草烏多糖金屬配合物的制備、表征與抗癌活性研究

張　茜，芮　瑞，李佩佩，馮翠寧，雷　強，龍　躍

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院， 河南 鄭州 450001； 2.錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院 內(nèi)窺鏡科， 內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

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草烏多糖金屬配合物的制備、表征與抗癌活性研究

張茜1，芮瑞2，李佩佩1，馮翠寧1，雷強1，龍躍1

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院， 河南 鄭州 450001； 2.錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院 內(nèi)窺鏡科， 內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

摘要：以水為提取溶劑從草烏中提取草烏多糖(RPS)，確定了多糖提取的最佳工藝條件:提取溫度90 ℃；提取時間4 h；料液比1∶50，并以草烏多糖為配體，制備了4種多糖金屬配合物(RPS-Ca、RPS-Zn、RPS-Cu、RPS-Fe).采用MTT(噻唑藍)法，以配體草烏多糖為對照，測定了4種多糖金屬配合物對肝癌細胞(HepG2)、乳腺癌細胞(MCF-7)和結(jié)腸癌細胞(HT-29)的抑制作用.實驗結(jié)果顯示，草烏多糖銅配合物對3種癌細胞表現(xiàn)出最強的抑制作用.草烏多糖銅配合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、圓二色譜(CD)、電鏡掃描(SEM)和熱重分析(TGA)得到表征.

關(guān)鍵詞：草烏；多糖金屬配合物；制備；表征；抗癌活性

0引言

草烏( Radix Aconiti Kusnezoffii)為毛茛科植物北烏頭的干燥塊根，是中醫(yī)和蒙醫(yī)的常用藥[1-3].草烏中含有多種糖類[4],而近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，且抗腫瘤活性顯著并對人體毒副作用小，因此，將多糖開發(fā)為新型抗腫瘤藥物是目前抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的熱點[5].

在對多糖結(jié)構(gòu)進行修飾時，人們意識到多糖結(jié)構(gòu)中所含有的羥基、氨基和羧基等基團可以與金屬離子配位，形成多糖金屬配合物,這樣以多糖作為載體，不但保留了多糖和金屬離子各自的活性類型，而且還可以使其活性增強，減少其毒副作用，縮小產(chǎn)品體積[6-8].銅配合物不僅具有抗癌活性，還具有抗炎、抗?jié)?、抗抽搐、抗糖尿病和抗誘變劑等作用[9].

筆者前期已經(jīng)研究了草烏中氨基酸的含量和種類[10]，且有關(guān)草烏及草烏多糖研究的文獻比較多，但草烏多糖與金屬離子作用形成多糖金屬配合物目前還未見報道.筆者采用水為提取溶劑和Sevage溶劑除蛋白的方法從草烏中提取多糖，并優(yōu)化了提取工藝,將草烏多糖與金屬離子配位合成出4種草烏多糖金屬配合物.通過抗癌活性實驗，篩選出的草烏多糖銅配合物對3種癌細胞表現(xiàn)出最強的抑制作用，并對其結(jié)構(gòu)進行了表征.

1實驗部分

1.1試劑和儀器

草烏(購自內(nèi)蒙古通遼市)；氫氧化鈉、無水乙醇、丙酮、無水乙醚、氯化鋅、氯化鈣、氯化銅和氯化鐵均為市售分析純；測試所用腫瘤細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院.

循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)、電子天平(CP214)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE5299)、透析袋(MD34)、紫外分光光度計(Perkin Elmer)、傅里葉變換紅外光譜儀(Vector 22)、圓二色光譜儀(Applied Photophysics Ltd)、電鏡掃描儀(JSM-7100F)、熱重分析儀(STA7300).

1.2實驗方法

1.2.1草烏中多糖的提取

將草烏樣品粉碎后，過250 μm分子篩，乙醇回流脫脂3 h，將其濾渣晾干備用.稱取一定量干燥脫脂后的草烏樣品按照一定料液比(草烏樣品質(zhì)量與提取溶液體積之比)加入提取溶劑(水、0.5 mol/L NaOH、 0.5 mol/L HCl)，在一定溫度下(60～100 ℃)提取2～6 h，過濾，合并提取液，濃縮至原體積的1/5. 將5倍量的乙醇加入到上述濃縮液中靜置24 h，過濾，用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌沉淀，干燥.將固體用適量熱水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入1/3體積Sevage溶劑除蛋白質(zhì)(Sevage溶劑組成為氯仿和正丁醇的摩爾比為4∶1)，分出上層液體，加入5倍量乙醇沉淀24 h，過濾，并用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，干燥，得粗制多糖，稱重，計算收率.

1.2.2草烏多糖的純化

將粗制多糖用少量熱水溶解，轉(zhuǎn)移至透析袋中用去離子水透析2 d.透析過程中需每12 h 換水一次.透析完畢后，將袋中液體倒入燒杯中，加入5倍量乙醇沉淀24 h，過濾，并用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，干燥，得到精品多糖.

