基于熒光檢測的糜子Genic-SSR PCR體系優(yōu)化

李耀深，曹鑫，段明，王俊杰，張彬，李紅英，侯思宇,2，韓淵懷,2,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷，030801； 2.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太谷，030801;3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原，030031)

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基于熒光檢測的糜子Genic-SSR PCR體系優(yōu)化

李耀深1，曹鑫1，段明1，王俊杰1，張彬1，李紅英1，侯思宇1,2，韓淵懷1,2,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷，030801； 2.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太谷，030801;3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原，030031)

摘要：[目的]本研究基于Fragment Analyzer全自動毛細管電泳熒光檢測系統(tǒng)，以期建立一個最優(yōu)的糜子Genic-SSR分子標記PCR反應(yīng)體系。[方法]試驗采用L16(44)正交設(shè)計，設(shè)計了Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的不同濃度組合，并用Pragment Analyzer全自動毛細管電泳熒光檢測系統(tǒng)檢測PCR產(chǎn)物。[結(jié)果]Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物濃度對PCR反應(yīng)效應(yīng)為：Mg2+>引物> dNTPs > Taq DNA聚合酶。通過正交實驗設(shè)計確立了糜子Genic-SSR熒光 PCR檢測體系的最佳反應(yīng)組分：20μL的反應(yīng)體系中包含0.2 mmol·L-1的dNTPs，0.2μmol·L-1引物，1.5 mmol·L-1的Mg2+和0.5 U的Taq DNA聚合酶。[結(jié)論]本研究建立了糜子的Genic-SSR分子標記的最佳熒光PCR反應(yīng)體系，為糜子種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中分子標記開發(fā)、驗證和輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：糜子； Genic-SSR； 體系優(yōu)化； 正交試驗設(shè)計

糜子(Panicum miliaceumL.)是一年生禾本科黍?qū)僮魑铮耖g又稱黍、稷和糜，主要種植在干旱半干旱的山區(qū)，生育期短。糜子是我國主要米類作物之一，其脫殼之后稱為黃米[1]。黃米脂肪含量3.6%左右，蛋白質(zhì)含量12%左右，必需氨基酸構(gòu)成比例比較平衡，是很好的輔助食物[2]。同時，黃米蛋白對小鼠的動脈粥樣硬化和肝損傷有預(yù)防作用[3，4]。糜子籽粒中富含食用纖維，此外還含有多種維生素，如維生素E、維生素B6、B1、B2、β-胡蘿卜素等和豐富的多種礦物質(zhì)元素，如鈣、鎂、磷、鐵及鋅等[5]。在當前食物多樣化的需求下，糜子豐富的營養(yǎng)價值吸引了俄羅斯、印度、中國和美國等國家的科學家和市場的廣泛關(guān)注。盡管已有一些分子標記已用于相關(guān)雜糧作物的遺傳種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性以及遺傳圖譜構(gòu)建，但是糜子的分子標記開發(fā)仍然嚴重滯后。目前，中國收集在冊的糜子品種資源已超8 500份[6]，對這些品種的遺傳多樣性研究主要是通過表型鑒定[7～9]，現(xiàn)今已不能滿足實踐需求。

