p-STAT3蛋白在增生性瘢痕中的表達及意義

李 允，田社民，查新建，魏 瑩，黃紅軍，肖宏濤，趙孝開

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實驗研究

p-STAT3蛋白在增生性瘢痕中的表達及意義

李 允，田社民，查新建，魏 瑩，黃紅軍，肖宏濤，趙孝開

目的 檢測JAK2/STAT3信號通路中STAT3蛋白在人增生性瘢痕中的表達，探討其在增生性瘢痕中的作用及意義。方法 采用免疫組織化學方法和Western blot檢測方法分別檢測32例增生性瘢痕和22例正常皮膚組織中p-STAT3的表達情況。結(jié)果 ⑴免疫組織化學檢測顯示,p-STAT3蛋白在增生性瘢痕及正常皮膚組織中均有表達，染色陽性物質(zhì)主要位于細胞質(zhì)，少部分位于細胞核，在表皮和真皮層均有表達，在增生性瘢痕組織中表達量均高于正常皮膚組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0)；⑵Western blot檢測結(jié)果顯示，增生性瘢痕中p-STAT3蛋白的表達均較正常皮膚高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 增生性瘢痕中p-STAT3呈現(xiàn)高表達，提示JAK2/STAT3信號通路異常激活可能在增生性瘢痕發(fā)生過程中起重要作用。

增生性瘢痕； JAK2/STAT3信號通路； p-STAT3

增生性瘢痕是皮膚組織燒創(chuàng)傷后,以膠原過度沉積、血管增生為特征的皮膚纖維化疾病。JAK2/STAT3是一條較新且最近研究最多的通路之一，其參與機體多種組織器官的細胞增殖、纖維化、免疫功能改變等過程[1-2]。相關(guān)研究已經(jīng)證明，JAK2/STAT3 通路與多種組織器官纖維化的關(guān)系密切[3]。目前，JAK2/STAT3信號通路在增生性瘢痕中的作用尚未報道。自2013年3月至2015年2月，鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷科以增生性瘢痕為研究對象,探討JAK2/STAT3信號通路在增生性瘢痕中的作用。

1 對象與方法

1.1 主要試劑 Western blot 化學發(fā)光檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；p-STAT3 單克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)；免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑(福建邁新生物公司)。

1.2 標本來源 增生性瘢痕入院行整形手術(shù)的患者32例，男性17例,女性15例;年齡1～42歲。術(shù)前均未行其他治療，不伴有潰瘍等病變，均為增生期瘢痕。 取材部位：上肢14例,軀干4例，面頸部6例,下肢8例。正常皮膚22例，為患者手術(shù)時取皮修剪后的殘余皮片。所有患者均簽署知情同意書；且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.3 標本采集及處理 標本取材后，分為2份，1份標本經(jīng)固定，脫水,透明，包埋后制成石蠟塊，行3 μm切片用于免疫組化染色。另外1份保存于液氮，用于Western blot檢測。

1.4 標本的免疫組織化學染色 免疫組織化學法檢測參照試劑盒說明書進行。石蠟切片脫蠟、水化及抗原修復后,PBS沖洗3次,3 min/次,1%BSA室溫封閉20 min，加一抗，4℃冰箱過夜(p-STAT3抗體稀釋濃度為1∶200)，二抗室溫下孵育20 min，滴加DAB，蘇木素復染3 min,流水稍沖洗，鹽酸乙醇分化，梯度脫水透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗做陰性對照，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果，高倍光學顯微鏡下取5個觀察視野，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算各抗體蛋白面密度(陽性顆粒的總面積及光密度值，然后計算出單位面積的面密度值)[4]。

1.5 Western blot檢測p-STAT3蛋白的表達 常規(guī)提取組織蛋白，測定其濃度，各組加入20 μg蛋白樣本，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，400 mA電流轉(zhuǎn)膜120 min，5%牛血清白蛋白封閉2 h，1×TBST洗滌3次，10 min/次，加入一抗，4℃孵育過夜，二抗孵育1 h，1×TBST充分漂洗后用ECL試劑盒顯色。所有內(nèi)參對照均使用小鼠抗GAPDH(稀釋度為1∶5000)。所得圖像均用image lab軟件掃描作灰度分析 (目的蛋白/GAPDH的比值)。

2 結(jié)果

2.1 p-STAT3的免疫組織化學檢測結(jié)果 p-STAT3在增生性瘢痕組織 (圖1a)及正常皮膚組織 (圖1b) 中均有表達；光學顯微鏡下p-STAT3染色陽性物質(zhì)主要位于細胞漿，少部分位于胞核，為均勻棕黃色顆粒；在表皮細胞、真皮層成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞中均有表達；在增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中的蛋白表達量分別是0.29±0.01和0.15±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義(t=22.6，P<0.05)。

