糖化LDL對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性及基因表達(dá)的影響

張冰雨, 曾瑞翔, 舒曉亮, 雷 濤

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，上海 201500； 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062)

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·基礎(chǔ)研究·

糖化LDL對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性及基因表達(dá)的影響

張冰雨1, 曾瑞翔1, 舒曉亮2, 雷 濤3

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，上海 201500； 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062)

目的 觀察糖化低密度脂蛋白(gly-LDL)對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及抗氧化相關(guān)因子的影響，探討糖尿病患者血管內(nèi)皮損傷與gly-LDL的相關(guān)性及可能機(jī)制。方法 用完全培養(yǎng)基及不同濃度(G1組 0.06mg/L, G2組0.12mg/L, G3組0.24mg/L)的gly-LDL處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)24h、48h及72h，設(shè)對(duì)照組(Ctr)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)SOD和MDA水平，同時(shí)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察gly-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能的影響，用實(shí)時(shí)半定量PCR(realtime quantitative PCR，RT-qPCR)方法測(cè)定Mn-SOD和eNOS的mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 與 對(duì)照組相比不同濃度的gly-LDL均可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能。較低或較高濃度的gly-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，隨時(shí)間的增加SOD的活性及MDA的含量是升高的；中間濃度的gly-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，隨時(shí)間的增加SOD活性是逐漸下降的，MDA含量是先增高后降低的。各組Mn-SOD的mRNA表達(dá)水平48h和72h均下調(diào)，eNOS的表達(dá)水平于24h和48h均下調(diào)，72h時(shí)上調(diào)。結(jié)論 Gly-LDL與糖尿病患者血管并發(fā)癥可能存在一定的相關(guān)性，但不能肯定其是惡化因素之一。

糖基化； 低密度脂蛋白； 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞； 超氧化物歧化酶； 丙二醛

脂代謝紊亂尤其是低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)含量升高與心血管病變密切相關(guān)，修飾后LDL與心血管病變的相關(guān)性研究正逐漸增多，糖化LDL(glycated low density lipoprotein, gly-LDL)作為糖尿病的生化指標(biāo)之一，是晚期糖化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end-products， AGEs)的重要組成部分，在糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生中起到了重要作用，多數(shù)研究表明AGEs與血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)[1-2]，可引起內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，加速糖尿病血管粥樣硬化的進(jìn)程，但具體機(jī)制尚未完全明確。臨床上已經(jīng)對(duì)部分糖尿病患者采取了抗氧化治療，取得了一定的療效[3]，大部分研究也提示氧化應(yīng)激在血管病變中發(fā)揮重要作用[4]，但Gly-LDL對(duì)血管內(nèi)皮的影響是否通過導(dǎo)致氧化應(yīng)激作用而引起血管病變?nèi)杂写懻?。本研究通過檢測(cè)氧化應(yīng)激的部分相關(guān)物質(zhì)評(píng)價(jià)gly-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，探討gly-LDL與糖尿病血管并發(fā)癥的相關(guān)性及可能影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、RPMI 1640培養(yǎng)基、(superoxide dismutase, SOD) 測(cè)試盒及(malondialdehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物公司，低密度脂蛋白(LDL)、葡萄糖和丁基羥基甲苯購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司，Trizol 以及 RT-qPCR相關(guān)試劑PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒和SYBR?Premix Ex TagTM購自美國(guó)TaKaRa公司。PCR儀為ABI PRISM?7900HT。

1.2 方法

1.2.1 低密度脂蛋白的糖化 參考相關(guān)文獻(xiàn)中關(guān)于低密度脂蛋白的糖化方法[5-6]，在無菌條件下將葡萄糖與LDL在37℃條件下孵育4周，葡萄糖終濃度為50mmol/L，LDL終濃度為2mg/ml；同時(shí)加入EDTA和丁基羥基甲苯，終濃度分別為1mg/ml和10μm/L；得到的糖化LDL，透析后避光儲(chǔ)存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVECs細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)并傳代鋪板。對(duì)照組(Ctr)僅加培養(yǎng)基，糖化LDL(gly-LDL)分三組，G1組加入0.06mg/L gly-LDL，G2組加入0.12mg/L gly-LDL，G3組加入0.24mg/L gly-LDL，每組三個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在六孔板底部用黑色記號(hào)筆平行畫三條線作為標(biāo)記，每孔鋪約5×106個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后用200μl槍頭在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS洗滌2次，加入含1%血清的培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下拍照，放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。之后分別于培養(yǎng)第24h、第48h、第72h拍照。

