核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射時間與視網(wǎng)膜損傷的關(guān)系

顏東 劉麗梅 明春秀 張少斌

1濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺 264033;2濰坊眼科醫(yī)院 261041

病理性近視是全球性的公共衛(wèi)生問題，是低視力和致盲的主要原因之一。病理性近視的眼底常出現(xiàn)多種異常改變，包括視盤斜入、視盤顳側(cè)萎縮弧或視盤周圍萎縮環(huán)、后鞏膜葡萄腫、豹紋狀眼底等。這些改變的根本原因在于眼軸的進(jìn)行性增長，后鞏膜變薄，生物力學(xué)強度減弱，眼底出現(xiàn)退行性變化[1]。核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)可增強鞏膜的生物力學(xué)強度[2-6]，但是在紫外線A照射時可能會有視網(wǎng)膜損傷的風(fēng)險。既往研究主要通過病理組織學(xué)方法研究核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)的安全性[7-8]。由于其潛在的損傷機制可能為交聯(lián)過程中釋放的活性氧自由基導(dǎo)致的光化學(xué)損傷[9]，因此本研究在組織學(xué)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討該技術(shù)對視網(wǎng)膜氧化及抗氧化水平的影響，尋找其照射的安全時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組 選取健康成年新西蘭大白兔60只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg(青島大學(xué)提供)，實驗兔均在SPF動物房飼養(yǎng)并進(jìn)行實驗。實驗動物的飼養(yǎng)和使用均遵循ARVO制定的科研動物使用規(guī)范和國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物質(zhì)量管理辦法》要求。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：2017-80)。采用隨機數(shù)表法將60只實驗兔隨機分為對照組(0 min)和照射10、20、30及40 min組，每組12只，均以左眼為實驗眼。

1.1.2主要試劑及儀器 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%核黃素溶液(意大利Sooft公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(TBA法)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(WST-1法)、過氧化氫酶(catalase，CAT)測定試劑盒(鉬酸銨法)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗GAPDH抗體、兔抗CAT抗體(美國Abcam公司)；兔抗SOD抗體(美國Affinity公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(南非Aspen公司)；RIPA裂解液(中國Beyotime公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。LED紫外線發(fā)射儀(Mod.VEGA 10 mW，意大利Sooft公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)及術(shù)后處理 實驗前3 d采用氧氟沙星滴眼液點眼，每天4次。在每次照射前對交聯(lián)儀進(jìn)行能量測試，確保能量的準(zhǔn)確性。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉溶液(2 ml/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈注射行全身麻醉。實驗眼采用鹽酸丙美卡因滴眼液點眼行表面麻醉，開瞼器撐開左眼瞼，眼科剪剪開球結(jié)膜，分離結(jié)膜下組織，5-0尼龍線在角膜緣處牽拉，暴露鼻上象限赤道部鞏膜9 mm×9 mm以上。于照射前15 min采用0.1%核黃素溶液點眼，每3 min點眼1次。照射參數(shù)：波長為370 nm，能量密度為10 mW/cm2，光圈直徑為9 mm，照射期間仍每3 min核黃素溶液點眼1次。術(shù)后采用氧氟沙星滴眼液點眼，每天4次。于照射結(jié)束后24 h，采用耳緣靜脈注射空氣法處死實驗兔后摘取眼球。

