不同溫度下大鼠腦組織RNA降解與早期PMI的相關(guān)性

呂葉輝，李志宏，托　婭，劉　麗，李　堃，卞　杰，馬劍龍，陳　龍（．上海健康醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，上海 038；．復(fù)旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 0003）

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不同溫度下大鼠腦組織RNA降解與早期PMI的相關(guān)性

呂葉輝1，李志宏1，托婭1，劉麗1，李堃1，卞杰1，馬劍龍2，陳龍2
（1．上海健康醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，上海 201318；2．復(fù)旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 200032）

摘要：目的 探討大鼠腦組織8種RNA指標，在不同溫度下的表達水平與早期死亡時間（PMI）的相關(guān)性。方法 將222只SD大鼠隨機分為對照組（死后0h）和4個實驗組，實驗組斷頸處死后分別置于5℃、15℃、25℃和35℃的環(huán)境中，于死后1～24 h內(nèi)9個時間點提取腦組織RNA，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測8種RNA指標（β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及miRNA-125b）的表達水平，geNorm軟件選取合適內(nèi)參，SPSS軟件對內(nèi)參標準化RNA指標進行回歸分析，R軟件構(gòu)建推斷PMI的數(shù)學模型，另選6只已知PMI的SD大鼠予以驗證。結(jié)果 5S rRNA、miR-9和miR-125b表達穩(wěn)定，可作為內(nèi)參指標。β-actin和GAPDH具有良好的時序性降解規(guī)律，在24h內(nèi)隨PMI延長不斷降解。R軟件擬合得ΔCt值隨PMI和溫度變化的數(shù)學模型可用以推斷PMI。運用β-actin和GAPDH驗證模型的平均誤差率分別為14.1%和22.2%。結(jié)論 β-actin和GAPDH表達水平與PMI和環(huán)境溫度相關(guān)性良好。本研究建立的數(shù)學模型可為溫度變化條件下的早期PMI推斷提供參考。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學；RNA；死亡時間；溫度；降解；大鼠

死亡時間（PMI）是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔，PMI的精確推斷有助于迅速確定涉案罪犯以及排除嫌疑人，為偵查部門提供重要線索，并為司法實踐提供重要科學依據(jù)。利用傳統(tǒng)的方法進行PMI推斷，其結(jié)果易受主觀因素和外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致推斷的精確性較低。

隨著分子生物學技術(shù)在法醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，利用RNA的時間依賴性降解規(guī)律推斷PMI正逐漸成為研究熱點［1］，但針對RNA在不同溫度下早期PMI降解規(guī)律的研究較少。本研究利用實時熒光定量

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：9700型PCR擴增儀、Prism 7500型熒光定量PCR儀（美國AB公司），NanoDrop 1000分光光度計（美國Thermo公司），Agilent 2100生物分析儀（美國Agilient公司）。

試劑：TRIzol試劑盒（美國 Invitrogen公司），RNAlater保護液、PrimeScriptTMRT試劑盒、One Step PrimeScriptTMmiRNA cDNA Synthesis試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水）。

1.2實驗動物分組及處理

清潔級成年雄性SD大鼠228只，體質(zhì)量（220± 20）g，由復(fù)旦大學上海醫(yī)學院實驗動物部提供，隨機選取其中6只備用，其余222只大鼠斷頸處死后隨機分為對照組（死后即刻0h，6只）和4個實驗組（每組54只）。實驗組大鼠尸體分別置于（5±1）℃、（15±1）℃、（25±1）℃和（35±1）℃環(huán)境中，并分別在死后1、3、6、9、12、15、18、21、24 h（每個時間點6只）提取大鼠額葉腦組織50～100mg。另取6只備用的大鼠，斷頸處死后隨機分為3組，尸體分別置于（10±1）℃、（20±1）℃和（30±1）℃環(huán)境中，并分別在死后10、20h（每個時間點1只）提取大鼠額葉腦組織50～100 mg，用以驗證數(shù)學模型。所取腦組織均用無菌眼科剪剪碎后分裝于RNAlater保護液中，置于-80℃凍存。