1.2.4 SOD活性和MDA含量測(cè)定 收集培養(yǎng)24h、48h和72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書處理后，分別于波長(zhǎng)550nm和532nm處測(cè)定吸光度(D值)，根據(jù)說明書中公式算得SOD的活力及MDA的含量。

1.2.5 Realtime quantitative PCR 選取Mn-SOD基因及eNOS基因做實(shí)時(shí)熒光半定量PCR，基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列為： GAPDH上游： 5′-GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，GAPDH下游： 5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′； Mn-SOD上游： 5′-AGT TCA ATG GTG GTG GTC ATA-3′，Mn-SOD下游： 5′-CAA TCC CCA GCA GTG GAA TAA-3′；eNOS上游： 5′-CAG CCT CAC TCC TGT TTT CC-3′，eNOS下游： 5′-GGA TTG TCG CCT TCA CTC G-3′。選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參。RT-qPCR反應(yīng)條件： 預(yù)變性95℃ 30s，PCR反應(yīng)95℃ 10s，60℃ 34s，72℃ 10s，40個(gè)循環(huán)，延伸95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 15s。得到閾值周期(CT值)，用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)差異倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HUVECs加入不同濃度的gly-LDL后，分別于培養(yǎng)第24h、48h、72h拍照，對(duì)照組細(xì)胞幾乎遷移完全，而G1組、G2組和G3組的細(xì)胞遷移與對(duì)照組相比，在第48h和72h受到明顯的抑制，在第一個(gè)24h，G3組即最高濃度gly-LDL組的細(xì)胞遷移受到的抑制作用最明顯，見圖1。

圖1 HUVECs細(xì)胞劃痕圖Fig.1 Scarification test of HUVECs

2.2 SOD活性和MDA含量

收集培養(yǎng)24h、48h和72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，用ELISA的方法測(cè)定SOD和MDA的含量。其中，對(duì)照組的SOD活性在培養(yǎng)48h后出現(xiàn)一個(gè)高峰，培養(yǎng)72h后活性又降低。G1組和G3組的細(xì)胞上清液SOD活性隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，其中G1組相對(duì)較明顯。G2組細(xì)胞上清液的SOD活性隨時(shí)間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但48h與72h差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SOD活性于48h與72h時(shí)G1、G3組與G2組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

對(duì)照組MDA含量與SOD活性變化情況相似，在48h出現(xiàn)高峰后72h下降。G1和G3組細(xì)胞上清液MDA含量隨時(shí)間呈上升曲線，G1組相對(duì)更明顯。G2組細(xì)胞上清液的MDA含量隨時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但72h僅相對(duì)48h有微小的上升，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MDA含量于24h、48h各組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖2 細(xì)胞上清液中SOD活性變化情況Fig.2 SOD activity changes in cell supernatant

圖3 細(xì)胞上清液中MDA含量變化情況Fig.3 MDA content changes in cell supernatant

2.3 RT-qPCR結(jié)果

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過gly-LDL處理分別培養(yǎng)24h、48h、72h后按常規(guī)方法提取總RNA，進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定Mn-SOD和eNOS的基因表達(dá)水平。結(jié)果提示，24h時(shí)各組Mn-SOD的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，G1與G2組的eNOS明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G3組與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48h時(shí)各組Mn-SOD及eNOS的表達(dá)均較對(duì)照組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。72h時(shí)G1和G2組的Mn-SOD較對(duì)照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，G3與對(duì)照組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組的eNOS與對(duì)照組比均現(xiàn)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 各組Mn-SOD mRNA表達(dá)情況Fig.4 Relative expression of Mn-SOD mRNA

