生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物分析檢測方法研究進展

吳姬娜，劉石磊，楊旸，周世坤，劉景全

（國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室防化研究院，北京 102205）

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生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物分析檢測方法研究進展

吳姬娜，劉石磊，楊旸，周世坤，劉景全

（國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室防化研究院，北京 102205）

摘要綜述生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物分析方法的研究現(xiàn)狀，主要總結(jié)了路易氏劑染毒生物醫(yī)學(xué)樣品中標志物、樣品制備和儀器分析方法的研究進展。路易氏劑染毒生物標志物主要包括游離和加合代謝產(chǎn)物兩種，分析過程主要是對選定的生物標志物進行巰基化衍生和富集純化，之后采用氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜等儀器對目標物進行檢測鑒定。

關(guān)鍵詞路易氏劑；生物醫(yī)學(xué)樣品；生物標志物；富集純化；分析

路易氏劑是已知現(xiàn)代化學(xué)武器中唯一的含砷糜爛性毒劑［1］。武器級路易氏劑主要由路易氏劑1 （L1）、路易氏劑2 （L2）、路易氏劑3 （L3）3種成分組成，其中L1含量占90%以上［2］。在1997年生效的《禁止化學(xué)武器公約》中，將L1，L2，L3一并列入有毒化學(xué)品清單中，成為國際禁止化學(xué)武器組織核查的重要監(jiān)控對象［3］。

路易氏劑染毒后會立刻造成疼痛，同時具有嚴重的全身性毒性［4］。路易氏劑的毒性作用機理主要在于對酶活性的抑制。人體內(nèi)有20多種酶的活性依賴于巰基基團，而路易氏劑會與巰基直接結(jié)合并導(dǎo)致其失去活性，進而影響酶的活性，對人的生理機能造成影響［2，5］。路易氏劑染毒后，在生物醫(yī)學(xué)樣品中主要形成游離和加合代謝產(chǎn)物。其中游離代謝產(chǎn)物氯乙烯基亞胂酸（CVAA）、氯乙烯基胂酸（CVAOA）分別由L1經(jīng)水解和繼續(xù)氧化形成，加合代謝產(chǎn)物是路易氏劑的含砷基團（-AsCl2）與巰基（-SH）發(fā)生強相互作用形成。

路易氏劑自研制成功之日起，便作為化學(xué)戰(zhàn)劑被發(fā)展并生產(chǎn)。各國仍未徹底銷毀的武器儲存以及日本遺留在我國的化學(xué)彈藥對于進行化學(xué)戰(zhàn)劑儲存、運輸、銷毀等涉毒工作人員及人民群眾來說是不可忽視的潛在威脅［6-7］。不僅如此，路易氏劑還有可能成為恐怖分子進行恐怖襲擊的新手段［8］，對公共安全構(gòu)成威脅。因此各國對于路易氏劑的相關(guān)研究一直在持續(xù)進行，研究內(nèi)容涉及毒理探索、毒劑銷毀、臨床解毒、染毒洗消和涉毒防護等方面，而分析方法作為一種重要技術(shù)支撐也備受重視。筆者對染毒生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物的分析方法進行綜述，重點總結(jié)染毒標志物、樣品制備和儀器分析方法的研究進展。

1 路易氏劑染毒的生物標志物

對生物醫(yī)學(xué)樣品中化學(xué)戰(zhàn)劑的代謝產(chǎn)物進行分析，可為毒劑暴露染毒提供定性和定量的證據(jù)。作為毒劑暴露染毒的明確標志物，需要滿足特異性強、半衰期長、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、非化武來源等要求，旨在實現(xiàn)染毒后中長期準確溯源性分析檢測［9-10］。