近年來，快速增長的EST數(shù)據(jù)已成為SSR的重要來源，狗牙根、刺槐、菊花、光皮樺、荔枝、大白菜、蘿卜、馬鈴薯等多種植物都開展了EST-SSR標記的開發(fā)與利用[10～17]。Genic-SSR標記是一種基于EST或者RNA序列的標記系統(tǒng)，其原理依托測序技術(shù)，即EST文庫測序或目前較為先進的高通量RNA-Seq技術(shù)獲得的植物、動物或微生物的mRNA拼接序列而開發(fā)的SSR標記。EST-SSR標記大多重復(fù)基序位于基因編碼區(qū)5’端和3’端的非翻譯區(qū)，重復(fù)序列的缺失和插入都可直接引起基因表達和功能的改變，可直接鑒定重要生物表型性狀所關(guān)聯(lián)的等位基因[18]；而RNA-seq獲得的編碼序列較EST更長(EST序列大多為3’端和5’端序列)；基因注釋更為準確。糜子屬于小雜糧作物，其關(guān)注程度相比主栽作物低，基因序列公開報道較少，在一定程度上制約了糜子分子標記的開發(fā)與利用。精確的Genic-SSR標記具有信息量大、通用性好的特點，更易分辨出不同基因型之間的親緣關(guān)系以及篩選關(guān)聯(lián)生物性狀的功能基因[19]。本文基于RNA-seq技術(shù)，開發(fā)相關(guān)的Genic-SSR標記，除具有本身SSR標記優(yōu)點外，還具有高通量引物開發(fā)、物種特異性強、條帶分辨率高等優(yōu)點[20]，不僅能從分子水平劃分糜子的群體結(jié)構(gòu)，分析遺傳多樣性，而且可以直接發(fā)掘功能標記基因，用于分子輔助選擇(Marker-assistedselection，MAS)和雜交育種[11]。但Genic-SSR分子標記技術(shù)也是基于PCR擴增技術(shù)，其受到PCR反應(yīng)各種因素的影響，因此本試驗采用L16(44)正交設(shè)計，設(shè)置了不同濃度的TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物作為影響糜子Genic-SSR分子標記PCR反應(yīng)中的4個主要因素篩選優(yōu)化組合。通過分析TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物濃度對PCR反應(yīng)的效應(yīng)，篩選出糜子Genic-SSR標記的最佳PCR反應(yīng)體系。

目前SSR分子標記擴增條帶的分析方法主要是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，但其分辨率較毛細管電泳低，費時費力。本文采用了FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳系統(tǒng)進行糜子Genic-SSR位點檢測，該系統(tǒng)基于熒光檢測技術(shù)和毛細管電泳技術(shù)發(fā)展而來的新型DNA/RNA片段分離儀器，它采用敏感的嵌入染料以及強大的LED光源，避免了傳統(tǒng)方法中對熒光標記引物的依賴，電驅(qū)動原理對dsDNA片段和RNA樣品進行分離并定性和定量檢測，分辨率高、運行速度快，具備高通量檢測優(yōu)勢，大大減少分析所需時間[11]。為應(yīng)用全自動毛細管電泳結(jié)合Genic-SSR標記技術(shù)研究糜子遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1試驗材料和方法

1.1試驗材料

試驗選用的糜子品種為“雁黍7號”，取生長18天的幼嫩葉片提取DNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNF-900-K0500試劑盒購自AATI公司。DL500DNAMarker，Mg2+，dNTPs，TaqDNA聚合酶及其他常規(guī)試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取

糜子葉片總DNA的提取采用CTAB法，并經(jīng)去RNA，去蛋白處理。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量的完整性。經(jīng)過檢測DNA的OD值為1.91，DNA可用于Genic-SSR反應(yīng)。

1.2.2正交試驗的設(shè)計

試驗采用L16(44)正交設(shè)計表[15]，重復(fù)3次，對影響PCR擴增反應(yīng)的Mg2+濃度，引物濃度，dNTPs和TaqDNA聚合酶濃度4個因素進行了4個水平的正交試驗設(shè)計(表1)，模板DNA濃度為50mg·L-1。

1.2.3PCR擴增程序

該反應(yīng)采用遞減PCR擴增技術(shù)，反應(yīng)體系為20μL，程序如下：

94 ℃預(yù)變性5min

表1糜子Genic-SSR分子標記PCR正交試驗設(shè)計表

Table1BroomcornmilletGenic-SSRmarkersPCRorthogonalexperimentaldesign

處理TreatmentsTaq酶/UTaqDNApolymeraseMg2+/mmol·L-1引物濃度/μmol·L-1PrimerConcentrationdNTPs/mmol·L-1A10.51.50.20.2A21.02.00.20.2A31.52.50.20.2A42.03.00.20.2A51.52.00.40.4A62.01.50.40.4A70.53.00.40.4A81.02.50.40.4A92.02.50.60.6A101.53.00.60.6A111.01.50.60.6A120.52.00.60.6A131.03.00.80.8A140.52.50.80.8A152.02.00.80.8A161.51.50.80.8

循環(huán)完成后72 ℃延伸5min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物首先在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，然后用FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳檢測。

1.2.4FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳檢測

將PCR產(chǎn)物按AATI公司生產(chǎn)的DNF-900-K0500試劑盒步驟說明加入到樣品槽中，按標準操作程序運行FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳檢測儀，分析結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗PCR擴增結(jié)果分析