1.3總RNA提取

準確稱取腦組織質(zhì)量，加入液氮研碎組織后轉(zhuǎn)入勻漿器中，按照TRIzol試劑盒總RNA提取說明書操作步驟提取總RNA，加入30μL DEPC水溶解后置于-80℃凍存。NanoDrop 1000分光光度計測定RNA的純度及濃度，用光密度（D）表示，并檢測D260/D280值。Agilent 2100生物分析儀測定RNA完整性，用RNA完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）表示。

1.4指標選擇

本研究選擇8種RNA指標，分別為β-肌動蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、核糖體蛋白S29 （ribosomal protein S29，RPS29）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、5S核糖體RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）、微小RNA-9（miRNA-9，miR-9）及微小RNA-125b（miRNA-125b，miR-125b）。引物設(shè)計至少跨一個外顯子或外顯子區(qū)域以保證cDNA正確的合成與擴增，擴增產(chǎn)物片段長度均在200bp以下。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1　實驗選取的RNA指標及引物序列

1.5總RNA反轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用PrimeScriptTMRT試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以用于β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA的實時熒光定量PCR。取RNA樣本500 ng進行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書配置10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，1個循環(huán)。應(yīng)用One Step PrimeScriptTMmiRNA cDNA Synthesis試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以用于5S rRNA、U6 snRNA、miR-9、miR-125b的實時熒光定量PCR。取RNA樣本500ng進行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書配置10μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：37℃ 60 min，85℃ 5 s，1個循環(huán)。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA以1∶10稀釋，置于-20℃凍存。

1.6實時熒光定量PCR

應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。按照試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系，并應(yīng)用Prism 7500型熒光定量PCR儀進行擴增。擴增條件：95℃ 30s，1個循環(huán)；95℃ 5s，60℃34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個循環(huán)。每個樣本重復(fù)三次，結(jié)果由系統(tǒng)自動生成，從而得到各個RNA指標的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）。

1.7統(tǒng)計學分析

1.7.1RNA濃度及完整性檢測

運用SPSS v22.0（美國SPSS公司）對RNA單位質(zhì)量濃度及RIN進行統(tǒng)計分析，多組間運用單因素方差分析，兩組間運用t檢驗進行差異性分析。檢驗水準α=0.05。

1.7.2內(nèi)參選擇

運用geNorm v3.5軟件（比利時Biogazelle公司）［2］對RNA指標的Ct值進行統(tǒng)計學處理。根據(jù)平均表達穩(wěn)定度M值確定最穩(wěn)定的指標，M值越小，指標的穩(wěn)定性越高。根據(jù)平均表達穩(wěn)定度的配對變異V值判斷引入新的內(nèi)參指標是否會對標準化因子產(chǎn)生顯著影響，默認V值為0.15，如果Vn/Vn+1（n＞1）小于0.15（當多個V值符合時選取最小值），說明n或n+1個RNA指標可以作為內(nèi)參指標使用。除內(nèi)參指標外，其余RNA指標作為候選指標。

1.7.3模型建立

運用SPSS v22.0、Excel 2010（美國Microsoft公司）軟件對候選RNA指標 Ct值進行內(nèi)參標準化（ΔCt=Ct候選指標-Ct內(nèi)參均值），內(nèi)參均值為內(nèi)參指標的幾何平均數(shù)，并對不同溫度組下候選RNA指標ΔCt值及PMI進行三次方回歸分析并計算相關(guān)系數(shù)r，平均相關(guān)系數(shù)較高的候選指標將被用于構(gòu)建模型。運用R v3.2.3軟件（美國RStudio公司）構(gòu)建以溫度（x）、PMI（y）為自變量，ΔCt值（z）為因變量的三元二次方程，即z=k1x2+k2x+k3xy+k4y+k5y2+k0。使用MATLAB v7.0軟件（美國MathWorks公司）將方程轉(zhuǎn)為三維可視化數(shù)學模型。檢驗水準α=0.01。