圖5 各組e-NOS mRNA表達(dá)情況Fig.5 Relative expression of e-NOS mRNA

3 討 論

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機(jī)制目前并不十分清楚。已有研究證明gly-LDL與糖尿病血管病變有相關(guān)性[7]。具體機(jī)制尚未明確，本研究則從氧化應(yīng)激的角度探討gly-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝的影響。超氧化物歧化酶(SOD)是人體自生的一種氧自由基清除劑[8]。在血管內(nèi)皮保護(hù)和抗氧化應(yīng)激方面起著重要作用[9]。目前，總SOD的直接相關(guān)基因未見明確報(bào)道，本研究選取測(cè)定Mn-SOD的mRNA表達(dá)情況。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一[10]，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，在衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度。eNOS(endothelial nitric oxide synthetase)即一氧化氮合成酶，它的表達(dá)與血管舒張因子一氧化氮(NO)的合成分泌密切相關(guān)，一定程度上提示了血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[11-12]。本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度gly-LDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的gly-LDL均能抑制細(xì)胞的遷移。測(cè)定細(xì)胞上清液中SOD活性及MDA含量，發(fā)現(xiàn)0.12mg/L的gly-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的SOD活性及MDA含量相對(duì)其他濃度gly-LDL的影響大，且作用48h后更明顯，主要是抑制SOD的活性，促進(jìn)MDA的分泌。0.06mg/L的gly-LDL及0.24mg/L的gly-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性及Mn-SOD含量的影響相似，隨時(shí)間的變化均輕度升高SOD的活性及MDA的含量。從對(duì)照組來看，在未受到干擾的情況下，SOD活性和MDA的含量均于48h內(nèi)逐漸上升，后逐漸下降，細(xì)胞在受到gly-LDL的作用影響后這一節(jié)律被打亂。24h時(shí)各組間差異不大；第48h時(shí)SOD活性被抑制，MDA含量增加；第72h時(shí)G2組SOD活性及MDA含量均相對(duì)較低，但G1組的SOD活性及MDA含量均相對(duì)明顯的升高，提示可能較低濃度的gly-LDL能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生過氧化反應(yīng)，同時(shí)啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制促進(jìn)SOD的激活；而相對(duì)更高濃度的gly-LDL在刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧化反應(yīng)的同時(shí)抑制了SOD的活性。RT-qPCR的結(jié)果提示，24h時(shí)Mn-SOD基因的表達(dá)尚未有明顯的改變，于第48h和72h各gly-LDL組Mn-SOD均較對(duì)照組不同程度的下調(diào)。各組eNOS的表達(dá)于24h及48h時(shí)均是相對(duì)下調(diào)的，與gly-LDL的濃度無明顯相關(guān)性，但72h時(shí)相對(duì)對(duì)照組是明顯上調(diào)的，且隨gly-LDL濃度升高而升高，提示48h以內(nèi)gly-LDL可能是抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成的，對(duì)于血管的作用是不利的，而72h后，隨著細(xì)胞的自身調(diào)節(jié)機(jī)制啟動(dòng)，激活NO相關(guān)促生成基因的表達(dá)，但最終NO的生成或釋放的多少仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的gly-LDL可能在一定程度上是自我調(diào)節(jié)與自我保護(hù)的啟動(dòng)因素之一，對(duì)人體本身是有益的，而較高濃度的gly-LDL可一定程度地影響人氣靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，其機(jī)制可能是通過影響SOD的活性及生成來影響血管內(nèi)皮的功能，即提示高血脂的糖尿病患者可能是間接通過形成糖化低密度脂蛋白引起氧化應(yīng)激而致使血管內(nèi)皮受損。然而隨著時(shí)間的推移，損傷作用可能逐漸減弱，保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)。這一機(jī)制可能與CO2對(duì)呼吸的調(diào)節(jié)作用類似，即較低濃度的CO2可刺激呼吸，較高濃度的CO2可抑制呼吸，而處于較長(zhǎng)時(shí)間的高濃度CO2狀態(tài)時(shí)，呼吸主要靠CO2來刺激，若立即糾正反而更易引起呼吸停止[13]，但這一推論的證實(shí)仍需要更進(jìn)一步的研究。通過本研究得到結(jié)論，gly-LDL與糖尿病患者血管并發(fā)癥可能存在一定的相關(guān)性，但不能肯定其是惡化因素之一。

[1] Liu Y, Liang C, Liu X, et al. AGEs increased migration and inflammatory responses of adventitial fibroblasts via RAGE, MAPK and NF-kappaB pathways[J]. Atherosclerosis, 2010,208(1)： 34-42.

[2] Pan Y, Liang H, Liu H, et al. Platelet-secreted microRNA-223 promotes endothelial cell apoptosis induced by advanced glycation end products via targeting the insulin-like growth factor 1 receptor[J]. J Immunol, 2014,192(1)： 437-446.

[3] 曾瑞翔，張冰雨，雷濤.硫辛酸對(duì)2型糖尿病患者SOD、MDA及hs-CRP水平的影響[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版,2016，36(2)： 40-43.

[4] 周智輝，戴亞蕾.血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版,2014，34(2)： 123-127.