1.2.2蘇木精-伊紅染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài) 將眼球置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h，取實驗眼交聯(lián)區(qū)域和對照組相應(yīng)區(qū)域的組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，乙醇脫水，石蠟包埋，用蘇木精-伊紅染色4 μm厚石蠟切片，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織的病理學(xué)改變。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu) 取新鮮視網(wǎng)膜組織迅速投入配置好的固定液中，標(biāo)本先后經(jīng)體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨固定液雙重固定；梯度乙醇脫水；環(huán)氧丙烷過渡，Epon812包埋；半薄切片定位，制作超薄切片，厚度為60 nm；采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。采用Tecnai G2 20 Twin透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)變化。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.4MDA測試盒檢測視網(wǎng)膜中MDA濃度 取新鮮視網(wǎng)膜組織，稱重，置于玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷的生理鹽水，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蛋白勻漿，離心半徑16 cm，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管及對照管分別加入無水乙醇0.1 ml、10 nmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品0.1 ml、測試樣品0.1 ml，向每管加入試劑一0.1 ml，混勻。向每管中依次加入試劑二3.0 ml和試劑三1.0 ml，對照管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%冰醋酸1 ml代替試劑三。離心管蓋上蓋子，用針在蓋子上扎1個小孔，振蕩混勻器混勻，95 ℃水浴40 min，取出后冷卻，3 500 r/min離心10 min，取上清。蒸餾水調(diào)零，532 nm處測定各管吸光度(A)值后計算其含量。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.5SOD、CAT、GSH-Px測定試劑盒檢測視網(wǎng)膜中SOD、CAT和GSH-Px活性 取1.2.4已制備好的上清液待用。(1)SOD活性檢測 在對照孔、對照空白孔、測定孔及測定空白孔依次加入待測勻漿上清、蒸餾水、酶工作液、酶稀釋液及底物應(yīng)用液各20 μl，混勻，37 ℃孵育20 min，450 nm處酶標(biāo)儀上讀取A值，計算SOD抑制率和SOD活性。SOD抑制率=(對照A值-測定A值)/對照A值；SOD活性[μmol/(s·mg)]=SOD抑制率/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)/60。(2)CAT活性檢測 取組織勻漿液50 μl加到測試管內(nèi)，對照管內(nèi)不加組織勻漿液，向2個管內(nèi)依次加入試劑一1 ml和試劑二100 μl，混勻，37 ℃反應(yīng)60 s后依次加入試劑三1 ml和試劑四100 μl，對照管內(nèi)補加50 μl組織勻漿液，混勻。雙蒸水調(diào)零，測定各管波長405 nm處A值后計算CAT活性，CAT活性[μmol/(s·mg)]=(對照A值-測定A值)×271/60。(3)GSH-Px活性檢測 酶管與非酶管內(nèi)各加1 mmol/L GSH溶液200 μl，然后酶管內(nèi)再加200 μl組織勻漿液?；靹?，37 ℃水浴5 min。加入試劑一應(yīng)用液100 μl，37 ℃水浴反應(yīng)5 min。加入試劑二應(yīng)用液2 ml終止反應(yīng)，非酶管內(nèi)補加200 μl組織勻漿液，混勻，3 500 r/min離心10 min。分別向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管中加入GSH標(biāo)準(zhǔn)品溶劑應(yīng)用液、20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液1 ml，向非酶管和酶管中各加入上清液1 ml，向各管中依次加入試劑三、四、五進(jìn)行顯色反應(yīng)?；靹?，室溫下靜置15 min。蒸餾水調(diào)零，測定各管波長412 nm處A值。GSH-Px抑制率=(非酶管A值-酶管A值)/非酶管A值×100%，抑制率在45%或50%左右為最佳取樣濃度。GSH-Px活力[μmol/(s·mg)]=標(biāo)準(zhǔn)管濃度×取樣量×樣本蛋白含量(mgprot/ml)/60。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6Western blot法檢測視網(wǎng)膜中SOD、CAT蛋白相對表達(dá)量 取新鮮視網(wǎng)膜組織，用RIPA總蛋白裂解液提取視網(wǎng)膜總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度并調(diào)平。各組分別取等量蛋白用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(CAT：1∶ 2 000；SOD：1∶ 1 000；GAPDH：1∶ 10 000)，于4 ℃孵育過夜。次日棄去一抗，加入二抗(1:10 000)，室溫下封閉1 h，滴加ECL液曝光顯影，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片。以GAPDH為內(nèi)參，計算各蛋白相對表達(dá)量。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件(美國SPSS公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。采用隨機分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計。不同照射時間組視網(wǎng)膜中MDA濃度，SOD、CAT和GSH-Px活性，SOD和CAT蛋白相對表達(dá)量的總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同照射時間對視網(wǎng)膜組織形態(tài)的影響

