微生物混合對纖維素酶活的影響

郝建宇，侯紅萍，鄭淵潔

(山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

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微生物混合對纖維素酶活的影響

郝建宇，侯紅萍*，鄭淵潔

(山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的]研究微生物共存及優(yōu)化纖維素酶酶系種類和比例搭配。[方法]分別把里氏木霉、黑曲霉和兩者1∶1混合菌系以總接種量8 mL接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，10 d內(nèi)每天測定3種纖維素酶組分酶活和濾紙酶活，以此分析其混合菌系與單菌株的生長關系和三種組分酶活的比例。[結果]混合菌系的內(nèi)切葡聚糖酶活力在第7 d達到峰值，外切葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分別在在第4 d、5 d達到峰值后，在第7 d、6 d又有上升趨勢，但這3種組分酶活不同程度低于單菌株，而總酶活力濾紙酶活卻高于單菌株。[結論]3種組分酶活力的比例不同，決定著纖維素酶系的完整與否，從而決定了纖維素酶對纖維素的降解程度。

關鍵詞：里氏木霉； 黑曲霉； 纖維素酶活

木質(zhì)纖維素包括木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，結構復雜很難降解。作為可再生資源，木質(zhì)纖維素產(chǎn)量巨大且未得到充分利用，故國內(nèi)外對微生物分解轉化纖維素的研究極為重視。自20世紀70年代起，利用混合發(fā)酵提高纖維素酶產(chǎn)率和活性，克服酶系不完全已引起廣泛關注。其中，混合發(fā)酵是指兩種或兩種以上的微生物在同一培養(yǎng)基中進行的發(fā)酵，在一定程度上有利于微生物間協(xié)調(diào)生長，進而發(fā)揮各酶之間的協(xié)同作用，使纖維素酶活性較高，從而達到提高產(chǎn)物的生產(chǎn)效率或降低培養(yǎng)基要求等效果[1，2]。目前，微生物的混合發(fā)酵培養(yǎng)已廣泛應用于木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的降解與轉化，不斷加強對纖維素類物質(zhì)混合發(fā)酵的理論和優(yōu)化發(fā)酵工藝，具有重要的現(xiàn)實意義[3]。

纖維素酶是一類能分解纖維素的復雜酶系，主要由外切β-1,4-葡聚糖纖維二糖水解酶(C1酶)、內(nèi)切β-1,4葡聚糖水解酶(Cx酶)和β-葡萄糖苷酶(Cb酶)構成[4，5]。C1酶主要作用于纖維素線狀分子末端，為Cx酶和Cb酶創(chuàng)造酶切位點；Cx酶隨機水解纖維素內(nèi)部的非結晶區(qū)；Cb酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子[6]，這樣纖維素的整個降解過程就完成了[4]。作為復雜的多酶復合體，纖維素酶的酶解過程呈多相的復雜性。因此，對纖維素酶的認識不應僅僅著眼于酶活力值的高低，還須結合其酶系種類和比例搭配[4]。

劉云云等[7]采用響應面法對里氏木霉和斜臥青霉固態(tài)混合發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件下發(fā)酵3d濾紙酶活達到峰值101.825FPU·g-1。周廣麟等[8]發(fā)現(xiàn)食用菌香菇和酵母菌混合發(fā)酵葡萄渣和麩皮生產(chǎn)纖維素酶，表明香菇可分泌纖維素酶，且可與酵母共生。蔡晶晶等[9]發(fā)現(xiàn)白腐菌、黑曲霉和絮凝酵母三菌混合發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵稻草粉產(chǎn)纖維素酶的酶活力明顯高于白腐菌和黑曲霉雙菌混合培養(yǎng)，且Cx酶和Cb酶酶活比白腐菌和黑曲霉兩者發(fā)酵產(chǎn)酶分別提高了68.2%和143.3%。Thomas等[10]研究了尖孢鐮孢和啤酒酵母共培養(yǎng)的同步糖化發(fā)酵小麥秸稈生產(chǎn)乙醇，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌的酶系統(tǒng)對底物水解影響顯著，乙醇終濃度為58g·L-1，比啤酒酵母單獨發(fā)酵產(chǎn)乙醇提高了19%。

