超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定露酒中伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非含量

張書(shū)文，王錕，韓圣謙

（煙臺(tái)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，煙臺(tái)市質(zhì)量認(rèn)證咨詢中心，山東煙臺(tái) 264003）

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定露酒中伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非含量

張書(shū)文，王錕，韓圣謙

（煙臺(tái)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，煙臺(tái)市質(zhì)量認(rèn)證咨詢中心，山東煙臺(tái) 264003）

摘要以甲醇提取樣品，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法同時(shí)測(cè)定露酒中西地那非、伐地那非和他達(dá)拉非。以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，質(zhì)譜采用電噴霧ESI+掃描模式，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性及定量分析。伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非的線性范圍均為5～1 000 μg/L，檢出限均為0.001 mg/kg，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。實(shí)際樣品中伐地那非、西地那非、他達(dá)拉非的加標(biāo)回收率分別為91.0%～96.0%，92.0%～96.0%，89.5%～92.4%。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%（n=6）。該方法操作簡(jiǎn)單、快捷，精密度、回收率高，適用于露酒中伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非的含量分析。

關(guān)鍵詞露酒；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；伐地那非；西地那非；他達(dá)拉非

作為治療男性性功能障礙的處方藥物，伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非嚴(yán)禁在食品和保健食品中添加。這些藥物具有一定的副作用，容易引起頭痛、頭暈、鼻塞和視覺(jué)障礙等癥狀，對(duì)于心血管疾病患者，甚至有可能造成突然死亡的后果。近年來(lái)，一些不法廠商在一些露酒產(chǎn)品中非法加入此類藥物，以增強(qiáng)抗疲勞的功效，提高產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力。這種現(xiàn)象出現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，極易造成該類藥物的濫用，對(duì)消費(fèi)者的健康形成嚴(yán)重的威脅。由于生產(chǎn)工藝不規(guī)范，食品中藥物的含量均勻性很難得到保障，在消費(fèi)者不知情的情況下，會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的副作用，進(jìn)而造成嚴(yán)重的危害［1-6］。

目前，對(duì)保健食品中枸櫞酸西地那非的檢測(cè)有分光光度法［2］、薄層色譜法［3］、高效液相色譜法［4-7］、毛細(xì)管電泳法［8］、液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜法［9-11］等。我國(guó)還沒(méi)有用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定露酒中這3種藥物成分的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。曾有高效液相色譜法測(cè)定露酒成分的報(bào)道［6］，但是由于保健食品成分較為復(fù)雜，定性和定量分析易受到干擾。為了消除干擾，筆者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行定量，分別采用液相色譜通過(guò)組分保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜選擇母離子、二級(jí)質(zhì)譜選擇兩組子離子3種方式進(jìn)行確證定性，為準(zhǔn)確定性、定量奠定良好的基礎(chǔ)。建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定露酒中的伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可作為露酒產(chǎn)品中非法添加該3種藥物的監(jiān)測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）儀：Quattro Premier XE型，配有電噴霧離子源，美國(guó)Waters公司；

分析天平：AL204型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；

伐地那非、西地那非、他達(dá)拉非對(duì)照品：純度均不小于98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)默克集團(tuán)；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)室用水為超純水，用Millipore純水機(jī)制得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非對(duì)照品各約0.1 mg，用甲醇溶解制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于棕色玻璃小瓶?jī)?nèi)4℃下避光保存。臨用時(shí)根據(jù)需要用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確移取試樣5.00 mL至蒸發(fā)皿中，在水浴中緩慢蒸至近干，加入5 mL甲醇后超聲萃取5 min，以4 000 r/min離心3 min，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液，流量為0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜參數(shù)

離子源：電噴霧離子源（ESI），采用ESI+模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓（Cone）：30 V；離子源溫度：110℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：450 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：0.13 mL/min。

伐地那非、西地那非、他達(dá)拉非的保留時(shí)間、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞電壓和駐留時(shí)間列于表2。

表2 3化合物的保留時(shí)間、母離子、子離子等參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用1 mg/L的伐地那非、西地那非和他達(dá)那非標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正離子模式下，通過(guò)儀器自動(dòng)優(yōu)化功能，得到最佳的質(zhì)譜條件，母離子，定量離子和定性離子見(jiàn)表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為使分離效果達(dá)到最佳，選擇有利于離子化的流動(dòng)相以使質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度達(dá)到最高。水相分別采用10 mmol/L 乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨溶液（50∶50），有機(jī)相分別采用甲醇-乙腈（50∶50）、甲醇、乙腈，進(jìn)行梯度洗脫測(cè)試。結(jié)果表明，用1.4儀器工作條件，按表1的梯度洗脫程序，組分的色譜峰形和分離效果均較好。3種物質(zhì)的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 3種物質(zhì)的總離子流圖

