高血糖促進T細胞激活加重糖尿病小鼠心肌功能障礙的作用

張 輝， 周曉慧， 林 芳， 鐵金軍， 范慧敏,， 劉中民,

(1. 同濟大學附屬東方醫(yī)院心外科，上海 200120； 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院，心力衰竭研究所，上海 200120; 3. 上海市心力衰竭研究中心，上海 200120)

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·基礎研究·

高血糖促進T細胞激活加重糖尿病小鼠心肌功能障礙的作用

張 輝1， 周曉慧2,3， 林 芳2,3， 鐵金軍1， 范慧敏1,2,3， 劉中民1,2,3

(1. 同濟大學附屬東方醫(yī)院心外科，上海 200120； 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院，心力衰竭研究所，上海 200120; 3. 上海市心力衰竭研究中心，上海 200120)

目的 研究CD4+T細胞在糖尿病性心肌病(diabetes cardiomyopathy, DCM)中的作用。方法 SPF級C57BL/6小鼠，雄性，4周齡，飼喂高脂飼料(high fat diet， HFD)6周,腹腔注射鏈脲菌素(streptozotocin, STZ)，普通飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠作為對照，飼喂6周后腹腔注射檸檬酸緩沖液。注射1周后兩組小鼠做心臟超聲檢測，后處死小鼠，心肌組織進行H-E染色，觀察心肌病理改變情況，Q-PCR檢測兩組小鼠心肌組織中相關(guān)炎癥因子的表達水平。流式細胞檢測小鼠體內(nèi)CD4+T細胞的表型。結(jié)果 與普通飲食喂養(yǎng)小鼠相比，2型糖尿病模型小鼠出現(xiàn)了明顯的心功能損害和心肌病理學改變。糖尿病模型小鼠心肌組織中Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet及炎癥因子TNF-α和IFN-γmRNA均較對照組明顯升高。糖尿病模型小鼠縱隔淋巴結(jié)中CD4+CD44+T細胞比例較對照組明顯升高。結(jié)論 2型糖尿病模型小鼠出現(xiàn)了明顯的心功能損害，縱隔淋巴結(jié)CD4+CD44+T細胞比例明顯增加，心肌組織中Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet升高，提示激活的CD4+Th1細胞可能在DCM中扮演著重要角色，TNF-α可能也參與了這一過程。

糖尿病性心肌病； CD4+T細胞； 炎癥反應； 小鼠

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是影響著全世界3億人的主要慢性疾病之一。預計到2030年，將有4.5億人患有糖尿病[1]。在糖尿病眾多的并發(fā)癥中，糖尿病患者患心血管疾病和心臟衰竭的風險顯著高于非糖尿病人群，心血管疾病(cardiova-scular disease, CVD)是糖尿病人群最重要的死亡原因[1]。其中，糖尿病性心肌病(diabetes cardiomyo-pathy, DCM)作為獨立于高血壓和冠狀動脈疾病的特異性心肌病，與糖尿病顯著相關(guān)[2]。獨立的病因?qū)W數(shù)據(jù)顯示，糖尿病人群中由DCM導致的心臟衰竭(heart failure, HF)風險比非糖尿病人群增加約2～ 3倍，且預后更差[3]。但糖尿病患者心力衰竭的具體機理尚不完全清楚。

炎癥是目前公認的糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[4]。作為重要的炎癥細胞，T細胞在左室的募集和活化對非缺血性心力衰竭的作用已被證實[5-6]。本研究利用高脂飲食喂養(yǎng)(high fat diet, HFD)加鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射誘導的2型糖尿病模型(簡稱HFD模型)，探討高血糖激活的CD4+T細胞在DCM所致心功能損害中的作用[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量20～25g，4周齡,購于上海斯萊克實驗動物有限公司【許可證號SCXK(滬)2007—0005】。小鼠飼養(yǎng)于同濟大學附屬東方醫(yī)院實驗動物中心SPF動物房。分組為正常對照組： C57BL/6小鼠，7例；HFD及STZ誘導組： 6例。