[5] Sima A V, Botez G M, Stancu C S, et al. Effect of irreversibly glycated LDL in human vascular smooth muscle cells： lipid loading, oxidative and inflammatory stress[J]. J Cell Mol Med, 2010,14(12)： 2790-2802.

[6] Zhao R, Xie X, Shen G X. Effects of glycated low-density lipoprotein on cell viability, proliferation, and growth factors of mouse embryo fibroblasts[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2013,91(1)： 64-70.

[7] Sangle G V, Zhao R, Mizuno T M, et al. Involvement of RAGE, NADPH oxidase, and Ras/Raf-1 pathway in glycated LDL-induced expression of heat shock factor-1 and plasminogen activator inhibitor-1 in vascular endothelial cells[J]. Endocrinology, 2010,151(9)： 4455-4466.

[8] Lu X, Wang C, Liu B. The role of Cu/Zn-SOD and Mn-SOD in the immune response to oxidative stress and pathogen challenge in the clam Meretrix meretrix[J]. Fish Shellfish Immunol, 2015,42(1)： 58-65.

[9] Stukelj M, Toplak I, Svete A N. Blood antioxidant enzymes(SOD, GPX), biochemical and haematological parameters in pigs naturally infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Pol J Vet Sci, 2013,16(2)： 369-376.

[10] Yuhai G U, Zhen Z. Significance of the changes occurring in the levels of interleukins, SOD and MDA in rat pulmonary tissue following exposure to different altitudes and exposure times[J]. Exp Ther Med, 2015,10(3)： 915-920.

[11] Ahsan A, Han G, Pan J, et al. Phosphocreatine protects endothelial cells from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway[J]. Apoptosis, 2015,20(12)： 1563-1576.

[12] Kostyuk SV, Alekseeva AY, Kon’Kova M S, et al. Oxidized extracellular DNA suppresses nitric oxide production by endothelial NO synthase(eNOS) in human endothelial cells(HUVEC)[J]. Bull Exp Biol Med, 2014,157(2)： 202-206.

[13] Rodrigues MK, Oliveira MF, Soares A, et al. Additive effects of non-invasive ventilation to hyperoxia on cerebral oxygenation in COPD patients with exercise-related O2desaturation[J]. Clin Physiol Funct Imaging, 2013,33(4)： 274-281.

Effect of glycated LDL on SOD activity and gene expression of human umbilical vein endothelial cells

ZHANGBing-yu1,ZENGRui-xiang1，SHUXiao-liang2,LEITao3

(1. Dept of Endocrine Tongji Hospital, Tongji University,Shanghai 200065, China; 2. Dept. of Nutriology, Jinshan Hospital of Fudan University, Shanghai 201500, China; 3. Dept. of Endocrinology, Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China)

Objective To investigate the effect of glycated low density lipoprotein(gly-LDL) on the growth and antioxidant related factors in endothelial cells, and investigate the correlation of gly-LDL with diabetes vascular endothelial injury and the possible mechanism. Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were treated with different concentrations(0.06mg/L, 0.12mg/L, 0.24mg/L) of gly-LDL for 24h, 48h and 72h. Superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) levels in the cell culture supernatant were detected. The migrate function of endothelial cells was assessed by scratch test. Mn-SOD and eNOS mRNA expressions were determined by real-time quantitative PCR(RT-qPCR). Results Gly-LDL at different concentrations inhibited the migrate function of endothelial cells. When HUVCCs treated with 0.06mg/L and 0.24mg/L gly-LDL, the activity of SOD and MDA were increased with the time; while treated with 0.12mg/L gly-LDL, the SOD activity was decreases with the time and MDA was decrease after initial increase. Mn-SOD mRNA expression level were down-regulated after 48h and 72h in all gly-LDL treated groups. The expression of eNOS levels in 24h and 48h were down-regulated, but up-regulated in 72h. Conclusion Glycated LDL can inhibit growth of endothelial cells and change the expression of antioxidant related factors, which may be associated with the pathogenesis of vascular complications in diabetic patients.

glycosylation; low density lipoprotein; HUVECs; superoxide dismutase; malondialdehyde

10.16118/j.1008-0392.2016.06.006

2016-06-28

國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2014AA022304)

張冰雨(1989—),女,碩士研究生.E-mail： zhangbingyu520@163.com

雷 濤.E-mail： leitao5899@126.com

R 587

A

1008-0392(2016)06-0029-06