1.7.4模型驗證

將已知PMI的備用大鼠樣本數(shù)據(jù)代入模型進行驗證，并計算推斷PMI和實際PMI之間的差異程度，用推斷誤差及誤差率表示，推斷誤差=|PMI推斷-PMI實際|，誤差率=|PMI推斷-PMI實際|/PMI實際×100%。

2　結(jié)果

2.1RNA純度、濃度、完整性及實時熒光定量PCR結(jié)果

測得所有RNA樣本的D260/D280均在1.8～2.0，證明RNA純度較高。各組間RNA單位質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組RIN值為9.45±0.08 （9.2～9.7），5℃組為9.20±0.11（8.6～9.6），15℃組為8.40±0.25（7.2～9.6），25℃組為7.42±0.55（4.8～9.2），35℃組為7.06±0.73（3.5～9.4）。與對照組相比，5℃組RIN值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而15℃、25℃和35℃組RIN值降低（P＜0.05），表明在較高溫度下RNA逐漸降解，其完整性隨PMI延長逐漸降低。

所有樣品均成功反轉(zhuǎn)，得到Ct值。擴增曲線和溶解曲線完好，表明樣本均成功特異性擴增。

2.2內(nèi)參選擇結(jié)果

4個不同溫度組的RNA指標的平均表達穩(wěn)定度M值及標準化因子的配對變異Vn/Vn+1值，如表2所示。以5℃組為例，RNA指標平均表達穩(wěn)定度M值由高到低排序依次為β-actin＞GAPDH＞18S rRNA＞RPS29＞U6 snRNA＞miR-9＞5S rRNA=miR-125b，表明5S rRNA和miR-125b穩(wěn)定性最好，而β-actin和GAPDH較不穩(wěn)定；相比其他Vn/Vn+1值，V3/V4小于0.15且最小，表明選擇3個或4個RNA指標作為5℃組內(nèi)參最為合適，即miR-9、5S rRNA、miR-125b或U6 snRNA、miR-9、5S rRNA、miR-125b。

表2　不同溫度組RNA指標的穩(wěn)定性對比

以此類推，15℃組內(nèi)參為miR-9、5S rRNA、miR-125b或 U6 snRNA、miR-9、5S rRNA、miR-125b；25℃組內(nèi)參為miR-9、miR-125b或5S rRNA、miR-9、miR-125b；35℃組內(nèi)參為miR-9、miR-125b或5S rRNA、miR-9、miR-125b。

綜合4個溫度組對RNA指標進行分析，5S rRNA、miR-9和miR-125b在各溫度組均有較好的穩(wěn)定性；U6 snRNA在5℃、15℃組相對穩(wěn)定，但在25℃、35℃組穩(wěn)定性下降；β-actin和GAPDH在4個溫度組中均不穩(wěn)定。因此，4個溫度組均選擇5S rRNA、miR-9和miR-125b作為內(nèi)參指標，其余RNA指標作為候選指標。

2.3PMI推斷的模型建立

對候選RNA指標的Ct值進行內(nèi)參標準化，即Ct內(nèi)參均值=（Ct5S rRNA×CtmiR-9×CtmiR-125b）1/3。利用統(tǒng)計軟件對4個溫度組內(nèi)5種候選RNA指標的ΔCt值和PMI進行三次方回歸分析并計算相關(guān)系數(shù)r，如表3所示。

表3　不同溫度組內(nèi)參標準化的RNA指標與PMI的相關(guān)性分析（r值）

結(jié)果表明，18S rRNA、RPS29和U6 snRNA在5℃、15℃時與PMI相關(guān)性較低，但在25℃、35℃時與PMI相關(guān)性提高；β-actin和GAPDH在4個溫度組內(nèi)都與PMI有著良好的相關(guān)性，且β-actin和GAPDH的平均r值均高于0.87；因此選擇β-actin和GAPDH用于構(gòu)建推斷PMI的數(shù)學模型。

