in the regulation of choline acetyltransferase gene in NG108-15 neuronal cells［J］.Neurochem Int，2010，56：627-633.

［18］Bentley P，Driver J，Dolan RJ.Cholinergic modulation of cognition：insights from human pharmacological functional neuroimaging［J］.Prog Neurobiol，2011，94（4）：360-388.

［19］Nakauchi S，Sumikawa K.Endogenously released ACh and exogenous nicotine differentially facilitate long-term potentiation induction in the hippocampal CA1 region of mice［J］.Eur J Neurosci，2012，35（9）：1381-1395.

［20］Mennenga SE，Gerson JE，Koebele SV，et al.Understanding the cognitive impact of the contraceptive estrogen Ethinyl Estradiol：tonic and cyclic administration impairs memory，and performance correlates performance correlates with basal forebrain cholinergic system integrity［J］.Psychoneuroendocrinology，2015，54：1-13.

［21］Lim JS，Kim N，Jang MU，et al.Cortical hubs and subcortical cholinergic pathways as neural substrates of poststroke dementia［J］.Stroke，2014，45（4）：1069-1076.

［22］Ahmad A，Khan MM，Javed H，et al.Edaravone ameliorates oxidative stress associated cholinergic dysfunction and limits apoptotic response following focal cerebral ischemia in rat［J］.Mol Cell Biochem，2012，367（1-2）：215-225.

［23］Bella R，Cantone M，Lanza G，et al.Cholinergic circuitry function in patients with vascular cognitive impairment-no dementia［J］.Brain Stimul，2016，9（2）：225-233

［24］Fischer A，Sananbenesi F，Mungenast A，et al.Targeting the correct HDAC（s）to treat cognitive disorders［J］.Cell，2010，31 （12）：605-617.

［25］Lee W，Lee SY，Son YJ，et al.Gallic acid decreases inflammatory cytokine cytokine secretion through histone acetyltransferase/histone deacetylase regulation in high glucose-induced human monocytes［J］.J Med Food，2015，18（7）：793-801.

［26］Saha RN，Pahan K.HATs and HDACs in neurodegeneration：a tale of disconcerted acetylation homeostasis［J］.Cell Death Differ，2006，13（4）：539-550.

［27］Lopez-Atalaya JP，Ciccarelli A，Viosca J，et al.CBP is required for environmental enrichment-induced neurogenesis and cognitive enhancement［J］.EMBO J，2011，30：4287-4298.

［28］Flego D，Severino A，Trotta F，et al.Increased PTPN22 expression and defective CREB activation impair regulatory T-cell differentiation in non-ST-segment elevation acute coronary syndromes［J］.JAm Coll Cardiol，2015，65（12）：1175-1186.

［29］Naqvi S，Martin KJ，Arthur JS.CREB phosphorylation at Ser133 regulates transcription via distinct mechanisms downstream of cAMP and MAPK signaling［J］.Biochem J，2014，458（3）：469-479.

Change of Histone Acetylation Homeostasis of Central Cholinergic Circuits in Mice with Post-stroke Cognitive Impairment

WANG Xin，SUN Cai-hua，XU Yang，ZHU Xiao-yun，CHEN Xia，SHI Wei，YANG Min

Department of Neurological Rehabilitation，Affiliated Wutaishan Hospital，Medical College of Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225001，China

Correspondence to WANG Xin.E-mail：wx000805qm@yeah.net

Abstract：Objective To observe the change of histone acetylation homeostasis of the central cholinergic circuits in mice with post-stroke cognitive impairment（PSCI）.Methods The male ICR mice were divided into sham group（n=60）and PSCI group（n=60）.The middle cerebral artery occlusion（MCAO）model was established.The Morris water maze test was used to test the cognitive function，and the changes of function and the histone acetylation homeostasis of the central cholinergic circuits of unaffected side were detected by molecular biology methods.Results Compared with the sham group，the scores of Morris water maze test decreased in PSCI group（t＞29.412，P＜0.05）；while the acetylcholine（Ach）level decreased（t＞26.227，P＜0.05），as well as the expression of choline acetyltransferase（ChAT）mRNA and protein（t＞28.593，P＜0.05），acetylated histone H3（Ac-H3）（t＞24.126，P＜0.05），phosphorylated cAMP response element-binding protein（p-CREB）and CREB binding protein（CBP）（t＞25.634，P＜0.05），and the acetylated histone level of M promoter of ChAT（t＞24.704，P＜0.05）.Conclusion Transient MCAO could cause PSCI.The function of the central cholinergic circuits was impaired，especially the histone acetylation homeostasis of the central cholinergic circuits，such as the acetylated histone level of ChAT promoter decreased.All of that might be related with the decline of p-CREB and CBP level in the corresponding brain regions induced by stroke.

Key words：post-stroke cognitive impairment；cholinergic circuits；acetylcholine；histone acetylation；cAMP response element-binding protein；mice

［中圖分類號(hào)］R749.1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1006-9771（2016）06-0621-08

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.001

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81301673）。

作者單位：揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江蘇省揚(yáng)州五臺(tái)山醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，江蘇揚(yáng)州市225001。

作者簡介：王鑫（1978-），男，漢族，江蘇揚(yáng)州市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail：wx000805qm@yeah.net。

收稿日期：（2016-03-11修回日期：2016-05-25）