正交設(shè)計瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，可以看出，以100ng·μL-1模板進行PCR擴增，各個反應(yīng)體系均可以擴增出目標條帶。

圖1　“雁黍7號”Genic-SSR分子標記PCR反應(yīng)體系優(yōu)化擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1　Electrophoresis detection by agarose gel of the PCR products from the Genic-SSR optimization in “Yanshu 7”

其中A3、A4和A13擴增條帶不清晰，無有效PCR產(chǎn)物可供檢測；A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A14、A15、A16均有清晰明顯的擴增條帶，但是非特異性擴增條帶較多，干擾了有效擴增條帶的統(tǒng)計。而A1、A2條帶都比較清晰，無非特異性擴增，且A1相較于A2特異性更強，因此在該反應(yīng)體系下擴增結(jié)果較為可靠，可作為后續(xù)大規(guī)模擴增反應(yīng)體系。

2.2FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳檢測結(jié)果分析

FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳結(jié)果如圖2所示，可以觀察出各反應(yīng)體系擴增產(chǎn)物條帶深淺不同。本次研究主要篩選200～300bp的目標產(chǎn)物，可以發(fā)現(xiàn)A2、A3、A5、A7、A9、A11、A12、A13、A15、A16條帶顏色較淺，說明PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物濃度比較低；A4、A6、A8、A10、A14條帶顏色比較深，但是雜帶比較多；A1條帶顏色深并且目標區(qū)域特異性較高。

2.3PCR試驗結(jié)果直觀分析

在16個組合中，3個處理組合(A3、A4、A13)幾乎沒有擴增條帶，其他組合均有明顯擴增條帶，其中處理A1、A6、A7目標條帶清晰，背景色相對較少，且條帶內(nèi)多態(tài)性較好。據(jù)此參考何正文等[22]和穆立薔等[23]的方法，進行三次獨立打分，得分依次如下：16、15、6、9、7、14、13、12、2、3、8、11、4、1、5、10；16、10、5、7、8、15、14、13、3、4、11、12、1、2、6、9；16、7、4、9、11、15、14、10、1、2、8、13、3、6、5、12；將三次處理得分取平均數(shù)，根據(jù)平均得分情況進行直觀分析和方差分析。本次試驗首先根據(jù)結(jié)果得分研究各個因素在各個水平的均值Ki，依值反映各個因素對反應(yīng)的影響，最后求出各個因素在各個水平的極值差R (R=Kmax-Kmin，Kmax為單個試驗因素中的最大Ki，Kmin為單個試驗因素中最小的Ki)，R越大，說明該因素對于試驗影響越大[21]。由表2可以發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度的R值為5.57，說明該因子對試驗結(jié)果影響最大；TaqDNA聚合酶R值為5.3，其影響最小。各個水平對于糜子Genic-SSRPCR反應(yīng)影響依次為Mg2+>引物濃度>TaqDNA聚合酶=dNTPs濃度。

圖2　糜子Genic-SSR分子標記PCR反應(yīng)體系優(yōu)化擴增產(chǎn)物毛細管電泳圖Fig.2　Capillary electrophoresis of optimization PCR products by Genic-SSR markers in broomcorn millet

2.4Genic-SSR PCR反應(yīng)正交設(shè)計方差分析

本研究利用正交設(shè)計助手軟件對結(jié)果進行方差分析(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物濃度對試驗結(jié)果影響高于dNTPs的影響，而Mg2+對試驗結(jié)果影響最大。其他因素影響的主次也與直觀分析基本一致的影響，表明試驗結(jié)果誤差較小，其結(jié)果可信。