運用R v3.2.3軟件構(gòu)建三元二次方程，統(tǒng)計結(jié)果表明x、xy、y、y2、k0項具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），重新計算后得到β-actin的方程為z=0.0048x+0.0023xy+ 0.033 1 y-0.001 5 y2+3.567 7，GAPDH的方程為z= -0.002 7 x+0.003 0 xy+0.028 3 y-0.000 5 y2+2.650 8；決定系數(shù)R2分別為0.9375和0.9017，表明擬合優(yōu)度較高。

使用MATLAB v7.0軟件將方程轉(zhuǎn)為三維可視化數(shù)學模型，β-actin和GAPDH的模型如圖1～2所示。結(jié)果顯示，早期PMI內(nèi)，β-actin和GAPDH的ΔCt值隨著PMI延長不斷增加，而且ΔCt值增加的速率不僅與PMI相關(guān)，也與環(huán)境溫度相關(guān)。

2.4PMI推斷的模型驗證

運用R軟件將6只備用大鼠樣本的ΔCt值及溫度分別代入β-actin、GAPDH模型進行驗證，分別得到兩者的PMI推斷值，并計算推斷PMI與實際PMI的誤差率，如表4所示。運用β-actin模型進行PMI推斷，平均推斷誤差為1.9h，平均誤差率為14.1%；運用GAPDH模型進行PMI推斷，平均推斷誤差為3.0h，平均誤差率為22.2%。對于環(huán)境溫度較高（30℃）、PMI較長（20 h）的樣本，運用該模型進行PMI推斷時，推斷誤差和誤差率相對較低。

表4　β-actin和GAPDH數(shù)學模型驗證結(jié)果

3　討論

早期PMI（24 h內(nèi)）是指尸體未出現(xiàn)明顯腐敗現(xiàn)象的時期，對于法醫(yī)鑒定來說更常用也更重要，因此早期PMI的精確推斷一直是法醫(yī)學研究的重點和難點。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，利用生物體內(nèi)大分子來推斷PMI成為當前研究的熱點，尤其是依據(jù)RNA的時間依賴性降解規(guī)律推斷PMI已經(jīng)取得了一些進展［3］。由于RNA的降解不僅與PMI有關(guān)，在很大程度上也受到環(huán)境溫度的影響，因此相關(guān)研究也會考慮此影響因素，但多數(shù)研究僅將實驗溫度設(shè)定在室溫或單個環(huán)境溫度下［4-5］，而在實際檢案中尸體處于不斷變化的環(huán)境溫度中，因此單一的實驗溫度設(shè)定會限制其實用性。本研究設(shè)定4個連續(xù)溫度的實驗組，即5℃、15℃、25℃和35℃，選擇受其他因素影響較小的腦組織作為檢材，8種RNA作為指標，利用實時熒光定量PCR檢測RNA降解規(guī)律以推斷PMI。

作為快速高效的RNA定量技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)在PMI推斷的研究中得到廣泛應(yīng)用。為了保證結(jié)果的可重復(fù)性和客觀性，在應(yīng)用該技術(shù)時應(yīng)對各項操作進行統(tǒng)一規(guī)范。Bustin等［6］提出的標準化實時熒光定量PCR指南（the minimum information for publication of qRT-PCR experiments，MIQE）正逐漸被廣泛認可。本實驗流程均按照MIQE指南進行，包括樣本的采集、處理和準備，RNA的質(zhì)量控制、反轉(zhuǎn)錄效率、引物設(shè)計、擴增曲線、溶解曲線檢測靈敏性、特異性、內(nèi)參指標的選擇、數(shù)據(jù)處理等。其中，定量PCR結(jié)果很大程度上依賴于內(nèi)參指標的標準化處理［6-8］。因此，篩選出穩(wěn)定適用、較少受PMI和溫度影響的內(nèi)參指標就顯得尤為必要。