1.2.3多糖金屬配合物的制備

取精品多糖0.5 g加入15 mL水溶解，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在8.0～8.5，在70 ℃水浴下攪拌，并緩慢滴加2 mol/L氯化銅溶液.當(dāng)出現(xiàn)絮狀沉淀時立即停止滴加，反應(yīng)1 h后冷卻至室溫離心，取其上清液.向上清液中加入5倍體積的乙醇沉淀24 h，過濾，并用乙醇、丙酮洗滌、干燥得粗制品0.52 g，然后，將粗制的多糖金屬配合物溶于20 mL去離子水中透析3 d.透析過程中需要不斷換水.透析完畢后，將袋中液體倒入燒杯中，加入5倍量乙醇沉淀24 h，過濾，并用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，干燥，得到精制草烏多糖銅配合物0.48 g.鈣(Ⅱ)、鋅(Ⅱ)、鐵(Ⅲ)配合物的制備與上述方法相同.

2抗癌活性的測定

2.1實驗中所用的腫瘤細胞

所用的腫瘤細胞：人肝癌細胞(HepG2)、乳腺癌細胞(MCF-7)和結(jié)腸癌細胞(HT-29).實驗細胞均用改良的RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清和1%的雙抗)在37 ℃的CO2孵箱中培養(yǎng)(95%的氧氣，5%的CO2，保持在適當(dāng)?shù)臐穸?.

2.2抗癌活性的測定

采用MTT法染色原理，向每孔中加入 5 g/L的MTT溶液20 μL.4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床搖10 min使結(jié)晶物溶解.在酶標(biāo)儀上測其吸光度值A(chǔ)(λ=490 nm)，結(jié)果以復(fù)孔A的均值表示. 對測得的數(shù)值進行處理，計算抑制率，結(jié)果見表1.

表1　多糖金屬配合物對癌細胞的抑制率

3結(jié)果與討論

3.1提取條件的選擇

3.1.1提取溶劑的選擇

按照一定料液比1∶40，分別以水、0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl為提取溶劑，100 ℃提取3 h，計算粗制多糖收率，結(jié)果見圖1.

圖1　不同溶劑的影響Fig.1　Effect of different solvents

由圖1可以看出，水溶劑提取多糖的收率最大，因此，選定水為提取溶劑.

3.1.2料液比的選擇

以水為提取溶劑，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60，100 ℃提取3 h，計算粗制多糖收率，結(jié)果見圖2.

圖2　料液比的影響Fig.2　Effect of ratio of material to liquid

由圖2的結(jié)果可知，當(dāng)料液比為1∶50時，多糖的收率最大;當(dāng)料液比小于1∶50時，收率隨著料液比的增加而增大；當(dāng)料液比超過1∶50時，收率減小.

3.1.3提取溫度的選擇

以水為提取溶劑，料液比為1∶50，分別于60、70、80、90、100 ℃提取4 h，計算粗制多糖收率,結(jié)果見圖3.由圖3的結(jié)果可知，當(dāng)提取溫度由60 ℃增加到90 ℃時，多糖收率增加明顯；當(dāng)溫度高于90 ℃后，多糖收率增加趨勢減緩，因此，選擇90 ℃為提取溫度.

圖3　提取溫度的影響Fig.3　Effect of extraction temperature

3.1.4提取時間的選擇

以水為提取溶劑，料液比為1∶50，90 ℃下提取2、3、4、5、6 h，計算粗制多糖收率，結(jié)果見圖4.

圖4　提取時間的影響Fig.4　Effect of extraction time

由圖4的結(jié)果可知，當(dāng)提取時間由2 h增加到4 h時，多糖收率增加明顯；4 h后多糖收率增加趨勢減緩，因此，選擇4 h為提取時間.

3.2抗癌活性結(jié)果

在合成的4種多糖金屬配合物中，多糖鈣配合物、多糖鋅配合物和多糖銅配合物相對于草烏多糖對3種癌細胞的抑制率都有很大提高，其中多糖銅配合物的抑制作用最大.而多糖鐵配合物相對于草烏多糖對人肝癌細胞(HepG2)的抑制率有所降低，且濃度為100 μg/ml時對乳腺癌細胞(MCF-7)幾乎沒有表現(xiàn)出抑制活性.

3.3多糖金屬配合物的表征

草烏多糖和草烏多糖銅配合物的紅外光譜如圖5所示.草烏多糖紅外光譜圖主要吸收峰的歸屬：3 420 cm-1處為—OH的伸縮振動吸收峰；1 732 cm-1處為羰基的伸縮振動吸收峰；1 649.82 cm-1處為—OH的彎曲振動吸收峰.草烏多糖銅配合物的紅外光譜圖中主要吸收峰的歸屬：3 416 cm-1處為—OH的伸縮振動吸收峰，與多糖相比發(fā)生少量紅移； 1 648 cm-1處為羰基的伸縮振動吸收峰；1 623 cm-1處為—OH的彎曲振動吸收峰，與多糖相比發(fā)生了明顯的紅移.