因為里氏木霉是目前產(chǎn)纖維素酶能力最強，活力最高的微生物[4]，在生產(chǎn)纖維素酶方面有穩(wěn)定性好、產(chǎn)酶效率高、生長環(huán)境粗放和纖維素酶的各組分結構較為合理等諸多優(yōu)點[11]。黑曲霉相比木霉，安全無毒且Cb酶糖化能力較強以及分泌的胞外纖維素酶便于提純[12，13]。另外目前研究主要集中在不同微生物的相互混合及其基因水平的研究，對組分酶活的搭配比例及其變化研究較少。本文從經(jīng)典組合里氏木霉和黑曲霉的混合入手，以3種纖維素酶組分酶活(內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活、β-葡聚糖酶活)和濾紙酶活為指標，分析了混合菌系對不同纖維素酶活力的影響，為兩單菌株的生長關系及纖維素酶系的研究提供參考，從而為高效降解纖維素的微生物聯(lián)合共培養(yǎng)提供理論依據(jù)，對秸稈降解與轉化具有現(xiàn)實意義。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗試劑

DNS溶液：稱取3.15g的3，5-二硝基水楊酸，加蒸餾水500mL。攪拌5s，水浴至45 ℃。然后逐步加入100mL0.2g·mL-1的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌。直至溶液清澈透明(在加入NaOH溶液過程中，保持溫度不超過48 ℃)。繼續(xù)45 ℃水浴加熱，逐步加入91.0g四水酒石酸鉀鈉、2.50g苯酚和2.50g無水亞硫酸鈉。同時補加水300mL，不斷攪拌，直至加入的物質(zhì)完全溶解，停止加熱。冷卻至室溫后，定容至1 000mL。用燒結玻璃過濾器過濾。濾液儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d后使用，有效期6個月。

pH4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：參考文獻[14]。

1%羧甲基纖維素懸浮液：1g羧甲基纖維素溶于100mLpH4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中。相同的方法配制1%微晶纖維素懸浮液和1%水楊苷懸浮液。

1.1.2試驗菌株

里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Aspergillus nige)均由山西農(nóng)業(yè)大學生物工程實驗室保藏。

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基：參考文獻[15]。

液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(產(chǎn)酶培養(yǎng)基)：麩皮1%，玉米芯4%，蛋白胨0.3%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.4%，氯化鈣0.03%，酵母膏0.05%，硫酸鎂0.03%，吐溫-80 0.02%，加熱使各成分溶解，自然pH。250mL三角瓶分裝，121 ℃滅菌20min。

1.2試驗方法

1.2.1孢子懸浮液的制備

從里氏木霉或黑曲霉的試管斜面上刮取孢子于帶玻璃珠的生理鹽水中。在30 ℃，200r·min-1搖床中振蕩分散孢子1.5～2h，用血球計數(shù)板測定孢子濃度，達10-6～10-7個·mL-1。

1.2.2試驗設計

先分別吸取8mL里氏木霉和黑曲霉的孢子懸浮液接入各自產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在30 ℃ 140r·min-1的搖床培養(yǎng)，以滅活的酶液為對照組，原酶液為處理組，分別測定10d內(nèi)上述4種酶活的變化。以8mL為總接種量，兩者比例1∶1混合發(fā)酵，再按上述方法測定10d內(nèi)四種酶活變化。進而分析里氏木霉和黑曲霉的單菌株與混合菌系對纖維素酶活的影響。

1.3試驗指標

1.3.1葡萄糖標準曲線的建立

無水葡萄糖在105℃下烘干至恒重，配成1.0mmol·L-1的葡萄糖標準溶液，分別取此標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于刻度試管中，補水至2.0mL，加入4.0mLDNS溶液，具塞沸水浴5min后，立即冷卻，終止反應，定容至25mL。溶液搖勻后在499nm處測定吸光值(OD值)，每管重復3次，結果取平均值。以吸光值為縱坐標，葡萄糖毫摩爾數(shù)為橫坐標繪制曲線圖并建立回歸方程。