路易氏劑初期的分析檢測主要以砷元素為標志物，使用電感耦合等離子體光譜（ICP）、原子吸收光譜（AAS）等選擇性檢測器檢測As的存在，進而證明路易氏劑的暴露染毒［11］。但是由于未染毒的樣品中可能具有一定強度的As信號，同時生物醫(yī)學(xué)樣品中含有的氯與氬氣會形成ArCl+（m/z 75）從而干擾As+（m/z 75）的檢測［12］，因此需要找尋能夠更加清晰準確地驗證路易氏劑染毒事實的生物標志物。L1在含水基質(zhì)中會快速水解形成CVAA，而CVAA在合適的條件下會繼續(xù)氧化形成CVAOA，三者均可與巰基發(fā)生相互作用。因此人們推測，路易氏劑染毒的生物標志物主要包括游離的L1，CVAA，CVAOA以及與蛋白質(zhì)等大分子形成的加合代謝產(chǎn)物。

游離的L1含量很低，遇水反應(yīng)，故并不適合作為路易氏劑染毒的生物標志物。而CVAA與CVAOA作為L1的水解、氧化產(chǎn)物，較L1而言性質(zhì)更加穩(wěn)定，含量更高，可以成為理想的生物標志物。目前文獻報道已從染毒尿樣中成功檢測出CVAA和CVAOA。關(guān)于CVAA，CVAOA的相對含量，不同研究之間存在一些爭議。由于CVAA，CVAOA均是非揮發(fā)性物質(zhì)，不適宜直接進行氣相色譜（GC）分析，且經(jīng)過具有還原性的巰基化試劑衍生后生成相同的衍生產(chǎn)物，故使用GC通常難以對二者進行區(qū)分。大多使用GC對路易氏劑染毒樣品進行分析的實驗，都選擇CVAA作為標志物［10，13-17］，但不能排除CVAOA經(jīng)過衍生后被同時分析的可能。對于使用液相色譜（LC）的實驗［12，18］，報道中主要檢測到的代謝產(chǎn)物是CVAOA而非CVAA，但無法證明該結(jié)果是代謝造成還是在樣品采集處理過程中氧化造成的。雖然游離代謝產(chǎn)物具有良好的特異性，但半衰期較短，故對加合代謝產(chǎn)物的分析不可忽視。

路易氏劑加合代謝產(chǎn)物主要是由分子中的含砷基團與體內(nèi)含有巰基的半胱氨酸（Cys）、谷胱肽（GSH）以及含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)（Pr）等結(jié)合而成。2000年，F(xiàn)idder等［17］通過同位素標記法證明了生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑與球蛋白加合代謝產(chǎn)物的存在，發(fā)現(xiàn)路易氏劑與球蛋白β-鏈上的Cys-93，Cys-112發(fā)生共價結(jié)合。同時，由于同位素標記染毒的全血樣品放射性大多出現(xiàn)在紅細胞中，猜測應(yīng)是路易氏劑與紅細胞中的谷胱甘肽發(fā)生了結(jié)合。但是，F(xiàn)idder A的實驗中并未發(fā)現(xiàn)路易氏劑與白蛋白的加合代謝產(chǎn)物，未對路易氏劑與谷胱甘肽的加合代謝產(chǎn)物進行檢測，這些方面有待進一步研究。2014年，Naseri等［10］在實驗中證明了CVAA可與半胱氨酸反應(yīng)形成加合物CVAA-Cys，并且驗證了CVAA與Cys加合物結(jié)構(gòu)只有1∶1一種。但實驗中只對CVAA-Cys標樣進行了色譜分析，并未對生物醫(yī)學(xué)樣品中的加合物進行檢測。另外，巰基化試劑可以與路易氏劑的游離代謝產(chǎn)物和加合代謝產(chǎn)物反應(yīng)生成易于分析檢測的同種衍生產(chǎn)物，因此專門檢測大分子加合代謝產(chǎn)物的文獻報道較少。