2.5Mg2+濃度對PCR產(chǎn)物毛細管電泳的影響

經(jīng)上述分析，Mg2+對試驗結(jié)果影響最大，從毛細管電泳的RFU值圖上也可反應(yīng)出此點。不同濃度的Mg2+反應(yīng)體系對PCR產(chǎn)物毛細管電泳的相對熒光強度(RFU)如圖3所示。RFU越大，表明目標擴增產(chǎn)物濃度越大；RFU峰值(相對熒光強度)越多，說明不同濃度的DNA片段越多。圖3中各條帶A1、A6、A11、A16分別代表1.5mmol·L-1、2mmol·L-1、2.5mmol·L-1、3mmol·L-1Mg2+濃度對應(yīng)各個反應(yīng)體系的RFU及目標產(chǎn)物隨時間變化圖，可知1.5mmol·L-1Mg2+對應(yīng)條帶目標產(chǎn)物RFU(目標擴增產(chǎn)物濃度)最大，且波峰(不同濃度目標產(chǎn)物)最少；2mmol·L-1Mg2+的條帶RFU有所降低，且雜帶有所增加；3mmol·L-1Mg2+的條帶RFU最小，且波峰較多，即雜帶較多。因此得出1.5mmol·L-1Mg2+為最佳反應(yīng)體系。

表2糜子Genic-SSR分子標記PCR正交試驗直觀分析表

Table2TableofBroomcornmilletGenic-SSRmarkersPCRorthogonalexperimentalvisualanalysis

統(tǒng)計因子StatisticsfactorTaq酶/UTaqDNApolymeraseMg2+/mmol·L-1引物濃度/μmol·L-1PrimerConcentrationdNTPs/mmol·L-1T145504040T234.136.748.848.8T332222626T430.327.721.621.6K113.0112.51010K28.539.1812.212.2K385.56.56.5K47.586.936.96.9R5.435.575.35.3

注：Ti為任一列上水平號為i(本試驗中i=1,2,3,4)時,所對應(yīng)的試驗之和;Ki為任一列上因素取水平i時所得試驗結(jié)果之和;Ki=Ti/s,s為任一列上各水平出現(xiàn)的次數(shù);R是極差

Note:Ti(i=1, 2,3,4inthisexperiment)isanyofacolumnsaretakenastheresultsofsumtothecorrespondingtest.Kiisthesumofthetestresultsobtainedwheniistakenasafactorinanyofacolumn.Ki=Ti/s,sforthenumberofappearstimesineverylevelforanyofacolumn.

表3糜子Genic-SSRPCR反應(yīng)正交設(shè)計方差分析表

Table3TheorthogonaldesignanalysisofvariancetableofBroomcornmilletGenic-SSRPCRreaction

因素Factor偏差平方和Sumofsquare自由度DegreeoffreedomF值FValueF臨界值Fcritical-value引物濃度109.1930.8169.280dNTPs24.0830.1669.280Mg2+111.7430.7729.280Taq酶45.9230.3179.280誤差144.773

圖3　不同濃度Mg2+的PCR擴增產(chǎn)物RFU隨時間變化圖Fig.3　Changes of PCR amplification products (RFU) with time in different concentration of Mg2+ 　　注：A1、A6、A11、A16分別代表1.5 mmol·L-1、2 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、3 mmol·L-1 Mg2+濃度對應(yīng)各個反應(yīng)體系的RFU(縱軸)及目標產(chǎn)物隨時間變化(橫軸)Note: A1, A6, A11, A16 respectively represent 1.5 mmol·L-1， 2 mmol·L-1, 2.5 mmol·L-1 and 3 mmol·L-1 Mg2+ concentration corresponding to each of the reaction system of the target product for RFU (vertical axis) change with time (x-axis)

3討論

目前，SSR體系優(yōu)化試驗主要采用單因素試驗、完全試驗或正交試驗。完全隨機試驗由于試驗組合較大，工作量大、費時費力而多選用單因素和正交試驗。單因素試驗的一種組分發(fā)生變化，其他組分的濃度往往靠經(jīng)驗來確定，忽略各種組分的相互影響，難以確定最佳組合。而正交設(shè)計是利用一套規(guī)格化的正交表將各個因素、各個水平之間組合均勻搭配、合理安排，大大減少試驗次數(shù)，并提供較多的信息，是研究多因素、各個水平之間組合均勻搭配、合理安排，大大減少試驗次數(shù)，并提供較多的信息，可以又快又好的篩選最優(yōu)組合。