對照組和照射10 min組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列均規(guī)則有序，界限清晰，視網(wǎng)膜整體結(jié)構(gòu)較正常。照射20 min組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)輕度水腫，光感受器細(xì)胞層排列偶見疏松，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞質(zhì)淡染。照射30 min組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)明顯水腫，細(xì)胞整體淡染，光感受器細(xì)胞層排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)纖維層輕度增生。照射40 min組視網(wǎng)膜光感受器層和色素上皮層分離，光感受器層細(xì)胞水腫，細(xì)胞質(zhì)淡染，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞消失，神經(jīng)纖維顯著增生，神經(jīng)纖維層厚度增加，可見內(nèi)界膜脫落(圖1)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察不同照射時間對視網(wǎng)膜組織形態(tài)的影響(HE ×200，標(biāo)尺=100 μm) A：對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列規(guī)則有序，界限清晰，視網(wǎng)膜整體結(jié)構(gòu)較正常 B：照射10 min組與對照組表現(xiàn)類似 C：照射20 min組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)輕度水腫，光感受器細(xì)胞層排列偶見疏松(綠色箭頭)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞質(zhì)淡染(黑色箭頭) D：照射30 min組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)明顯水腫，細(xì)胞整體淡染，光感受器細(xì)胞層排列紊亂(綠色箭頭)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量減少(黑色箭頭)，神經(jīng)纖維層輕度增生(紅色箭頭) E：照射40 min組視網(wǎng)膜光感受器層和色素上皮層分離，光感受器層細(xì)胞水腫，細(xì)胞質(zhì)淡染(綠色箭頭)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞消失(黑色箭頭)，神經(jīng)纖維顯著增生，神經(jīng)纖維層厚度增加(紅色箭頭)，內(nèi)界膜脫落(黃色箭頭)

2.2 不同照射時間對視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響

對照組光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤層狀結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，排列整齊；光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴結(jié)構(gòu)連續(xù)，呈長橢圓形，細(xì)胞核染色均勻，核膜結(jié)構(gòu)完整，與細(xì)胞質(zhì)界限清晰，形態(tài)規(guī)則。照射10 min組與對照組相比無明顯變化。照射20 min組視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤層狀結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，排列整齊，少量外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)溶解，層次結(jié)構(gòu)消失；部分內(nèi)節(jié)線粒體嵴結(jié)構(gòu)溶解，模糊，不連續(xù)。照射30 min組部分視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤層狀結(jié)構(gòu)解離，空泡化，紊亂呈髓樣結(jié)構(gòu)；部分線粒體嵴結(jié)構(gòu)溶解、模糊，形成髓樣小體。照射40 min組視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)細(xì)胞減少、稀疏，細(xì)胞間隙較大；內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失，形成空泡化(圖2)。

圖2 電子顯微鏡下觀察不同照射時間對視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞外節(jié)和內(nèi)節(jié)超微結(jié)構(gòu)的影響(醋酸鈾-檸檬酸鉛 ×5 000，標(biāo)尺=1 μm) A：對照組光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤層狀結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，排列整齊 B：照射10 min組光感受器細(xì)胞外節(jié)表現(xiàn)與對照組類似 C：照射20 min組視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞可見少量外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)溶解，層次結(jié)構(gòu)消失(紅色箭頭) D：照射30 min組部分視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤層狀結(jié)構(gòu)解離、空泡化、紊亂，呈髓樣結(jié)構(gòu)(紅色箭頭) E：照射40 min組視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)細(xì)胞減少、稀疏，細(xì)胞間隙較大(紅色箭頭) F：對照組光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴結(jié)構(gòu)連續(xù)，呈長橢圓形，細(xì)胞核染色均勻，核膜結(jié)構(gòu)完整，與細(xì)胞質(zhì)界限清晰，形態(tài)規(guī)則 G：照射10 min組光感受器內(nèi)節(jié)表現(xiàn)與對照組類似 H：照射20 min組光感受器內(nèi)節(jié)部分線粒體嵴結(jié)構(gòu)溶解、模糊、不連續(xù)(黃色箭頭) I：照射30 min組部分線粒體嵴結(jié)構(gòu)溶解、模糊，形成髓樣小體(黃色箭頭) J：照射40 min組光感受器內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失，形成空泡化(黃色箭頭)

2.3 不同照射時間對視網(wǎng)膜組織中MDA濃度的影響

隨著照射時間的延長，各組視網(wǎng)膜組織中MDA濃度逐漸升高，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.25，P<0.05)，其中照射20 min、30 min和40 min組MDA濃度明顯高于對照組，照射20 min、30 min和40 min組MDA濃度依次升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