經(jīng)geNorm軟件統(tǒng)計后，5S rRNA、miR-9和miR-125b在4個溫度組中都比較穩(wěn)定，因此將這3種指標作為本研究的內(nèi)參指標，其余指標作為候選指標。5S rRNA在miRNA研究中常被選作內(nèi)參基因［9-10］，其存在于核糖體蛋白復(fù)合物中，可適度隔絕核酶和其他因素的影響，使之保持穩(wěn)定。相對于18S rRNA，5S rRNA片段較短，受PMI及溫度因素的影響較小，更適合作為PMI推斷的內(nèi)參指標。miRNA屬于非編碼小RNA家族，其長度只有21～25 bp，以往研究［11-13］證實，miRNA在死后一段時間內(nèi)表達穩(wěn)定。在不同溫度組中，miR-9 和miR-125b在死后24h內(nèi)均保持穩(wěn)定，表明miRNA適合作為PMI推斷的內(nèi)參指標。此外miR-9和miR-125b均是腦組織特異性miRNA［14］。β-actin和GAPDH是常用的RNA指標，性質(zhì)相對穩(wěn)定保守［15］。本課題組在前期研究中也常選用β-actin和GAPDH作為候選指標進行PMI推斷［11-12，16］。U6 snRNA在PMI相關(guān)研究中也常被選作內(nèi)參指標［7，11］，張萍等［17］證實死亡早期人體心肌組織中U6 snRNA表達穩(wěn)定，其穩(wěn)定性可能與其本身的發(fā)卡結(jié)構(gòu)及存在的細胞核中沒有核酶有關(guān)。本研究腦組織中U6 snRNA在溫度較低時表達穩(wěn)定，但在溫度較高（尤其是35℃組）時穩(wěn)定性降低，即U6 snRNA穩(wěn)定性與溫度有關(guān)，不適合作為本研究內(nèi)參指標，這可能是由于通常狀態(tài)下與snRNA結(jié)合成復(fù)合物的小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP）在較高溫度時降解所致［18］。RPS29和18S rRNA也是檢測PMI的常用指標，降解規(guī)律在不同實驗條件下呈現(xiàn)出不同的模式［5，11-12］，還需進一步研究。

對上述5種候選RNA指標進行內(nèi)參標準化處理，在各溫度組分別對ΔCt值和PMI進行回歸分析，并依據(jù)相關(guān)系數(shù)篩選出與PMI相關(guān)性最好的RNA指標。結(jié)果表明，β-actin、GAPDH在不同條件下均具有較高的相關(guān)系數(shù)。內(nèi)參選擇時也印證了這一點，即β-actin和GAPDH在4個溫度組中都具有較高的M值。相較其他候選RNA指標，β-actin和GAPDH更容易受到PMI的影響，在24h內(nèi)隨PMI延長不斷降解，擁有良好的時序性降解規(guī)律，與一些前期研究［11-12，19］一致?？紤]到環(huán)境溫度的影響，為了使PMI推斷結(jié)果更加精確，本研究使用R軟件分別對β-actin和GAPDH進行多參數(shù)擬合，得到ΔCt值、溫度和PMI三個變量的三元二次方程，決定系數(shù)R2分別為0.9375和0.9017，表明擬合優(yōu)度較高。說明在不同溫度下，β-actin和GAPDH有著相似的降解規(guī)律，ΔCt值與PMI的關(guān)系近似符合三元二次方程分布。在24 h內(nèi)，β-actin和GAPDH的ΔCt值隨著PMI延長不斷增加，表明RNA 隨PMI不斷降解。溫度較低時ΔCt值增加速率較慢，而溫度較高時ΔCt值增加速率較快，表明ΔCt值升高速率與環(huán)境溫度也呈正相關(guān)關(guān)系，證實隨著環(huán)境溫度的增高，RNA的降解速率加快。

為確保PMI推斷的準確性，本研究還利用已知PMI的備用大鼠樣本對數(shù)學模型進行驗證。運用βactin模型進行驗證時，實際PMI為10h的樣本，推斷誤差在2.3 h內(nèi)；實際PMI為20 h的樣本，推斷誤差在3.6h內(nèi)。運用GAPDH模型進行驗證時，實際PMI 為10h的樣本，推斷誤差在3.9h內(nèi)；實際PMI為20h的樣本，推斷誤差在5.5h內(nèi)。相較GAPDH，利用βactin模型進行PMI推斷更為精確，這可能是由于βactin模型擁有更高的決定系數(shù)，擬合優(yōu)度較好。環(huán)境溫度越高、PMI越長，利用該模型推斷PMI的精確性越高，推測是由于隨PMI的延長和環(huán)境溫度增高，RNA降解速率加快以致ΔCt增加明顯所致。