本試驗采用了FragmentAnalyzer全自動毛細管電泳檢測，目前大部分SSR分子標記試驗的擴增條帶的分析方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，但其工作量大，相較于毛細管電泳分辨率低，所需時間較長。毛細管電泳操作簡單、工作量少、并且精確度較高、效率高。毛細管檢測可以通過熒光相應(yīng)強度與目標產(chǎn)物在毛細管電泳中與時間的關(guān)系反映目標產(chǎn)物片段的大小以及目標產(chǎn)物濃度的大小。全自動毛細管電泳基于熒光檢測系統(tǒng)，RFU(相對熒光強度越大)，表明PCR目標產(chǎn)物濃度越大；波峰越多，表明不同大小的目標產(chǎn)物越多。通過圖三可以看出，隨著Mg2+濃度增大，目標產(chǎn)物的RFU(熒光響應(yīng)強度)越來越小，表明目標產(chǎn)物濃度越來越?。浑S著時間邊長，波峰逐漸增多，非目標產(chǎn)物片段變多。

試驗采用試驗室設(shè)計的Genic-SSR引物，通過正交設(shè)計對糜子Genic-SSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，得到糜子Genic-SSR最佳PCR反應(yīng)體系：20μL的反應(yīng)體系中有1.5mmol·L-1Mg2+、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2μMSSR引物和0.2mmol·L-1dNTPs。經(jīng)過試驗驗證該反應(yīng)體系可以獲得清晰的多態(tài)性條帶，為今后糜子Genic-SSR反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

根據(jù)正交設(shè)計直觀分析和方差分析以及RFU隨時間的變化可以看出影響反應(yīng)的4個因素對于試驗結(jié)果的影響有相輔相成的作用，但試驗結(jié)果表明各個因素有主次之分，各個因素對于糜子Genic-SSRPCR反應(yīng)影響結(jié)果如下：Mg2+>引物濃度>dNTPs>TaqDNA聚合酶。Mg2+通過影響引物與模板的結(jié)合效率、產(chǎn)物特異性及引物二聚體的形成，繼而成為影響PCR產(chǎn)量和擴增特異性的最重要因素。此外，引物濃度作為影響PCR反應(yīng)的另一個重要因素，濃度過高容易發(fā)生非特異性擴增，使得引物二聚體含量增加且還易引起堿基錯配。引物濃度過低，則易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象并導(dǎo)致擴增產(chǎn)量下降[19]。在本次試驗中模板DNA濃度為100mg·L-1的固定濃度，對于PCR擴增的穩(wěn)定性幾乎無影響。DNA純度對于Genic-SSR分子標記PCR擴增有較大的影響，本次試驗采用的DNA經(jīng)去RNA、去蛋白處理，純度較高(OD值為1.91)有效的提高了瓊脂糖凝膠和毛細管電泳的效果。

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(編輯：邢國芳)

TheoptimizationofPCRreactionsystemforGenic-SSRanalysisinbroomcornmillet

LiYaoshen1,CaoXin1,DuanMing1,WangJunjie1,ZhangBin1,LiHongying1,HouSiyu1,2,HanYuanhuai1,2,3*

(1．College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2.Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops，Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 3．Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, China)

Abstract:[Objective] The fluorescent PCR reaction system for Genic-SSR analysis was optimized by using the Fragment Analyzer Automatic Capillary Electrophoresis detection system in broomcorn millet. [Methods]Optimization was based on L16 (44) orthogonal design, with different concentrations of Taq DNA Polymerase, Mg2+, dNTPs and primers. [Results] The order of the effects for the system was: Mg2+>primer>dNTPs>Taq DNA Polymerase. Through the orthogonal experimental design, a 20 μL reaction system was established, which contained a 0.2 mol·L-1dNTPs, 0.2 μmmol·L-1SSR primer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, and 0.5 U Taq DNA Polymerase. [Conclusion]This optimal PCR reaction system could be used for genetic clustering analysis of germplasm with Genic-SSR markers and for further development of molecular markers for marker-assisted breeding in broomcorn millet.

Key words:Broomcorn millet； Genic-SSR； PCR reaction system； Orthogonal design

收稿日期：2016-01-29 修回日期：2016-03-22

作者簡介：李耀深(1991-)，男(漢)，廣西貴港人，碩士研究生，研究方向：糜子遺傳多樣性 *通訊作者：韓淵懷，教授，博士生導(dǎo)師。Tel:03546287239；E-mail：swgctd@163.com

基金項目：山西農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新育種基金 (2013-2016)；山西特色植物基因資源開發(fā)與利用平臺項目(2012091004-0103)

中圖分類號：S516

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)07-0477-06