體外純化方法對(duì)脂肪顆粒細(xì)胞活性的影響

趙玉坤,于冬梅,羅 賽,刁志勇,呂遠(yuǎn)東,郝立君

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實(shí)驗(yàn)研究

體外純化方法對(duì)脂肪顆粒細(xì)胞活性的影響

趙玉坤,于冬梅,羅 賽,刁志勇,呂遠(yuǎn)東,郝立君

目的 探討純化方法對(duì)自體脂肪移植存活率的影響。方法 抽取10例腹部吸脂患者的脂肪顆粒，按不同離心速度和時(shí)間分組純化，通過組織形態(tài)學(xué)觀察、葡萄糖轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)等對(duì)比脂肪顆粒細(xì)胞活性的體外差異，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察植入后脂肪組織體積、質(zhì)量的變化。結(jié)果 在離體情況下，離心對(duì)脂肪細(xì)胞的活性有影響；而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各組在移植物殘留體積和質(zhì)量上的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 離心純化方法在降低純化脂肪的時(shí)間、提高純化效率方面優(yōu)于靜置純化方法，且對(duì)體內(nèi)存活率無明顯影響，臨床上值得推廣。

脂肪移植； 細(xì)胞活性； 體外純化； 葡萄糖轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)； 離心

近年來，自體脂肪移植在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用較廣泛，關(guān)注術(shù)中每一個(gè)步驟以提高移植后脂肪的存活率一直是學(xué)者們討論的熱點(diǎn)[1-6]。脂肪的純化是脂肪移植術(shù)中重要的步驟，學(xué)者們采用的純化方法并不一致。目前最常用的是靜置法和離心法，自2014 年5月至 2014年 12月，筆者比較了2種方法的體內(nèi)和體外差異，以期指導(dǎo)純化方法在臨床中的選擇及應(yīng)用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)療美容科行腹部脂肪抽吸術(shù)患者的脂肪標(biāo)本，共 10例，均為女性;年齡 35～42歲。均獲得患者的知情同意。

1.2 脂肪抽吸與分組 常規(guī)活力碘消毒，鋪巾。在下腹部抽吸區(qū)域同條件抽吸脂肪顆粒細(xì)胞。抽吸后針頭向下靜置10 min，緩慢向下推出下層腫脹液體。用生理鹽水漂洗3次。等量分5組：A組靜置30 min、B組1000 r/min離心2 min、C組3000 r/min離心2 min、D組2000 r/min離心1 min、E組2000 r/min離心5 min。分組處理后留取中間飽滿顆粒脂肪層。

1.3 計(jì)數(shù)完整脂肪細(xì)胞百分比 顯微鏡下選取脂肪組織完整的部位，在高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)500個(gè)脂肪細(xì)胞。

1.4 組織形態(tài)觀察 每組脂肪組織分別經(jīng)OCT包埋后，制作冰凍切片，用顯微鏡觀察組織形態(tài)差異。

1.5 葡萄糖轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脂肪細(xì)胞活性 同條件獲取脂肪顆粒300 ml，分組純化后留中層脂肪顆粒為樣本，每組樣本攪勻，分別注射入8個(gè)無菌培養(yǎng)皿中，每皿5 ml，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10 ml含糖(15 mmol/L)無血清的DMEM，加1 U胰島素，同時(shí)設(shè)4個(gè)空白標(biāo)本(含糖無血清DMEM，不含脂肪顆粒)，共計(jì)12個(gè)培養(yǎng)皿。搖勻后置入37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，1 h后取下層清液，用生化分析儀測(cè)定其中葡萄糖的濃度，并與空白對(duì)照組比較，二者的差值即是每個(gè)標(biāo)本內(nèi)顆粒脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)移量，葡萄糖轉(zhuǎn)移量的多少代表此標(biāo)本內(nèi)脂肪細(xì)胞活性的高低。4個(gè)空白標(biāo)本的平均葡萄糖濃度為基礎(chǔ)濃度,基礎(chǔ)濃度與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本葡萄糖濃度的差值為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本葡萄糖轉(zhuǎn)移量[7]。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雌性Wistar大鼠18只，體質(zhì)量(200±20) g，月齡2.5個(gè)月。由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。取大鼠腹股溝皮下脂肪按“1.2”中A組靜置30 min、C組3000 r/min離心2 min、E組2000 r/min離心5 min處理后，分別注入大鼠背部皮下1 ml，每組6只,標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。常規(guī)飼養(yǎng)12周后處死。取出移植物測(cè)量質(zhì)量和體積。