本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)觀察大鼠腦組織8種RNA指標在5℃、15℃、25℃和35℃環(huán)境中的早期降解規(guī)律。實驗結(jié)果顯示，在4個溫度組中，5S rRNA、miR-9和miR-125b表達穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參指標。經(jīng)內(nèi)參標準化處理后β-actin和GAPDH與PMI和環(huán)境溫度有著較好的相關(guān)性，表明RNA降解不僅與PMI有關(guān)，也與環(huán)境溫度有關(guān)。經(jīng)R軟件擬合ΔCt值、溫度和PMI三個變量，分別得到β-actin和GAPDH的數(shù)學模型推斷PMI。用已知PMI的大鼠樣本進行驗證，結(jié)果證實運用該數(shù)學模型推斷早期PMI相對準確有效，有望成為早期PMI推斷的新方法。在今后的研究中，本課題組將對以上實驗結(jié)果進一步使用人體資料進行驗證。

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（本文編輯：鄒冬華）

中圖分類號：DF795.1

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.002

文章編號：1004-5619（2016）03-0165-06

基金項目：上海健康醫(yī)學院種子基金項目；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃項目

作者簡介：呂葉輝（1989—），男，碩士，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學教學、科研工作；E-mail：yeyeliushu@163.com

通信作者：陳龍，男，博士，主任法醫(yī)師，副教授，主要從事法醫(yī)病理學及法醫(yī)臨床學研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cnPCR技術(shù)，檢測死后24h內(nèi)大鼠腦組織8種RNA在5℃、15℃、25℃和35℃環(huán)境下的變化規(guī)律，建立各指標與PMI之間的關(guān)系模型，以期為不同溫度下早期PMI的推斷提供新思路。

收稿日期：（2016-01-30）

Correlation between RNA Degradation Patterns of Rat’s Brain and Early PMI at Different Temperatures

Lü Ye-hui1，LI Zhi-hong1，TUO Ya1，LIU Li1，LI Kun1，BIAN Jie1，MA Jian-long2，CHEN Long2
（1.School of Basic Medical Science，Shanghai University of Medicine&Health Science，Shanghai 201318，China；2.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Abstract：Objective To explore the correlation between early postmortem interval（PMI）and eight RNA markers of rat’s brain at different temperatures.Methods Total 222 SD rats were randomly divided into control group（PMI=0 h）and four experimental groups.And the rats in the experimental groups were sacrificed by cervical dislocation and respectively kept at 5℃，15℃，25℃ and 35℃ in a controlled environment chamber.The RNA was extracted from brain tissues，which was taken at 9 time points from 1 h to 24 h postmortem.The expression levels of eight markers，β-actin，GAPDH，RPS29，18S rRNA，5S rRNA，U6 snRNA，miRNA-9 and miRNA-125b，were detected using real-time fluorescent quantitative PCR，respectively.Proper internal reference was selected by geNorm software.Regression analysis of normalized RNA markers was performed by SPSS software.Mathematical model for PMI estimation was established using R software.Another 6 SD rats with known PMI were used to verify the mathematical model.Results 5S rRNA，miR-9 and miR-125b were suitable as internal reference markers for their stable expression.Both β-actin and GAPDH had well time-dependent degradation patterns and degraded continually with prolongation of PMI in 24 h postmortem.The mathematical model of the variation of ΔCt values with PMI and temperature was set up by R software and the model could be used for PMI estimation.The average error rates of model validation using β-actin and GAPDH were 14.1%and 22.2%，respectively.Conclusion The expression levels of β-actin and GAPDH are well correlated with PMI and environmental temperature.The mathematical model established in present study can provide references for estimating early PMI under various temperature conditions.

Key words：forensic pathology；RNA；postmortem intervals；temperature；degradation；rats