1.2 HFD加STZ腹腔注射誘導的2型糖尿病模型的建立

從小鼠4周齡開始，糖尿病模型組小鼠飼喂高脂飼料，正常組小鼠飼喂基礎飼料，持續(xù)6周。各飼喂6周后，糖尿病組小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射STZ，劑量按70mg/kg體質(zhì)量，一次性注射[7],繼續(xù)飼喂高脂飼料;正常組小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射檸檬酸緩沖液,劑量按70mg/kg體質(zhì)量，一次性注射，繼續(xù)飼喂普通飼料。STZ注射7d后,禁食不禁水12h,羅氏卓越型血糖儀測量空腹血糖,血糖值大于11.1mmol/L的個體被認定為2型糖尿病小鼠。

1.3 小鼠心超

STZ注射后7d后，將兩組小鼠以1%異氟烷吸入麻醉后，仰臥位固定于高分辨率小動物超聲系統(tǒng)(VisualSonics Vevo770)上,選取胸骨旁短軸觀切面，2D M型超聲心動圖評估左室收縮末直徑(end systolic dimension, ESD),左室舒張末直徑(end dilation dimension, EDD)，及反映心室收縮功能的射血分數(shù)(ejection fraction, EF)，縮短分數(shù)(fractional shortening, FS)。

1.4 標本收集

處死小鼠，取小鼠心臟放入含1ml 4%多聚甲醛溶液的凍存管，4℃保存24h,作H-E染色切片。另留心尖部分的心肌組織置于含1ml Trizol的1.5ml EP管中，用于抽提RNA。

1.5 Q-PCR檢測

小鼠心肌組織置于含1ml Trizol的RNAse-Free的1.5ml EP管中，充分勻漿，加200μl氯仿，劇烈振蕩15s，15～30℃下靜置3min，離心半徑10cm，4℃，離心機轉(zhuǎn)速12000 r/min，離心15min，小心轉(zhuǎn)移上層無色溶液于另一個1.5ml RNAse-Free的離心管中，加 200μl 異丙醇，混勻，室溫放置15min，離心半徑 10cm,4℃，離心機轉(zhuǎn)速12000r/min,離心10min，倒去上清液，加200μl 75%乙醇洗滌沉淀，離心半徑10cm，4℃，離心機轉(zhuǎn)速 7500r/min，離心 5min，重復75%乙醇洗滌，倒去上清液，打開管蓋，將沉淀于超凈臺上晾干，將得到的RNA沉淀用30～50μl RNAse-Free的水溶解，用Nano Drop儀對RNA進行濃度測定。每個200μl RNAse-Free的薄壁管中加入以下試劑： gDNA eraser buffer 2μl，gDNA eraser 1μl，RNA 1μl，用RNAse-Free的水補足10μl，混勻，42℃加熱2min，向所得產(chǎn)物內(nèi)分別加入以下試劑： primer script buffer 4μl，primer script RT enzyme 1μl，RT primer mix 1μl，RNAse-Free的水4μl，混勻，放置 37℃ 15min，85℃ 5s。用Primer 5.0設計引物，所采用的引物序列,見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 流式細胞檢測

分別取小鼠縱隔淋巴結(jié)于平皿中，研磨，PBS沖洗平皿，收集細胞懸液，裂解紅細胞，加抗體來源的血清進行封閉10min，加不同熒光標記的抗體(如CD4，CD44)，4℃孵育20min，PBS洗去多余的抗體，后上樣進行流式檢測，數(shù)據(jù)導出用Flowjo軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 HFD模型血糖及體質(zhì)量變化

2.1.1 體質(zhì)量變化 從兩組小鼠4周齡開始用HFD飼喂，每周測量小鼠體質(zhì)量。與對照組(Control)小鼠相比，從第7周開始(HFD飼喂3周)，HFD組小鼠體質(zhì)量明顯增加，此后差異更加顯著，直至12周齡取材時。

2.1.2 血糖變化 從兩組小鼠4周齡開始，每周測量小鼠血糖水平。與對照組小鼠(Control)相比，從第7周開始，HFD組小鼠血糖明顯升高，此后差異更加顯著，直至12周齡(STZ腹腔注射1周后)取材時，見圖1。