2 結(jié)果

2.1 完整脂肪細(xì)胞百分比 各組完整脂肪細(xì)胞百分比見表1，經(jīng)方差分析F=2.01，P=0.1093，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組完整脂肪細(xì)胞百分比Tab 1 Percentage of intact lipocytes in each group

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 A組：細(xì)胞壁完整，可見尚未發(fā)育成熟的脂肪細(xì)胞，細(xì)胞間纖維較多，脂肪細(xì)胞無變形(圖1a)；B組：細(xì)胞形態(tài)有擠壓、變形，細(xì)胞壁基本完好(圖1b)；C 組：細(xì)胞受擠壓較明顯，呈現(xiàn)細(xì)胞影，細(xì)胞壁有破潰(圖1c)；D 組：脂肪細(xì)胞基本完好，部分細(xì)胞壁受擠壓、有破裂(圖1d)；E組：部分細(xì)胞壁明顯受擠壓、有破裂，可見細(xì)胞融合(圖1e)。

圖1 各組脂肪細(xì)胞組織學(xué)形態(tài)(HE ×400) a.A組 b.B組c.C組 d.D組 e.E組
Fig 1 Histological morphology of adipose tissue in each group (HE ×400). a.group A. b.group B. c.group C. d.group D. e.group E.

2.3 葡萄糖轉(zhuǎn)移量 各組葡萄糖轉(zhuǎn)移量見表2。經(jīng)方差分析F=47.46，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SNK兩兩比較顯示，除了C組和E組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組葡萄糖轉(zhuǎn)移量Tab 2 Glucose transfer in each group

注：a,b,c,d字母相同表示兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.4 移植物殘留體積和質(zhì)量 各組移植物殘留體積方差分析結(jié)果為F=0.11，P=0.9008，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組移植物殘留質(zhì)量方差分析結(jié)果為F=0.12，P=0.8909，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 各組移植物殘留體積和質(zhì)量Tab 3 Residual volume and mass of graft in each group ±s

3 討論

近年來已有文獻(xiàn)報(bào)道，脂肪顆粒細(xì)胞移植后估計(jì)有最高達(dá)70%的脂肪被吸收[3]。重視術(shù)中的任何一個(gè)步驟都有可能提高移植后脂肪的存活率。而體外純化脂肪顆粒細(xì)胞是移植脂肪術(shù)中的必要步驟，目前的方法也并不統(tǒng)一。有學(xué)者采用靜置法，認(rèn)為此種方法不會(huì)破壞脂肪細(xì)胞的活性，但很難完全析出混雜的血液、麻醉液、組織間液、破碎脂肪及纖維組織碎塊等，且純化效率低；有學(xué)者采用離心法，認(rèn)為離心可以提高純化效率，析出雜質(zhì)較完全，可以得到高純度的脂肪顆粒，但是，速度大于600 r/min的離心便會(huì)降低脂肪細(xì)胞活性，學(xué)者們選擇的離心速度與時(shí)間也是各有不同[1-2,8-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)比較靜置與離心純化后的脂肪顆粒細(xì)胞活性及動(dòng)物體內(nèi)存活情況是有必要意義的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，完整脂肪細(xì)胞百分比各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示離心速度與時(shí)間對(duì)脂肪細(xì)胞完整性并無明顯影響(轉(zhuǎn)速過大、時(shí)間過長(zhǎng)的情況除外)。鏡下組織學(xué)切片觀察可見，高的離心速度(C組)和長(zhǎng)的離心時(shí)間(E組)與較低的速度(B組)和較短的離心時(shí)間(D組)相比，在脂肪細(xì)胞擠壓變形上還是有組織學(xué)差異的，前者脂肪細(xì)胞壁受壓情況要更加明顯一些(圖1b～e)。同樣可觀察到各離心純化組較靜置組的脂肪細(xì)胞均有不同程度的變形。