2 路易氏劑及其代謝產(chǎn)物的衍生方法

分析化學(xué)戰(zhàn)劑代謝產(chǎn)物的過程中，某些目標物由于揮發(fā)性、活性、色譜特征等因素，可能不適于直接進行氣相色譜（GC）分析，通?？梢允褂醚苌椒ǜ纳颇繕宋锏纳V性能［19］。由于L1，L2會與柱涂層或其它親核位點發(fā)生相互作用，同時路易氏劑在GC中響應(yīng)不佳、靈敏度較差，故路易氏劑不適于直接進行GC分析。此外，L1的游離代謝產(chǎn)物CVAA，CVAOA是非揮發(fā)性物質(zhì)，也不適于直接進行GC分析。因此大多文獻中都選擇使用衍生化試劑衍生路易氏劑代謝產(chǎn)物，再以GC為分離手段進行分析。路易氏劑經(jīng)過巰基化試劑衍生后，不僅色譜特征得到改善，還生成含硫衍生產(chǎn)物，可以使用選擇性檢測器進行分析，提高檢測的選擇性和靈敏度［19］。而使用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析路易氏劑時，由于電離效率較低，可以使用巰基吡啶對CVAA進行衍生，提高其靈敏度［20］。

路易氏劑的衍生方法已經(jīng)相對成熟，且可被借鑒并用于路易氏劑代謝產(chǎn)物的衍生過程。不同文獻報道的衍生方法的主要差異在于衍生試劑的選擇，普遍使用的是單巰基和二巰基烴類或醇類，見表1。

表1 常見的巰基化衍生試劑

從衍生試劑的比對選擇實驗中可知，單巰基衍生試劑在實驗過程中可以實現(xiàn)L1，L2的分別檢測，完全區(qū)分二者，故被廣泛用于路易氏劑染毒環(huán)境樣品的研究中，被使用較多的為BT。而二巰基衍生試劑可以將L1，L2，CVAA，CVAOA衍生為同一產(chǎn)物，從而提高路易氏劑分析靈敏度，受到眾多學(xué)者的青睞，其中使用最廣泛的是EDT和PDT。對于具有“路易氏劑特效藥”之稱的BAL，雖然分析靈敏度不及其它衍生試劑，但由于其在臨床診斷和解毒效果評價方面具有特殊的研究價值，也被進行了廣泛的使用和研究。Fidder等［17］還嘗試使用七氟丁基咪唑（HFBI）處理BAL衍生產(chǎn)物，以提高檢測靈敏度，檢測限可達到10 nmol/L （1.5 ng/mL）。但是，HFBI衍生后的產(chǎn)物需要使用氣相色譜-負化學(xué)電離/質(zhì)譜（GC-NCI/MS）進行分析，雖然靈敏度有所提高，但非特異性離子占據(jù)優(yōu)勢，缺少準分子離子，同時樣品中殘留的氟化物對儀器具有較大的損害，故未被廣泛采用。

3 路易氏劑代謝產(chǎn)物的富集純化

除衍生外，目標物的富集純化也是樣品制備的重要環(huán)節(jié)，其目的是盡可能富集純化基質(zhì)中的目標物，得到濃度高、背景干擾小的樣品。在路易氏劑代謝產(chǎn)物的分析檢測研究中，涉及的生物醫(yī)學(xué)樣品基質(zhì)主要包括尿樣和血樣。其中尿樣的分析和獲取比較簡單，故大部分研究者選擇尿樣進行分析。通常采用優(yōu)化的巰基化衍生方法，結(jié)合有效的富集和純化手段，對目標物進行檢測，可以達到理想的檢測限。對血樣進行分析檢測時，樣品富集純化的難度較大，這是由于血樣的組成比尿樣更加復(fù)雜，含有的干擾物，特別是大分子干擾物較多，最終檢測限普遍比尿樣高［13-15］。

傳統(tǒng)的富集純化方法有液-液萃?。↙LE）和固相萃?。⊿PE）兩種，后來相關(guān)領(lǐng)域的工作者們又研究了富集效率更高的液相微萃?。↙PME）和固相微萃?。⊿PME）方法。在對路易氏劑代謝產(chǎn)物進行分析檢測的過程中，4種富集純化方法各有特點，被不同的學(xué)者選擇使用［10，13-14，16，18，21，23，25］。