圖1 HFD模型體質(zhì)量及血糖變化情況 (n=3， *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)Fig.1 Weight and blood glucose of HFD model (n=3， *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

2.2 HFD模型心功能發(fā)生損害

兩組小鼠12周齡時測量心臟超聲，與對照組小鼠相比，HFD組小鼠EF及FS均有明顯下降，見圖2。

圖2 HFD小鼠心功能變化情況(n=6，*P<0.05)Fig.2 Cardiac function of HFD model(n=6，*P<0.05)

2.3 HFD模型心肌病理學檢測

兩組小鼠12周齡時取材做心肌組織H-E染色。與對照組小鼠相比，HFD組小鼠心臟明顯增大，心室壁增厚，心肌細胞變大，細胞間隙增寬，肌纖維走向不規(guī)則，甚至出現(xiàn)扭曲，斷裂，心肌間有炎細胞浸潤，見圖3。

圖3 HFD小鼠心肌病理變化情況(H-E染色)Fig.3 Pathological changes of HFD myocardium(H-E staining)

2.4 HFD模型心肌組織炎癥因子變化

兩組小鼠12周齡時，Q-PCR檢測兩組小鼠心肌CD4 mRNA及組織炎癥因子mRNA。結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，HFD組小鼠CD4 mRNA, Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet及炎癥因子IFN-γ表達均升高，TNF-α表達水平明顯升高,見圖4。

圖4 HFD模型心肌炎癥因子mRNA相對表達情況 (n=5，*P<0.05, **P<0.01)Fig.4 Gene relative expression of inflammatory cytokines from HFD heart(n=5，*P<0.05, **P<0.01)A： Q-PCR檢測兩組心肌CD4 mRNA表達水平；B： Q-PCR檢測兩組心肌T-bet mRNA表達水平；C： Q-PCR檢測兩組心肌IFN-γ mRNA表達水平；D： Q-PCR檢測兩組心肌TNF-α mRNA表達水平

2.5 HFD模型縱隔淋巴結(jié)CD4+CD44+T細胞變化

兩組小鼠12周齡時取小鼠縱隔淋巴結(jié),用流式細胞儀檢測CD4+T細胞表型，結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，HFD組小鼠CD4+T細胞比例明顯降低，CD44+CD4+T細胞比例明顯升高，見圖5。

圖5 HFD小鼠縱隔淋巴結(jié)CD44+CD4+T細胞數(shù)量變化情況(n=5，*P<0.05, **P<0.01)Fig.5 Quantity changes of CD44 + CD4 + T cells from mediastinal lymph nodes of HFD mice(n=5，*P<0.05, **P<0.01)

3 討 論

自糖尿病心肌病的概念被提出以來，流行病學研究結(jié)果顯示，糖尿病患者患HF的可能性比非糖尿病患者高出兩倍以上[3]，相對于非糖尿病人群，糖尿病HF患者的生存率也顯著降低[8]。DCM的發(fā)生和發(fā)展受多因素影響，比如炎癥反應，代謝紊亂，胰島素抵抗，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system， RAS)功能異常和心肌纖維化等，其中炎癥反應發(fā)揮了重要的作用[9-10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，T細胞介導的炎癥反應在心力衰竭的發(fā)展中至關(guān)重要。Nevers等[5]發(fā)現(xiàn)T細胞在左室的募集和活化促進了心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展，除去T細胞明顯改善心力衰竭的病理改變。在小鼠2型糖尿病模型和肥胖模型中的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖，高胰島素血癥，以及活性氧(reactive oxygen species， ROS)會激活CD4+ T細胞，促進IFN-γ等促炎因子的釋放，并造成射血分數(shù)的降低，在擴張型心肌病和心力衰竭等心臟疾病中發(fā)揮中心作用[11]。