1.3.2纖維素酶活力的測定[16，17]

內(nèi)切葡聚糖酶活的測定：用移液槍分別吸取0.5mL澄清酶液和1.0mL1%(w/v)羧甲基纖維素懸浮液，加入25mL具塞比色管，50 ℃水浴保溫30min，取出后立刻加入4mLDNS溶液，緊接著沸水浴5min，立即冷卻后用蒸餾水定容至 25mL搖勻，在499nm處測定其吸光度值，根據(jù)葡萄糖標準方程求得反應生成的葡萄糖，再計算出內(nèi)切葡聚糖酶酶活。

外切葡聚糖酶活的測定：將內(nèi)切葡聚糖酶活測定中1.0mL羧甲基纖維素懸浮液換成微晶纖維素懸浮液，其他與內(nèi)切葡聚糖酶活的測定一致。

β-葡萄糖苷酶活力的測定：將內(nèi)切葡聚糖酶活測定中1.0mL羧甲基纖維素懸浮液換成水楊苷懸浮液，其他與內(nèi)切葡聚糖酶活的測定一致。

因其聚合度和結晶度適中且能反應三類酶的協(xié)同作用，所以以濾紙為底物經(jīng)纖維素酶系水解生成的還原糖量來表征纖維素酶系總糖化力的方法稱為濾紙酶活[18，19]。濾紙酶活的測定：將內(nèi)切葡聚糖酶活測定中1.0mL1%(w/v)羧甲基纖維素懸浮液換成1.0mLpH4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液并加入1cm×6cm的濾紙條，其他與內(nèi)切葡聚糖酶活的測定一致。

1.4數(shù)據(jù)處理

1.4.1數(shù)據(jù)計算

酶活定義：在一定pH和溫度下，1mL底物溶液中1min產(chǎn)生1μg還原糖所需要的酶量即一個酶活單位，簡稱為U·mL-1[18，20，21]。

1.4.2數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin70處理。

2結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線結果

由1.3.1建立葡萄糖標準曲線，如圖1，得回歸方程：Y=1.037 7X-0.062 5，相關系數(shù)R2=0.992 1。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　Standard curve of glucose

2.2內(nèi)切葡聚糖酶活的比較

由圖2可以看出，黑曲霉的內(nèi)切葡聚糖酶活力起點較低，但增長速率相對較緩慢，在第7d達到峰值29.026U·mL-1；而里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶活起點較高，但增長也較平緩，在第5d達到峰值為25.046U·mL-1；相對兩單菌株而言，兩者的混合菌系在第1d的內(nèi)切酶活最低，在前7d按較高的速率穩(wěn)定增長，直至峰值26.568U·mL-1，此值介于兩單菌株的峰值之間。

圖2　內(nèi)切葡聚糖酶活的比較Fig.2　The comparison of endoglucanase activity

2.3外切葡聚糖酶活的比較

由圖3可以看出，里氏木霉的外切葡聚糖酶活顯著高于黑曲霉和兩者混合菌系，而黑曲霉的在10d內(nèi)整體較低且無明顯的變化，而混合菌系的外切葡聚糖酶活先增加后降低而后二次增加，可能因為在前期兩者相互適應，后期才能發(fā)揮兩者的協(xié)同作用。

圖3　外切葡聚糖酶活的比較Fig.3　The comparison of exoglucanase activity

圖4　β-葡萄糖苷酶活力的比較Fig.4　The comparison of β-glucosidase activity

2.4β-葡萄糖苷酶活力的比較

在降解纖維素的微生物中，曲霉的主要作用是分泌β-葡萄糖苷酶，從圖4中可以驗證這一點，黑曲霉的β-葡萄糖苷酶處于較高水平，里氏木霉在這一方面作用不明顯，兩者的混合菌系介于兩者之間且基本和黑曲霉的趨勢貼合。