4 路易氏劑代謝產(chǎn)物的檢測鑒定方法

對路易氏劑的檢測鑒定始于20世紀50年代，起初主要采用化學(xué)分析法，包括傳統(tǒng)的電勢滴定法、汞溴紅試紙法（羥汞基熒光黃鈉鹽試紙法）、偵檢管法、鉬藍比色法、紫外吸收分光光度法等。隨著樣品制備技術(shù)和檢測鑒定方法的改進，檢測限從mg/mL級降至μg/mL級［37-38］。20世紀90年代后，隨著儀器技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸出現(xiàn)的一些準確度和精密度高、操作簡便的現(xiàn)代化儀器分析方法［38］，成為檢測路易氏劑代謝產(chǎn)物的主要方法，主要包括以氣相色譜為分離手段的檢測鑒定方法及以液相色譜為分離手段的檢測鑒定方法。

4.1 氣相色譜法

氣相色譜作為實驗室常用的分離技術(shù)與痕量分析方法具有分離效率高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點，在檢測鑒定路易氏劑代謝產(chǎn)物方面得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)檢測方式的不同，以氣相色譜為分離手段的分析方法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜檢測法（GC-MS）［10，13，20-23，26，30，31］、氣相色譜-火焰光度檢測法（GC-FPD）［24，27-28］、氣相色譜-脈沖火焰光度檢測法（GC-PFPD）［29］、氣相色譜-原子發(fā)射光譜檢測法（GC-AED）［14，32］等。其中GC-MS是使用最廣泛的檢測鑒定方法，大多文獻報道中都選擇使用選擇離子模式（SIM）以提高分析靈敏度［13，16，22，30-31］。在采用氣相色譜電子轟擊電離/質(zhì)譜-選擇離子模式（GC-EI/MS-SIM）進行檢測時，進行定量所選擇的離子主要包括衍生產(chǎn)物的分子離子［M+.］或脫去氯乙烯基得到的離子例如，Wooten J V［16］在實驗中選擇的是［M+.］ （m/z=242）作為CVAA-PDT的定量離子，M.T Naseri［10］也選擇了［M+.］（m/z=228）對CVAA-EDT進行定量，而宋婷婷［15］則在實驗中選擇了）作為CVAA-DMT的定量離子。

對于尿樣或血樣中路易氏劑代謝產(chǎn)物的檢測，巰基化衍生-富集純化-氣質(zhì)分析方案被廣泛采用。自2000年起，先后有4篇文獻報道了對人尿樣體外染毒的分析實驗，均取得了良好的結(jié)果。Fidder等［17］采用的是傳統(tǒng)的BAL衍生、SPE萃取、GC-MS檢測的分析方法，檢測靈敏度可以達到1.5 ng/mL。隨后的研究中，使用更有效的衍生試劑（EDT，PDT，DMT等）和/或新型萃取方法（SPME，LPME等），最低檢測限達到了7.4 pg/mL［16］。由于活體染毒實驗比仿生實驗的分析更加復(fù)雜，難度更高，使用相同方法對鼠（Rat）體內(nèi)染毒后采集的尿樣進行分析檢測，檢測限只能達到0.1 ng/mL［13］。由于血樣的組成比尿樣更加復(fù)雜，含有的干擾物特別是大分子干擾物較多，分析難度大，檢測限較尿樣要高。研究者分別對全血、血漿和紅細胞樣品進行研究，得到的檢測限分別為30 pg/mL［14-15］，1 ng/mL［13］，10 ng/mL［13］。宋婷婷等［14-15］使用相同的方法處理體外染毒的尿樣和血樣，CVAA在血樣中的檢測限（30 ng/mL）是尿樣的2倍。Koryagina 等［13］同樣對染毒尿樣、血漿、紅細胞進行了分析，得到的靈敏度依次降低一個數(shù)量級（LOD尿樣=0.1 ng/mL，LOD血漿=1 ng/mL，LOD紅細胞=10 ng/mL）。