葡萄糖轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，離心純化后脂肪顆粒的葡萄糖轉(zhuǎn)移量隨著速度和時(shí)間的增加而降低，并且均低于靜置組，說明離心的確會(huì)降低脂肪顆粒的活性，且速度和時(shí)間越大，對(duì)其活性的影響會(huì)越大(適當(dāng)范圍內(nèi))。

近年來，又有學(xué)者提倡靜置保留適當(dāng)?shù)难撼煞?，認(rèn)為其中可能含有的生長(zhǎng)因子及相關(guān)成分將有利于移植后脂肪的存活。因此為比較降低活性的脂肪顆粒細(xì)胞在移植后的存活率是否會(huì)明顯低于靜置組脂肪細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)又設(shè)計(jì)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示游離脂肪顆粒在移植入大鼠體內(nèi)12周后，無論是體積還是質(zhì)量上，3組并沒有明顯區(qū)別。分析其原因，不排除植入體內(nèi)后的脂肪細(xì)胞活性可能復(fù)蘇，由于植入體內(nèi)的脂肪顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸受體內(nèi)病理生理、免疫、分子生物等多種因素的影響，脂肪顆粒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和存活情況異常復(fù)雜[10-12]。即使在體外實(shí)驗(yàn)中脂肪顆粒細(xì)胞的活性受到了影響，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中受影響的脂肪顆粒細(xì)胞在存活情況上并沒有表現(xiàn)出明顯劣勢(shì)，而臨床上最終觀察的指標(biāo)是脂肪細(xì)胞在體內(nèi)存活的情況。

筆者認(rèn)為，離心純化雖然在體外條件下會(huì)降低脂肪顆粒細(xì)胞的活性，但其體內(nèi)存活率并不低于靜置情況，就純化效率和時(shí)間成本來講，離心可以大大縮短純化脂肪的時(shí)間，提高純化效率；但就純化成本而言，由于離心機(jī)及耗材的使用也將增加臨床的經(jīng)濟(jì)投入。故本實(shí)驗(yàn)旨在為臨床上選擇純化方法提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而兩種方法的移植脂肪遠(yuǎn)期存活情況有無區(qū)別仍需進(jìn)一步探究。

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Effects of purification methods on the cytoactive factors of lipochondria in vitro

ZHAOYu-kun,YUDong-mei,LUOSai,DIAOZhi-yong,LYUYuan-dong,HAOLi-jun.

(PlasticandCosmeticDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

HAOLi-jun,Email:lijunhao368@163.com

Objective To investigate the effects of purification methods on the survival rate of autologous fat grafting.Methods Lipochondria obtained from 10 patients undergoing abdominal liposuction were grouped and purified at different rotation speeds and times.The in vitro differences in cytoactive factors of the lipochondria were compared by histomorphological observation and glucose shift experiment and so on,and the changes in volume and weight of the postgrafted adipose tissues were observed by animal experiment.Results In vitro,centrifugation had significantly different effects on the activity of adipose cells,while the differences in volume and weight showed by laboratory animals in different groups were not statistically significant.Conclusion Centrifugal purification surpasses standing purification in decreasing the time for fat purification and elevating purification efficiency,but there is no effect on the survival rate in vivo.It is worthy of clinical application.

Fat graft; Cytoactive; Purification in vitro; Glucose transportation test; Centrifugation

150001 黑龍江 哈爾濱,哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心

趙玉坤(1983-),女，黑龍江勃利人，醫(yī)師，碩士.

郝立君，150001,哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心，電子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.018

R318;R-332

A

1673-7040(2016)06-0378-03

2016-02-05)