2.4 不同照射時間對視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT和GSH-Px活性的影響

隨著照射時間的延長，各組視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT和GSH-Px活性逐漸降低，總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.09、34.18、35.60，均P<0.05)，其中照射20 min、30 min、40 min組SOD、CAT和GSH-Px活性明顯低于對照組，照射20 min、30 min、40 min組SOD、CAT和GSH-Px活性依次降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

2.5 不同照射時間對視網(wǎng)膜組織中SOD和CAT蛋白相對表達(dá)量的影響

隨著照射時間的延長，各組視網(wǎng)膜組織中SOD和CAT蛋白相對表達(dá)量逐漸降低，總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=115.75、78.86，均P<0.05)，其中照射20 min、30 min、40 min組SOD和CAT蛋白相對表達(dá)量明顯低于對照組，照射20 min、30 min、40 min組SOD和CAT蛋白相對表達(dá)量依次降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3，表2)。

表1 各組兔眼視網(wǎng)膜組織中MDA濃度及SOD、CAT、GSH-Px活性比較(mean±SD)Table 1 Comparison of MDA concentration and SOD,CAT,GSH-Px activities in retinal tissues of rabbits among different groups (mean±SD)組別樣本量MDA濃度(nmol/mgprot)SOD活性[μmol/(s·mg)]CAT活性[μmol/(s·mg)]GSH-Px活性[μmol/(s·mg)]對照組31.13±0.020.25±0.030.11±0.013.00±0.29照射10min組34.13±1.210.25±0.010.11±0.022.81±0.39照射20min組311.31±1.84a0.19±0.03a0.07±0.01a2.13±0.15a照射30min組314.94±1.04ab0.13±0.01ab0.06±0.01ab1.67±0.12ab照射40min組318.25±1.42abc0.08±0.01abc0.04±0.01abc0.92±0.17abcF值65.2544.0934.1835.60P值<0.05<0.05<0.05<0.05 注:與各自對照組比較,aP<0.05;與各自照射20min組比較,bP<0.05;與各自照射30min組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) MDA:丙二醛;SOD:超氧化物歧化酶;CAT:過氧化氫酶;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶 Note:Compared with the respective control group,aP<0.05;compared with the respective 20 minutes irradiation group,bP<0.05;compared with the respective 30minutes irradiation group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) MDA:malondialdehyde;SOD:superoxide dismutase;CAT:catalase;GSH-Px:glutathione peroxidase

圖3 Western blot法檢測各組視網(wǎng)膜組織中SOD和CAT蛋白表達(dá)電泳圖 隨著照射時間的延長，各組視網(wǎng)膜組織中SOD和CAT蛋白表達(dá)條帶逐漸減弱 1：對照組；2：照射10 min組；3：照射20 min組；4：照射30 min組；5：照射40 min組 CAT：過氧化氫酶；SOD：超氧化物歧化酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表2 各組兔眼視網(wǎng)膜組織中SOD和CAT蛋白相對表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of relative expression levels of SOD and CAT proteins in retina of rabbits among different groups (mean±SD) 組別樣本量SOD蛋白相對表達(dá)量CAT蛋白相對表達(dá)量對照組31.82±0.143.82±0.14照射10min組31.64±0.083.50±0.49照射20min組31.23±0.11a1.93±0.11a照射30min組30.79±0.06ab0.94±0.13ab照射40min組30.08±0.02abc0.29±0.09abcF值115.7578.86P值<0.05<0.05 注:與各自對照組比較,aP<0.05;與各自照射20min組比較,bP<0.05;與各自照射30min組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) SOD:超氧化物歧化酶;CAT:過氧化氫酶 Note:Compared with the respective control group,aP<0.05;compared with the respective 20 minutes irradiation group,bP<0.05;compared with the re-spective 30 minutes irradiation group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SOD:superoxide dismutase;CAT:catalase