4.2 液相色譜法

由于路易氏劑的特殊化學(xué)性質(zhì)，不衍生很難對其直接進行GC分析，但液相色譜卻可以克服氣相色譜方法的不足，直接對路易氏劑進行測定。Kinoshita等嘗試不采用衍生方法，對生物醫(yī)學(xué)樣品中的路易氏劑代謝產(chǎn)物直接進行分析檢測，檢測限均可達到ng/mL級。Kinoshita等［12］采用高效液相色譜-電感耦合等離子體光譜/質(zhì)譜法（HPLCICP/MS），在實驗中同時分離并檢測包含CVAA，CVAOA在內(nèi)的4種含砷化合物，以［AsO+］（m/z= 91）作為定量離子，得到CVAA的檢測限（以砷計）為0.2 ng/mL，CVAOA檢測限為0.1 ng/mL。Rodin等［18］使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析染毒樣品，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）提高檢測靈敏度，得到CVAA，CVAOA的檢測限分別為0.5，3 ng/mL，對應(yīng)的定量離子對分別為m/z 213，169 和m/z 185，123。

通過對文獻報道進行比對分析可以看出，目前對生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物進行的分析檢測涉及樣品基質(zhì)、衍生試劑和萃取方法等方面，檢測靈敏度較理想，文獻報道中的檢測限（LOD）通常可達ng/mL級，其中文獻［10，15-16］中檢測限達到了pg/mL級。Wooten等［16］在實驗中分析檢測染毒尿樣中的CVAA，得到LOD=7.4 pg/mL（已報道文獻中檢測限最低的是采用自動化SPME-GC/MS分析方法，需要特殊的儀器裝置）。宋婷婷等［15］在實驗中對衍生試劑進行優(yōu)化，選擇衍生效率較高的DMT，提高了檢測靈敏度，LOD達到pg/mL級。2014年，Naseri等［10］將新型分散衍生液液微萃取方法（DDLLME）用于研究之中，有效提高了衍生和萃取效率，得到檢測限為15 pg/mL。因此新型分析儀器、高效衍生化試劑、新型萃取手段等都是提高分析檢測靈敏度的有效方法。表2歸納了文獻報道的生物樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物的分析方法。

表2 生物醫(yī)學(xué)樣品中路易氏劑代謝產(chǎn)物的分析現(xiàn)狀

5 結(jié)語

雖然路易氏劑已被OPCW列入《禁止化學(xué)武器公約》附表，但卻沒有如其它化學(xué)戰(zhàn)劑一樣被系統(tǒng)地進行研究，目前建立完善的染毒生物醫(yī)學(xué)樣品檢測方法已成為各國的研究重點，而路易氏劑也必將成為研究熱點。隨著新型分析檢測儀器、樣品制備方法的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，路易氏劑代謝產(chǎn)物的分析方法將會向著簡便、快速、靈敏、準確、可靠等方向發(fā)展。

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聯(lián)系人：劉石磊；E-mail： liushilei402@263.com

中圖分類號：O656

文獻標識碼：A

文章編號：1008-6145（2016）01-0099-05

doi：10.3969/j.issn.1008-6145.2016.01.029

收稿日期：2015-11-08

Research Progress in Analysis Methods of Lewisite Metabolites in Biomedical Samples

Wu Jina， Liu Shilei， Yang Yang， Zhou Shikun， Liu Jingquan
（State key Laboratory of NBC Protection for Civilian， Research Institute of Chemical Defence， Beijing 102205， China）

AbstractThe development on the analysis methods of Lewisite metabolites in biomedical samples was reviewed. Biomarkers in biomedical samples after lewisite exposure，and methods for sample preparation and instrumental analysis methods were summaried mainly. There are mainly two types of biomarkers including free metabolites and adducted metabolites. Generally，the analytical procedure involves derivatization of the biomarkers in biomedical samples，enrichment and purification of the derivatives. The target compounds were detected by gas chromatography-mass spectrometry or liquid chromatography-mass spectrometry.

Keywordslewisite； biomedical sample； biomarker； enrichment and purification； analysis