圖5　草烏多糖(a)和草烏多糖銅配合物(b)的紅外光譜Fig.5　IR spectra of RPS(a)and RPS-Cu(b)

草烏多糖和草烏多糖銅配合物的紫外光譜如圖6所示.可以看出，草烏多糖的最大吸收波長在237 nm處，與銅離子作用后最大吸收波長減小為228 nm，這是由于形成配合物之后影響了電子的躍遷，從而導(dǎo)致最大吸收波長發(fā)生改變.

圖6　草烏多糖(a)和草烏多糖銅 配合物(b)的紫外光譜Fig.6　UV spectra of RPS(a)and RPS-Cu(b)

觀察草烏多糖和草烏多糖金屬銅配合物的CD譜如圖7所示.由圖7可以發(fā)現(xiàn)，波長在200～300 nm時譜圖變化較為明顯，波長在248 nm附近銅配合物出現(xiàn)負Cotton效應(yīng)，而多糖并沒有此種效應(yīng).

圖7　草烏多糖(a)和草烏多糖銅配合物(b)的圓二色光譜Fig.7　CD spectra of RPS(a)and RPS-Cu(b)

掃描電鏡是定性分析、表征化合物表面形貌的重要手段之一.草烏多糖和草烏多糖銅配合物的掃描電鏡圖如圖8所示.從圖8可以看出，配體草烏多糖呈交聯(lián)網(wǎng)狀，與銅離子配位后，呈顆粒狀，配位前后表面形貌發(fā)生了顯著的變化.

草烏多糖和草烏多糖銅配合物的熱重曲線如圖9所示.從圖9可以看出，草烏多糖的第一段質(zhì)

量損失在小于177 ℃(質(zhì)量損失10.62%)，草烏多糖銅配合物的第一段質(zhì)量損失在小于216 ℃(質(zhì)量損失9.73%)，通過對比草烏多糖及其配合物的熱重曲線可以看出，形成配合物后，多糖的熱穩(wěn)定性增加.綜合以上結(jié)果，可以說明多糖與金屬離子發(fā)生了配位.

圖8　草烏多糖(a)和草烏多糖銅 配合物(b)的掃描電鏡顯微圖Fig.8　SEM micrographs of RPS(a)and RPS-Cu(b)

圖9　草烏多糖和草烏多糖銅配合物的熱重曲線Fig.9　TGA of RPS(a) and RPS-Cu(b)

4結(jié)論

確定了草烏中多糖提取的最佳工藝條件：提取溶劑為水，提取溫度90 ℃，提取時間4 h，料液比1∶50.通過體外抗癌活性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗合成了4種草烏多糖金屬配合物，且4種草烏多糖金屬配合物除草烏多糖鐵外，其余均表現(xiàn)出比草烏多糖高的抑制活性，其中草烏多糖銅配合物對3種腫瘤細胞的抑制作用最強.除此之外，其結(jié)構(gòu)經(jīng)紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、圓二色譜(CD)、電鏡掃描(SEM)和熱重分析(TGA)得到表征.

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Preparation, Characterization, and Anticancer Evaluation of Inner Mongolia Radix Aconiti Kusenezoffii Polysaccharide Metal Complexes

ZHANG Xi1, RUI Rui2, LI Peipei1, FENG Cuining1, LEI Qiang1, LONG Yue1

(1.College of Chemistry and Molecular Engineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China; 2.Department of Endoscope, Xilinguole Meng Mongolian General Hospital, Xilinhaote 026000，China)

Abstract:By using water as extraction reagent，the polysaccharides in Radix Aconiti Kusnezoffii were extracted. The results showed that optimum extraction condition was 90℃, 4 h, and liquid to material ratio 1∶50. Four polysaccharide complexes were prepared using four metal ions(Ca2+，Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e3+) and polysaccharides from Radix Aconiti Kusnezoffii, respectively. All complexes were evaluated for biological activity against three human cancer cell lines (HepG2, MCF-7 and HT-29) by the standard MTT method, and the results showed that PRS-Cu possessed the highest growth inhibitory effects. The complex was characterized by UV, IR, CD, SEM, and TGA.

Key words:radix aconiti kusnezoffii; polysaccharide metal complex; preparation; characterization; anticancer activity

收稿日期:2015-10-20；

修訂日期：2015-11-26

基金項目：河南省科技攻關(guān)計劃資助項目(0624420031)；河南省基礎(chǔ)研究基金資助項目(022463001)

通信作者:龍躍(1960—) ，男，湖南長沙人，鄭州大學(xué)教授，主要從事藥物合成及天然有機化學(xué)研究，E-mail: longyue@zzu.edu.cn.

文章編號:1671-6833(2016)03-0036-04

中圖分類號：O629.1

文獻標(biāo)志碼：A

doi:10.13705/j.issn.1671-6833.2016.03.008