3 討論

關(guān)于鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)安全性的研究相對較少，Zhang等[10]用3 mW/cm2的紫外線照射兔眼不同的時間，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)照射時間在40 min以內(nèi)不會對視網(wǎng)膜造成損傷，照射時間過長可引起視網(wǎng)膜損傷。本實驗中未選用3 mW/cm2的能量照射，而是采用10 mW/cm2的能量照射，因為根據(jù)本生羅斯科互易律，照射能量和照射時間的乘積相等，其光化學(xué)反應(yīng)是等價的，膠原交聯(lián)效果與組織吸收的總能量成正比[11-12]，通過增加紫外線的能量密度，減少照射時間可以加速交聯(lián)反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，從照射20 min開始，視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)改變，這與Zhang等[10]對鞏膜膠原交聯(lián)安全性研究的結(jié)果一致，均證明了照射時間過長可引起視網(wǎng)膜損傷。本實驗通過電子顯微鏡觀察同樣發(fā)現(xiàn)，從照射20 min開始，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞外節(jié)和內(nèi)節(jié)均逐漸發(fā)生改變，照射10 min組視網(wǎng)膜組織在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下均未出現(xiàn)明顯的組織結(jié)構(gòu)變化，因此本實驗通過組織病理學(xué)觀察得出核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射10 min是安全的。

視網(wǎng)膜的光損傷分為機械損傷、熱損傷和光化學(xué)損傷[13]。光化學(xué)損傷機制主要包括自由基和脂質(zhì)過氧化損傷、鈣離子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白及細(xì)胞凋亡機制[14-17]。紫外線照射時會產(chǎn)生大量活性氧自由基[18-19]，活性氧自由基可直接損傷DNA，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也可攻擊蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)功能受損，還可以與生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)的破壞。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物為MDA，通常MDA的濃度可以反映視網(wǎng)膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，提示視網(wǎng)膜的損傷程度。本研究結(jié)果表明，核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射20 min后視網(wǎng)膜中MDA濃度升高，說明視網(wǎng)膜中產(chǎn)生大量活性氧自由基，脂質(zhì)過氧化水平升高，視網(wǎng)膜出現(xiàn)損傷。在以往的實驗研究中，Wang等[20]用核黃素-紫外線(365 nm，3.0 mW/cm2)照射兔眼30 min，通過TUNEL染色分析發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜層凋亡細(xì)胞，由此也可猜測膠原交聯(lián)治療過程中細(xì)胞的凋亡可能是由細(xì)胞氧化損傷引起。

生理狀態(tài)下，視網(wǎng)膜中存在清除自由基的抗氧化防御系統(tǒng)包括酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)，SOD、GSH-Px和CAT作為主要的酶類抗氧化物質(zhì)可保護(hù)視網(wǎng)膜免受氧化損傷[21]，其中SOD可將O2-分解為H2O2，而GSH-Px、CAT又能分解SOD催化產(chǎn)生的H2O2和其他來源的H2O2，它們與體內(nèi)的自由基處于動態(tài)平衡。本實驗將SOD、CAT、GSH-Px作為觀察指標(biāo)，結(jié)果顯示從核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射20 min開始，SOD、CAT、GSH-Px活性和SOD、CAT蛋白相對表達(dá)量隨照射時間延長均逐漸下降，說明此時視網(wǎng)膜內(nèi)產(chǎn)生了過多活性氧自由基，大量消耗了視網(wǎng)膜中抗氧化物質(zhì)同時使其失活，視網(wǎng)膜內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)間的相對平衡受到破壞，視網(wǎng)膜發(fā)生氧化損傷，這與檢測MDA濃度得到的結(jié)論一致。核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射10 min組MDA濃度，SOD、CAT活性和相對表達(dá)量,以及GSH-Px活性與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明此時視網(wǎng)膜組織氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，膠原交聯(lián)術(shù)并未對視網(wǎng)膜造成損傷。因此從視網(wǎng)膜組織氧化和抗氧化角度同樣認(rèn)為核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射10 min是安全的，照射20 min會對視網(wǎng)膜造成損傷。另外，根據(jù)本生羅斯科互易律和以往實驗證明，總能量為5.4 J/cm2的核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射可增強鞏膜生物力學(xué)強度[11-12,22]。本實驗照射10 min組總能量為6.0 J/cm2，結(jié)果顯示核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射10 min是安全的，推測其還可增強鞏膜生物力學(xué)強度，但其影響及機制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明10 mW/cm2核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)照射10 min是安全的，照射時間過長可引起視網(wǎng)膜的損傷。本研究在病理組織學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了視網(wǎng)膜抗氧化能力的變化，從而為核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)，但核黃素-紫外線A鞏膜膠原交聯(lián)術(shù)對視網(wǎng)膜功能的影響還有待進(jìn)一步研究。

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