2.3 樣品提取方法的選擇

露酒中含有大量糖類物質(zhì)，糖類物質(zhì)在甲醇中的溶解度較低，而伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非均完全溶于甲醇。利用這個(gè)特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行水浴蒸干，直接用甲醇溶解樣品，有效地除去大量糖類物質(zhì)的干擾，可以免于繁瑣的凈化步驟。既能有效提高回收率，又能大大降低檢驗(yàn)成本，并且縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，方法便于推廣使用。

2.4 線性方程和檢出限

在1.4儀器工作條件下，對(duì)1.2系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積Y對(duì)組分的質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的含量定義方法檢出限，伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限見(jiàn)表3。

表3 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)與檢出限

2.5 精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)6款露酒樣品進(jìn)行測(cè)定，樣品中均未檢出伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非殘留。在陰性樣品中分別添加伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非對(duì)照品0.1～0.5 mg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

由表4可知，伐地那非的回收率為91.0% ～96.0%，西地那非的回收率為92.0%～96.0%，他達(dá)拉非的回收率為89.5%～92.4%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，表明所建立的分析方法的精密度和準(zhǔn)確度均較高，滿足檢測(cè)要求。

3 結(jié)語(yǔ)

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定露酒中的伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非，利用水浴蒸干后用甲醇提取的方式進(jìn)行樣品處理。該方法能有效消除露酒中糖類物質(zhì)的干擾，并且操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，檢出限低，穩(wěn)定性好，檢驗(yàn)周期短，可用于露酒中伐地那非、西地那非和他達(dá)拉非的同時(shí)測(cè)定，滿足相關(guān)殘留量檢測(cè)的要求。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 梁祁.中成藥保健食品中西地那非的液質(zhì)聯(lián)用確證方法研究［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2008，29（5）： 295-300.

［2］ 廖曉玲，曹仲文，任雅瑾，等.紫外分光光度法測(cè)定枸櫞酸西地那非片含量［J］.海軍醫(yī)學(xué)雜志，2003，24（1）： 56-57.

［3］ Mikami E，Ohno T，Matsmoto H. Simultaneous identification/ determination system for phentolamine and sildenafil as adulterants in soft drinks advertising roborant nutrition［J］. Forensic Science International，2002，130： 146-149.

［4］ 梁麗梅，李桃.高效液相色譜法測(cè)定藏鞭金丹、三腎丸中枸櫞酸西地那非的含量［J］.中藥材，2006，29（11）： 1 247-1 249.

［5］ 鐘華，梁淑明，曾偉杰，等.固相萃取-高效液相色譜法快速檢測(cè)保健品中的枸櫞酸西地那非［J］.現(xiàn)代食品科技，2010，26（2）：206-208.

［6］ 農(nóng)軍，呂仕軍，段玉林，等.超高效液相色譜法測(cè)定露酒中的枸櫞酸西地那非［J］.廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26（3）： 252-254.

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［11］ SN/T 1951-2007 進(jìn)出口保健食品中伐地那非、西地那非、他達(dá)那非的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法［S］.

聯(lián)系人：張書(shū)文；E-mail： zhangshun382@163.com

中圖分類號(hào)：O657.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-6145（2016）01-0044-03

doi：10.3969/j.issn.1008-6145.2016.01.012

收稿日期：2015-11-20

Determination of Vardenafil-Sildenafil and Tadalafil in Liqueur by UPLC-MS/MS

Zhang Shuwen， Wang Kun， Han Shengqian
（Yantai Institute for Quality Supervision & Inspection of Product， Yantai Quality Certification Consulting Center， Yantai 264003， China）

AbstractSamples were extracted by methanol， vardenafil， sildenafil and tadalafil in liqueur were determined by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry at the same time. With mobile phase of methanol-0.1% formic acid solution， the mass spectrometry was operated in the positive ion mode of multiple reaction monitoring.The linear range of vardenafil， sildenafil and tadalafil was 5-1 000 μg/L， the detection limit was 0.001 mg/kg， and correlation coefficient was more than 0.999. The average recoveries of vardenafil， sildenafil and tadalafil were 91.0%-96.0%， 92.0%-96.0% and 89.5%-92.4%， respectively， and the relative standard deviation（RSD） was less than 2%（n=6）. The method is simple， rapid， high efficiency and yield， which is suitable for determination of vardenafil， sildenafil and tadalafil in liqueur.

Keywordsliqueur； UPLC-MS/MS； vardenafil； sildenafil； tadalafil