2.5濾紙酶活的比較

由圖5可以看出，在10d內(nèi)，里氏木霉的濾紙酶活先升高后降低且在第5d出現(xiàn)峰值；黑曲霉的濾紙酶活一直以緩慢的速度增加，在最后趨于平緩；而兩者的混合菌系濾紙酶活的變化趨勢是先升高后降低再升高，第一次的峰值是在第5d出現(xiàn)，且在第二次的增長過程中以較高的速率增長，其變化原因可能是在前6d，兩種霉菌處于適應階段，從第6d起，兩者協(xié)同降解濾紙。

另外，在第8d前，混合菌系的濾紙酶活高于黑曲霉，低于里氏木霉，但從第8d起，混合菌系的濾紙酶活顯著高于里氏木霉，且高于里氏木霉的峰值，所以兩株霉菌的混合比單菌株的降解效果好。

圖5　濾紙酶活的比較Fig.5　The comparison of filter paper activity

3結論與討論

4種纖維素酶活力呈先增長后降低的趨勢，是因為前期在纖維素分解菌分泌的胞外纖維素酶的作用下，纖維素分解成的還原糖不斷累積的結果，但在后期，因為營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，微生物開始利用還原糖為碳源，致使體系中還原糖降低。

在里氏木霉和黑曲霉混合菌系的共發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶研究中，混合菌系的3種組分酶活(內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活以及β-葡萄糖苷酶活)的變化趨勢不盡相同，但都介于兩單菌株的活力之間，而表征纖維素酶系總糖化能力的濾紙酶活雖然在前8d也介于兩者之間，但在第二次增長過程中以較高的速率增長，在第9d超過單菌株的酶活，還有繼續(xù)增長的潛力。說明混合菌系(黑曲霉和里氏木霉)協(xié)同互助，促進產(chǎn)酶，雖然單一組分的酶活力不同程度低于單菌株，但纖維素酶系的總酶活力是提高的。

本文結果為研究產(chǎn)纖維素酶微生物混合發(fā)酵玉米秸稈中的生長關系和優(yōu)化纖維素酶酶系種類和比例提供實驗基礎，但只對霉菌中的黑曲霉和里氏木霉進行了研究，進一步研究可以對細菌、放線菌以及霉菌進行混合研究，從而更廣泛研究產(chǎn)纖維素酶混合菌系。

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(編輯：馬榮博)

Theinfluenceofmixedmicrobetocellulaseactivity

HaoJianyu,HouHongping*，ZhengYuanjie

(College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:[Objective]In this paper,we mixed Aspergillus niger and Trichoderma reesei together,aimed at providing reference for the coexist of microbial species and the optimization of cellulase proportion .[Methods]Based on the total amount of inoculation 8 mL,we put Trichoderma reesei, Aspergillus niger, and mixed strains in 1∶1 into enzyme production medium respectively,then determined three-component cellulase activity and filter paper activity in the following ten days to analysis growth relationship of microbe and the proportion of components cellulase activity. [Results]It suggested that mixed strains’ endoglucanase,exogluconase and β-glucosidase activity meet the peak in 7 d,4 d and 5 d respectively. After that,exogluconase and β-glucosidase activity rose again.Nevertheless,the three components were lower than single strain in some degree, while the total activity of filter paper enzyme activity was higher than single strain.[Conclusion]In summary, the different proportions of the three components cellulase activity determine the complete cellulase system or not, which determines the degree of cellulose degradation.

Key words:Trichoderma reesei; Aspergillus nige; Cellulose enzyme activity

收稿日期：2016-03-10 修回日期：2016-04-12

作者簡介：郝建宇(1990-)，女(漢)，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程 *通訊作者：侯紅萍，教授，碩士生導師。Tel:15934425958；E-mail：sphhping@126.com

基金項目：山西省科技攻關項目(20140311019-2)

中圖分類號：Q93-335

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)07-0510-04