本研究利用HFD飼喂加STZ腹腔注射誘導的2型糖尿病模型，于注射后第7天檢測小鼠心功能，心肌病理變化及心肌CD4 + T細胞和炎癥因子浸潤的水平，探討高血糖引起的的CD4+T細胞激活在DCM所致心力衰竭中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與普通飲食喂養(yǎng)小鼠相比，2型糖尿病模型小鼠出現(xiàn)了明顯的體重及血糖升高，較好地模擬了2型糖尿病人群，并觀測到了明顯的心功能損害和心肌病理學改變。Laroumaine F等[12]發(fā)現(xiàn)，縱隔淋巴結(jié)中的CD4+T細胞升高與心力衰竭進展密切相關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死的患者外周血中T細胞數(shù)量減少，而心臟梗死區(qū)域T細胞數(shù)量增多[13]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)，縱膈淋巴結(jié)中CD4+T細胞比例在HFD組明顯減低，提示HFD組可能會有較多的T細胞募集到了心臟組織。進一步的結(jié)果顯示，HFD組心臟組織的CD4 mRNA水平較對照組明顯升高，這些結(jié)果提示CD4+T細胞可能參與了HFD的心肌組織功能損害。

在受到某些特定因素和細胞因子的刺激時，CD4+T細胞可以分化成具有特定功能和特性的各種T細胞亞群[13]。其中，Th1亞型表達特征性轉(zhuǎn)錄因子T-bet，主要產(chǎn)生IFN-γ，后者又可以促進CD4+ T細胞向Th1亞型極化[15-16]，且可以促進心肌結(jié)構(gòu)的病理損害和心力衰竭的進展[17]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型小鼠心肌組織中CD4+Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet及炎癥因子TNF-α、IFN-γ相對表達均有明顯升高，流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型小鼠縱隔淋巴結(jié)中CD4+CD44+T細胞比例明顯增加。因此，激活的CD4+T細胞在DCM所致心力衰竭的過程中可能扮演著重要角色，并與激活的CD4+T細胞向Th1亞型極化有關(guān)，從而為干預DCM所致心力衰竭提供了部分實驗數(shù)據(jù)。

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Hyperglycemia promotes T cell activation and aggravates myocardial dysfunction in diabetic mice

ZHANGHui1，ZHOUXiao-hui2,3，LINFang2,3，TIEJin-jun1,FANHui-min1,2,3，LIUZhong-min1,2,3

(1. Dept. of Cardiac Surgery, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China; 2. Research Institute of Heart Failure, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China; 3. Shanghai Heart Failure Research Center, Shanghai 200120, China)

Objective To determine the role of CD4 + T cells in diabetic cardiomyopathy(DCM). Methods C57BL/6 mice(4wk old)were fed with High-fat diet(HFD)for 6wk, and then injected with streptozotocin, STZ intraperitoneally; and normal diet-fed C57BL/6 mice were injected with citric acid buffer as control. Echocardiographic assessment of heart function was performed and the hearts were harvested 1wk after STZ injection. Heart samples were stained with H&E, and examined under light microscopy. Inflammatory factors in hearts were evaluated by Q-PCR. T cells phenotypes were detected by Q-PCR and flow cytometry. Results Compared to control mice, type 2 diabetic mice showed significant heart dysfunction and myocardial pathological changes. mRNA levels of TNF-α and IFN-γ in HFD heart increased compared with ordinary diet mice. Percentages of CD4+CD44+T cells from mediastinal lymph node up-regulated compared to that from ordinary diet mice. Conclusion Results indicate that activation of CD4+ Th1 cells may play an important role in pathogenesis of diabetic cardiomyopathy, and TNF-α may also contribute to this process.

diabetic cardiomyopathy(DCM); CD4 + T cells; inflammation； mouse

10.16118/j.1008-0392.2016.06.001

2016-08-23

國家自然科學基金(81470393、81370434、81400363、81670458)；上海市領(lǐng)軍人才基金(2012053)；上海市衛(wèi)計委(ZY3-LCPT-2-1003)；浦東新區(qū)衛(wèi)計委重點學科群建設(PWZxq2014-01)；浦東新區(qū)科委(Pkj2013-z03)

張 輝(1988—)，男，住院醫(yī)師，碩士研究生.E-mail： moontom56@163.com

劉中民.E-mail： liu.zhongmin@#edu.cn

R 61

A

1008-0392(2016)06-0001-05