2.2 Western blot檢測結(jié)果 p-STAT3蛋白在增生性瘢痕及正常皮膚均有表達(圖2)，表達量分別為0.58±0.13和0.32±0.05，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.86，P<0.05)。

3 討論

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷后一種病理性的愈合結(jié)果，可出現(xiàn)瘙癢、疼痛、外觀改變，嚴重影響患者的日常生活和工作，目前康復期瘢痕增生的治療仍然比較棘手，增生性瘢痕形成機制的研究尚未獲得突破性的進展，因此，有必要進行進一步的研究[5-6]。

圖1 免疫組化檢測結(jié)果(SP ×200) a.增生性瘢痕 b.正常皮膚 圖2 Western blot檢測結(jié)果
Fig 1 Results of IHC (SP ×200). a.the hypertrophic scar.b.the normal skins. Fig 2 Results of Western blot.

Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)是一條由多種細胞因子和生長因子共同介導的信號通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等病理生理過程[7-9]。該信號通路主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、JAK 和STAT 組成[10]。研究顯示，JAK/STAT 信號通路在體內(nèi)不同組織及器官的纖維化進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。Pang等在小鼠腎間質(zhì)纖維化模型研究中發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3 信號通路激活可增加腎臟的炎癥細胞和纖維膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表達，并介導了腎間質(zhì)成纖維細胞的激活，加速腎纖維化進展[12]。Nieto[13]研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3 信號通路的異常激活可促使肝臟中Kupffer細胞分泌大量的IL-6，導致肝星狀細胞纖維化，而使用特異性抑制劑AG490 抑制該通路可以明顯抑制肝纖維化。在四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型中，抑制JAK/STAT3通路活性可減輕和抑制小鼠肝臟纖維化的形成[14]。國外學者在研究中發(fā)現(xiàn)，肺纖維化組織中存在著 JAK、STAT1 和 STAT3 的過度表達[15]。因此,JAK2 /STAT3 信號通路與組織器官的纖維化病理改變密切相關(guān)。

增生性瘢痕也是一種組織纖維化疾病，以成纖維細胞大量增殖、血管大量生成及膠原異常沉積為特征[5]。本研究中免疫組化和Western blot檢測結(jié)果均顯示，在增生性瘢痕中，STAT3蛋白的表達均比正常皮膚中高，且差異均具有統(tǒng)計學意義，提示STAT3與增生性瘢痕的形成存在一定的關(guān)聯(lián)，JAK2/STAT3信號通路的異常激活可能參與了增生性瘢痕的形成和發(fā)展，特異性阻斷JAK2/STAT3信號通路是否會達到抑制瘢痕增生的效果？我們下一步將在體內(nèi)和體外實驗中進一步研究該通路在增生性瘢痕發(fā)生中的作用，研究其具體作用機制，以期為增生性瘢痕的早期治療提供新的思路和靶點。

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Expression of STAT3 protein in hypertrophic scar and its significance

LIYun,TIANShe-min,ZHAXin-jian,WEIYing,HUANGHong-jun,XIAOHong-tao,ZHAOXiao-kai.

(DepartmentofBurnsandOrthopedics,ZhengzhouFirstPeople′sHospital,Zhengzhou450000,China)

Objective To investigate the expression of STAT3 protein of JAK2/STAT3 pathway in hypertrophic scars and its significance.Methods The expression of p-STAT3 in 32 cases of hypertrophic scar and 22 cases of normal skin were detected by immunohistochemistry (IHC) and Western blot.Results ⑴ IHC showed that p-STAT3 protein was expressed in both hypertrophic scar and normal skin.Normal skin tissue staining substances are mainly located in the cytoplasm,with a small part in the nucleus.The level of p-STAT3 protein in hypertrophic scars was higher than that in the normal skin,the difference had a statistical significance (P=0)； ⑵ Western blot showed that the expression of p-STAT3 in the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that in the normal human skins; the difference had a statistical significance (P<0.05).Conclusion The strong expressions of p-STAT3 in hypertrophic scars indicated that the abnormal activity of the JAK2/STAT3 pathway may play an important role in the occurrence of the hypertrophic scar.

Hypertrophic scar; JAK2/STAT3 pathway; p-STAT3

450000 河南 鄭州，鄭州市第一人民醫(yī)院 燒傷科

李 允(1979-)，男，河南鄭州人，主治醫(yī)師.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.017

R619.6

A

1673-7040(2016)06-0375-03

2016-01-21)